本发明涉及一种电化学生物传感器，具体为基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器的制备方法与应用。
背景技术
电化学生物传感器是电化学分析方法与生物传感技术相结合的发展产物，由于具有操作性强、灵敏度高、响应快、检测成本低等优点，广泛应用于工农业生产、临床医学和环境监测等诸多领域；根据电极表面生物敏感原件的不同又可分为多种类型，而酶传感器（又称酶电极）是其中一个重要的分支。生物活性酶的固定化是酶传感器制备过程中的关键步骤，选择一种合适的固定材料是提高生物传感性能的关键因素之一。近年来纳米材料在生物传感器领域的应用受到人们广泛的关注。
纳米金刚石（nanodiamond，nd）也称为超细金刚石或超分散金刚石，平均粒径为纳米量级。它兼有金刚石、纳米材料的特性，例如高硬度、高耐腐蚀性、高热导率、低摩擦系数、低表面粗糙度和高的表面活性等。根据其存在形式，纳米金刚石可以分为单分散的纳米金刚石粒子和纳米金刚石薄膜两类；纳米金刚石粒子可以看作由块材金刚石切割出的纳米尺寸的金刚石团簇；纳米金刚石膜可以看成是晶粒尺寸极度细小的多晶金刚石。纳米尺寸的金刚石具备大比表面积、表面多官能团以及在水溶液或非水溶液中良好的电化学性能（如宽电势窗口、低背景电流等），通过亲水或疏水作用、静电力等实现对小分子以及生物大分子的吸附，从而成为电分析、电催化、光电化学和生物电化学等领域中极具潜力的电极材料，并应用于废水处理、电分析检测、生物传感器等方面。
三氯乙酸（tca）是有机卤素环境污染物之一，但是其常被应用于农业和公共安全领域，也常存在于用次氯酸消毒过的饮用水中。对三氯乙酸的毒理学研究表明，它能够导致生物体内的肺肿瘤，也可以造成癌症和影响人类生殖功能。过氧化氢（h2o2）为无色透明液体，是一种强氧化剂，可与水以任意比例混合，其水溶液常用于医用伤口消毒及环境消毒和食品消毒。纯过氧化氢是淡蓝色的粘稠液体，具有爆炸性，而高浓度过氧化氢有强烈的腐蚀性。吸入该品蒸气或雾对呼吸道有强烈刺激性，眼直接接触液体可致不可逆损伤甚至失明。亚硝酸钠（nano2）是一种无机盐，易潮解，易溶于水，接触有机物易燃烧爆炸。由于其具有咸味且价格低廉，常在非法食品制作时用作食盐的不合理替代品，但其毒性对人体危害很大，且有致癌性。
综上，本发明基于纳米金刚石具有极大的比表面积，表面具有较多的结构缺陷，无需掺杂就已经具有较高的导电性等特性，将其引入电化学传感领域，做为电极材料应用于制备电化学酶传感器，实现传感器性能的大幅度提升，并对三氯乙酸、过氧化氢和亚硝酸钠这三种物质均能快速且准确检测的目的。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供了基于一种纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器的制备方法与应用，所制备的传感器对三氯乙酸、过氧化氢和亚硝酸钠的电催化还原效果良好，可以应用于检测这三种物质在目标物中含量，具有线性范围宽、检测限低、灵敏度高的优点。
本发明采用的技术手段如下：
基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器的制备方法与应用，具体包括以下步骤：
（1）称取质量为1.0~2.0g石墨粉与0.5~1.0gn-己基吡啶六氟磷酸盐（离子液体）于研钵中充分研磨使混合均匀，将其填入玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极（cile）；
（2）取6~8μl0.5~2.0mg/ml纳米金刚石（nd）分散液滴涂在cile表面，室温条件下自然晾干，得到nd/cile；
（3）取8~10μl10~20mg/mlmb溶液滴涂在nd/cile表面，在室温下自然晾干，得到mb/nd/cile；
（4）取4~6μl0.3~0.7%nafion乙醇溶液滴涂在mb/nd/cile表面，室温下晾干后，即得到nafion/mb/nd/cile。
所述（1）步骤中，石墨粉用量与离子液体用量的质量比为2：1。
所述（1）步骤中，研磨时间为2~3h。
所述（1）步骤中，所述玻璃电极管内径为4mm。
所述（2）步骤中，纳米金刚石分散液浓度为0.5mg/ml。
所述（2）步骤中，纳米金刚石分散液滴涂体积为8μl。
所述（3）步骤中，mb溶液浓度为15mg/ml。
所述（3）步骤中，mb溶液滴涂体积为8μl。
所述（4）步骤中，nafion乙醇溶液的体积浓度为0.5%。
所述（4）步骤中，nafion乙醇溶液滴涂的体积为6μl。
所述的基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器应用于电催化还原三氯乙酸、过氧化氢和亚硝酸钠。
所述的基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器应用于对三氯乙酸的检测。
