卟啉化合物荧光分子的制备及其在检测过氧化氢和葡萄糖中的应用的制作方法

本发明属于化学合成技术领域，涉及一种卟啉化合物荧光分子的制备方法，基于合成绿色且产率较高的卟啉类化合物四磺酸基苯基卟啉（tpps4），并且利用其较强的荧光性这一特点，构建一种比较灵敏的“turn-off”型荧光传感器来检测过氧化氢和葡萄糖。

背景技术

近几年来，操作简便、价格低廉、检测限低、灵敏度较高的荧光技术被广泛应用于各类物质的检测，随着科技的发展，出现了利用荧光物质分子与溶剂或者溶质分子之间所发生的导致荧光下降或者消失的方法，即荧光猝灭“turn-off”。荧光猝灭过程实际上就是与发光过程相互竞争而缩短发光分子激发态的寿命过程，主要应用以下原理：1）能量转移机制；2）电荷转移机制。由于卟啉分子具有一定的光敏性质，在紫外或可见光作用下能有效释放单线态氧，所以卟啉分子被广泛应用与荧光检测中，因此选择荧光性能优良的分子和构建新颖的荧光传感器便成了刻不容缓的事。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种绿色无污染、产率高的卟啉类化合物（tpps4）荧光分子的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种用上述方法制备的荧光分子在检测过氧化氢和葡萄糖中的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种卟啉化合物荧光分子的制备方法，其特征在于，该制备方法具体按以下步骤进行：

1）将8ml吡咯溶于35ml丙酸中，得滴加液；

2）将250ml丙酸溶液油浴加热至微沸，再加入11ml苯甲醛，滴加步骤1）制得的滴加液，回流1h，停止滴加，冷却至室温，4℃温度下静置12h；抽滤，用无水乙醇洗涤至溶液无色，然后再用200ml热水洗涤，烘干，得样品；用硅胶柱层析纯化，旋蒸，烘干，制得5,10,15,20-四苯基卟啉；

3）将步骤2）制得的5,10,15,20-四苯基卟啉溶于氯仿中，滴加10ml浓硫酸，搅拌条件下加热至95℃，恒温回流4h，得到绿色澄清溶液，冷却至室温后，浸入50ml冰水中，得紫色溶液，过滤，除去硫酸钠晶体，旋干，滤液用甲醇过滤后，在80℃的温度下真空干燥8h，得粗产品，将该粗产品溶于甲醇中，搅拌的条件下加入丙醇，至出现沉淀，过滤，得紫色产品，再在搅拌的条件下将丙醇加入收集的滤液中，至出现沉淀，重复在滤液中加丙醇搅拌过滤2～3次，制得卟啉化合物荧光分子。

本发明所采用的另一个技术方案是：一种用上述卟啉化合物荧光分子的制备方法制得的卟啉化合物荧光分子在检测过氧化氢和葡萄糖中的应用。

本发明制备方法具有如下优点：

1）产率高、绿色，并且较以前的方法有一定的不同与改善，其与荧光探针结合后形成的检测探针，是荧光检测中较为理想的。

2）操作简便，价格低廉，降低了其检测成本。

3）制得的荧光分子较为稳定，外界影响较小，荧光比较稳定，卟啉化合物在溶液中具有强的荧光，将其表记荧光探针，应用于过氧化氢和葡萄糖检测，可以大大的提高其检测的灵敏度。

附图说明

图1是本发明制备方法制得的荧光分子的核磁共振氢谱图。

图2是本发明制备方法制得的荧光分子的红外谱图。

图3是本发明制备方法制得的荧光分子的荧光发射图。

图4是tpps4-fe²⁺检测h2o2的荧光猝灭图。

图5是tpps4-fe³⁺的荧光猝灭图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案进行进一步的说明，这些具体实施方案而不限于限制本发明的范围。未注明的实施条件为实验的一般常规条件，如温度为室温温度。

本发明提供了一种卟啉类化合物荧光分子的制备方法，具体按以下步骤进行：

1）将8ml吡咯溶于35ml丙酸中，得滴加液；

2）三颈圆底烧瓶中加入250ml丙酸溶液，油浴加热至微沸，再加入11ml苯甲醛，将步骤1）制得的滴加液慢慢滴加到反应瓶中回流1h，停止滴加，冷却至室温，放入冰箱（4℃）过夜（12h）；抽滤，用无水乙醇洗涤至溶液无色，然后再用200ml温度为50～65℃的热水洗涤2～3次，烘干后，得到紫色样品；用硅胶柱层析纯化，二氯甲烷和石油醚（体积比3︰1）为洗脱剂，旋蒸，烘干，制得5,10,15,20-四苯基卟啉（tpp）（0.3mm）；

3）在100ml的三颈圆底烧瓶中，将步骤2）制得的tpp溶于氯仿中，缓慢滴加10ml浓硫酸，搅拌条件下加热至95℃，恒温回流4h，得到绿色澄清溶液，冷却至室温后，小心浸入50ml冰水（0℃）中，得到紫色溶液，过滤，除去硫酸钠晶体，旋干，滤液用甲醇继续过滤后，在80℃的温度下真空干燥8h，得粗产品，将该粗产品溶于温度为30～55℃的甲醇中，搅拌的条件下加入丙醇，至出现沉淀，过滤，得紫色产品，再在搅拌的条件下将丙醇加入收集的滤液中，至出现沉淀，重复在滤液中加丙醇搅拌过滤2～3次，得到纯品四磺酸基苯基卟啉（tpps4）78.7mg，收率50%左右，该纯品四磺酸基苯基卟啉即为制得的卟啉化合物荧光分子。

卟啉类化合物荧光分子的制备过程中的反应式为：

由于卟啉类材料具有独特的光电特性，因此，本发明制备方法以现有的四磺酸基苯基卟啉（tpps4）的制备方法为基础，进行了改进，合成了绿色且产率有明显提高的tpps4。

本发明还提供了一种用上述制备方法制得的四磺酸基苯基卟啉在检测过氧化氢和葡萄糖中的应用，即利用上述制得的性能优良的tpps4构建一种新型的、灵敏的“turn-off”型荧光传感器来检测过氧化氢和葡萄糖。具体为：

用于检测过氧化氢时：将制得的（0.1m）tpps4的水溶液，加入500μl超纯水，再分别加入30μlfe²⁺溶液（2.6mm）和500μl（0.1m）的tris-hcl缓冲溶液（ph=7.4），在515nm的激发波长下激发，波长范围为600～800nm，由于在电子激发过程中，伴随有能量损失，所以发射波长一般较激发波长要长，狭缝宽度都为10nm。

实施例1

将8ml吡咯溶于35ml丙酸中，得滴加液；三颈圆底烧