所述的基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器应用于对过氧化氢的检测。
所述的基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器应用于对亚硝酸钠的检测。
所述的基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器的检测环境为在ph2.0的磷酸盐缓冲溶液中。
本发明中，离子液体为n-己基吡啶六氟磷酸盐（hppf6），cile为碳离子液体电极，nd为纳米金刚石，mb为肌红蛋白，nafion为全氟磺酸，tca为三氯乙酸，nano2为亚硝酸钠，h2o2为过氧化氢，pbs缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。
本发明将一定比例的离子液体和石墨粉混合均匀，制备成碳离子液体电极（cile），并将纳米金刚石（nd）修饰于cile之上，构建了基于纳米金刚石修饰材料界面上的肌红蛋白电化学酶传感器。纳米金刚石大多为单晶，形貌呈规则的球形或类球形，其中存在着微米和亚微米尺寸的团聚体，有的团聚体还具有菱形或球形结构，通过扫描电子显微镜（sem）对其进行了形貌与结构表征。运用光谱分析法考察mb与nd混合后是否发生变性；运用电化学分析法考察肌红蛋白在修饰电极上的直接电化学行为；以nafion/mb/nd/cile为工作电极应用于对三氯乙酸，过氧化氢和亚硝酸钠的电催化检测，结果均表明其具有良好的电催化性能。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用的纳米金刚石不仅具有宏观尺寸金刚石性能，还具有纳米材料的通性，如表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应等；其良好的化学稳定性，很适合用于制备电化学工作电极。较之传统的玻碳电极、铂电极、金电极等具有宽电势窗口、低背景电流、长期稳定性等优异的性能。
将纳米金刚石修饰于碳离子液体电极之上，提高了界面的比表面积，能够负载更多的mb生物大分子，为mb与电极间的电子转移提供快速通道，加快电子转移速率，实现mb的直接电化学；良好的化学稳定性使mb在修饰电极复合膜内仍保持良好的原始构象和生物活性，不发生变性。
该电化学酶传感器能够对三氯乙酸、过氧化氢和亚硝酸钠进行准确测定，测定的线性范围分别为1.1~30.0mmol/l、0.3~19.0mmol/l和0.02~6.60mmol/l，检出限分别为0.37mmol/l、0.13mmol/l和6.67μmol/l，具有线性范围宽、检出限低，灵敏度高等优点，其制备方法简单，易于实现，操作方便，稳定性好。
附图说明
图1纳米金刚石的扫描电子显微镜（sem）图。
图2(a)nd-mb在水溶液中的紫外光谱图，(b)mb在水溶液中的紫外光谱图。
图3为在铁氰化钾和氯化钾浓度分别为10.0mmol/l和0.1mol/l的混合溶液中不同修饰电极的电化学交流阻抗图，其中：
曲线a为实施例1中nafion/mb/nd/cile的交流阻抗图；
曲线b为对比例3中nafion/cile的交流阻抗图；
曲线c为对比例4中nd/cile的交流阻抗图；
曲线d为对比例1中nafion/mb/cile的交流阻抗图。
图4为不同修饰电极在ph=2.0的pbs缓冲溶液中，扫描速度为100mv/s的循环伏安图，其中：
曲线a为实施例1中nafion/mb/nd/cile的循环伏安曲线；
曲线b为对比例1中nafion/mb/cile的循环伏安曲线；
曲线c为对比例2中nafion/nd/cile的循环伏安曲线；
曲线d为对比例3中nafion/cile的循环伏安曲线。
图5为nafion/mb/nd/cile在不同扫描速度下的循环伏安图，从a到j扫速分别为0.05,0.15,0.25,0.35,0.45,0.55,0.65,0.75,0.85,0.95v/s。
图6为nafion/mb/nd/cile在不同ph的pbs缓冲溶液中的循环伏安曲线，a到g代表ph分别为：2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0。
图7为修饰电极在含不同浓度tca的ph=2.0pbs中的循环伏安曲线，a到m中tca浓度依次为1.1,2.0,3.5,5.0,6.5,8.0,10.0,12.0,15.0,18.0,22.0,26.0,30.0mmol/l。
图8为修饰电极在含不同浓度h2o2的ph=2.0pbs中的循环伏安曲线，a到l中h2o2浓度依次为0.3,1.0,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,19.0mmol/l。
图9为修饰电极在含不同浓度nano2的ph=2.0pbs中的循环伏安曲线，a到n中nano2浓度依次为0.02,0.10,0.40,0.80,1.30,1.80,2.40,3.00,3.60,4.20,4.80,5.40,6.00,6.60mmol/l。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
nafion/mb/nd/cile的制备方法，包括以下步骤：
（1）按照质量比2:1取石墨粉与离子液体（hppf6），即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6置于研钵中充分研磨2小时，得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作导线，得到碳离子液体电极；
每次进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
（2）取8μl0.5mg/ml纳米金刚石分散液滴涂在cile表面，室温条件下自然晾干，得到nd/cile；
（3）取8μl15mg/mlmb溶液滴涂在nd/cile表面，在室温下自然晾干，得到mb/nd/cile；
（4）取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在mb/nd/cile表面，室温下自然晾干后，即得到nafion/mb/nd/cile，制备完后用1000μl规格的移液枪枪头盖住，防止污染。
对比例1
nafion/mb/cile的制备方法，包括以下步骤：
（1）按照质量比2:1取石墨粉与离子液体（hppf6），即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6置于研钵中充分研磨2小时，得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极；
每次进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
（2）取8μl15mg/mlmb溶液滴涂在cile表面，在室温下自然晾干，得到mb/cile；
（3）取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在mb/cile表面，室温下晾干后，即得到nafion/mb/cile，制备完后用1000μl规格的移液枪枪头盖住，防止污染。
对比例2
nafion/nd/cile的制备方法，包括以下步骤：
（1）按照质量比2:1取石墨粉与离子液体（hppf6），即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6置于研钵中充分研磨2小时，得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极；
每次进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
（2）取8μl0.5mg/ml纳米金刚石分散液滴涂在cile表面，室温条件下自然晾干，得到nd/cile；
（3）取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在nd/cile表面，室温下晾干后，即得到nafion/nd/cile，制备完后用1000μl规格的移液枪枪头盖住，防止污染。
对比例3
nafion/cile的制备方法，包括以下步骤：
（1）按照质量比2:1取石墨粉与离子液体（hppf6），即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6置于研钵中充分研磨2小时，得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极；
进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
（2）取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在cile表面，室温下晾干后，即得到nafion/cile，制备完后用1000μl规格的移液枪枪头盖住，防止污染。
对比例4
nd/cile的制备方法，包括以下步骤：
（1）按照质量比2:1取石墨粉与离子液体（hppf6），即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6置于研钵中充分研磨2小时，得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极；
每次进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
取8μl0.5mg/ml纳米金刚石分散液滴涂在cile表面，室温条件下自然晾干，得到nd/cile，制备完后用规格为1000μl大小的移液枪枪头盖住，防止污染。
一、扫描电子显微镜
扫描电子显微镜，简称sem，通常应用于观察物体表面的微观形貌及结构特征。本文通过电镜记录了纳米金刚石的立体结构和形貌信息，从图1可以看出，纳米金刚石表现为较小的纳米颗粒并且团聚在一起形成类球状团簇。
二、紫外可见吸收光谱
紫外可见吸收光谱（uv-vis）是研究蛋白质是否发生构象变化的一种有效工具，如果蛋白质的结构发生改变或是变性，其三价铁的soret吸收带就会迁移或消失。根据图2可知，mb在水溶液的中的特征吸收峰在409.01nm附近，而mb和纳米金刚石混合物在水溶液中的特征吸收峰在409.05nm处，两者近似相同，可以认为特征吸收没有发生改变，即mb与纳米金刚石混合后并没有结构的改变和变性。
三、研究电化学交流阻抗图谱
电化学交流阻抗谱（eis）能够反应出电极界面修饰过程后的电阻变化行为信息，且电子转移电阻（ret）能通过在chi工作站软件中画出高频区域的半圆弧的直径求得；
本发明考察了不同修饰电极在10mmol/l[fe(cn)6]3-/4-和0.1mol/lkcl混合溶液中频率范围于105至0.1hz的电化学交流阻抗图谱，结果如图3所示。根据电化学交流阻抗法测量出的不同修饰电极的界面电阻值，反映出电极在被修饰后界面电阻大小的具体变化情况。实验结果表明，nd/cile的阻抗谱图中，其阻抗值最小，nafion/mb/cile的阻抗谱图中，阻抗值最大，表明mb的存在会阻碍铁氰化钾电子的传递，增大界面电子传递电阻；实施例1的nafion/mb/nd/cile的阻抗谱图中阻抗值比nafion/mb/cile明显减小，表明高导电性的纳米金刚石的存在能够有效的减小电子传递电阻。
四、研究mb直接电化学行为
研究了mb在ph=2.0的pbs缓冲溶液中，扫描速度为100mv/s时的直接电化学行为，结果如图4所示，从图中可以看出：
在曲线(d)nafion/cile（对比例3）和曲线(c)nafion/nd/cile（对比例2）上，没有任何氧化还原峰出现，即表明没有电活性物质存在于电极表面；
在曲线(b)nafion/mb/cile（对比例1）上，出现一对氧化还原峰，说明mb分子与cile之间的电子转移得以实现；
在曲线(a)nafion/mb/nd/cile（实施例1）上，氧化还原峰电流显著增大，说明在修饰了纳米金刚石后提升了mb和cile之间电子转移速率。这是因为它优良的小尺寸效应、量子尺寸效应以及大的比表面效应从而具有很强的表面活性，可吸附大量的蛋白质分子，有利于加快电子转移；
从曲线(a)上分别能读出氧化峰电位epa为-0.128v(vs.sce)，还原峰电位epc为-0.201v(vs.sce)，峰电位差（△ep）为73mv，式电位（e0′）为0.164v(vs.sce)，ipa/ipc接近1，表明为肌红蛋白分子内的电活性中心氧化还原电对（fe3+/fe2+）电化学行为的特征表现。
五、研究扫描速度对mb电化学信号的影响
探究了不同扫描速度对mb直接电化学行为的影响，结果如图5所示。当扫速在0.05~0.95v/s的区间内，随着扫速的增大峰电流值逐渐升高，峰电位发生了偏移；在此扫速范围内，循环伏安曲线均表现出一对对称性良好的氧化还原峰，说明mb在复合膜内的直接电化学行为是一个准可逆的电极反应过程。此外还发现e与lnʋ呈良好的线性关系，线性回归方程分别为epa（mv）=0.046•lnʋ（v/s）-0.081（n=9，γ=0.990）和epc（mv）=-0.046•lnʋ（v/s）-0.28（n=9，γ=0.996）。根据laviron理论，即准可逆薄层电化学过程的计算公式：
可推导得出反应转移电子数n=1.10，电子传递系数α=0.50；根据反应速率常数公式：
可计算出反应速率常数（ks）为1.10s-1。
扫描速度与峰电流值呈良好的线性关系，线性回归方程分别为ipa（µa）=-310.14•ʋ（v/s）-16.94（n=10，γ=0.994）和ipc（µa）=341.71•ʋ（v/s）+31.36（n=10，γ=0.994）；表明肌红蛋白在电极上的电化学行为属于吸附控制过程的薄层电化学行为。由公式q=nafγ*（q为电荷量，n为电极反应中的电子转移个数，a为电极的表观面积，f是法拉第常数，γ*为电活性物质在电极的表面覆盖度γ*），可以得到γ*为5.76×10-9mol/cm2，固定在修饰电极上的mb总浓度是5.72×10-8mol/cm2，实际参与电化学氧化还原反应的mb量与固定在电极表面的mb总量相比，得出mb参与反应的比例为10.07%。
六、研究ph对mb电化学信号响应的影响
本实验研究磷酸盐缓冲溶液的ph对实施例1的nafion/mb/nd/cile直接电化学行为的影响，结果如图6所示。随着缓冲溶液的ph增大，mb氧化还原峰电位均发生负方向移动。当ph在2.0~8.0范围内，mb的电化学行为是一个准可逆过程，反应的式电位（e0′）与ph值的大小呈良好的线性关系，线性回归方程为e0′（v）=-0.055•ph-0.043（n=5，γ=0.986），由方程斜率可知式电位随着一个单位的ph增加而加大-0.055v，稍小于298k温度条件下可逆体系中的理论值（-0.059v/ph）；因而推导判断出肌红蛋白在修饰电极上同时发生的是一个电子和一个质子转移过程，即：mbfe（ⅲ）+h++e-
七、nafion/mb/nd/cile对tca电催化行为的研究
研究本发明实施例1的nafion/mb/nd/cile在ph2.0的pbs缓冲溶液中电催化还原tca的催化效果，结果如图7所示。在-0.196v（vs.sce）处出现第一个还原峰，还原峰电流（ipc）随着tca浓度的增大而不断增大，且在-0.421v（vs.sce）处出现第二个还原峰，而氧化峰电流（ipa）则是慢慢减小直至消失。当tca在1.1~30.0mmol/l浓度范围内时，其浓度大小与ipc呈良好的线性关系，线性回归方程为ip(ma)=0.0086c（mmol/l）+0.022（n=8，γ=0.991），检测限为0.37mmol/l（3σ）；而当tca的浓度大于30.0mmol/l时，会出现一个平台，这是michaelis-menten动力学过程的典型特征。表观米氏常数(kmapp)是在酶催化反应中考察酶-底物反应动力学的重要指标，lineweaver-burk方程：
（iss指的是在加入底物后仍处在线性范围内的稳定电流，c指的是所加入底物的浓度，imax是指当tca浓度大于平台值30.0mmol/l时测得的最大电流值）作双倒数图（1/iss~1/[tca]），得到线性方程为：1/iss(ma)=51.79•1/c（mmol/l）+4.05(n=8，γ=0.994)；根据斜率即可求得表观米氏常数（kmapp）。计算得出nafion/mb/nd/cile对tca的催化反应kmapp值为12.78mmol/l。修饰电极对三氯乙酸表现出了良好的催化效果，因为nd大的比表面积和强的表面活性增加了参加电化学反应的mb的量，提升了电极的电催化性能。
八、nafion/mb/nd/cile对h2o2电催化行为的研究
向ph=2.0的pbs缓冲液加入不同浓度的h2o2，利用实施例1的nafion/mb/nd/cile进行循环伏安扫描。结果如图8所示，氧化峰电流值（ipa）随着h2o2浓度的增大而减小，还原峰电流值（ipc）则不断增大；当其浓度增大至14.0mmol/l时，氧化峰基本消失；ipc与h2o2浓度呈良好的线性关系；但h2o2浓度不宜太高，过高浓度的h2o2将会影响肌红蛋白的生物活性，破坏其原始构型。在0.3~19.0mmol/l范围内，还原峰电流值与h2o2浓度的线性回归方程为ip(ma)=0.014c（mmol/l）+0.013（n=10，γ=0.992），其检出限为0.13mmol/l（3σ）；通过双倒数图得到线性方程为：1/iss(ma)=48.14•1/c（mmol/l）+2.10（n=10，γ=0.998），计算得出电极对h2o2催化反应的kmapp值为43.62μmol/l。
九、nafion/mb/nd/cile对nano2电催化行为
向ph=2.0的pbs缓冲液加入不同量的nano2，对实施例1的nafion/mb/nd/cile进行循环伏安扫描，结果如图9所示。随着nano2的不断加入，在-0.515v（vs.sce）处出现了一个新的还原峰；氧化峰电流值（ipa）随着nano2浓度的增大而减小，还原峰电流值（ipc）则逐渐增大。当nano2的浓度增大到6.60mmol/l时，出现平台值，说明已达到稳定态电流。在0.02~6.60mmol/l范围内，还原峰电流值与nano2浓度之间的线性回归方程为ip(μa)=0.042c（μmol/l）+0.092（n=10，γ=0.991），其检出限为6.67μmol/l（3σ）；通过双倒数图得到线性回归方程为：1/iss(μa)=0.0075•1/c（μmol/l）+0.0018（n=10，γ=0.993），计算得出电极对nano2催化反应的kmapp值为4.17μmol/l。
综上所述，首先本发明制备出碳离子液体电极（cile），并将nd修饰于cile之上，成功构建了基于纳米金刚石修饰材料界面的肌红蛋白电化学酶传感器，mb在修饰电极复合膜内保持良好的生物活性；其次本发明采用分层法滴涂制备的nafion/mb/nd/cile表现出良好的可逆性与稳定性等电化学性能，实现了肌红蛋白与电极间的直接电化学；通过考察ph和扫描速度对mb直接电化学行为的影响，求解了相关电化学参数，如电子转移数（n）为1.10，电子传递系数（α）为0.50，反应速率常数（ks）为1.10s-1；最后本发明nafion/mb/nd/cile在应用于对三氯乙酸、过氧化氢和亚硝酸钠的电催化还原中效果良好，分别求解出其表观米氏常数为12.78mmol/l、43.62μmol/l和4.17μmol/l。因此本发明实现了制备出一种检测范围宽、检出限低、灵敏度高、电化学响应快速的基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器，并且达到了对三氯乙酸、亚硝酸钠和过氧化氢准确测定的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。。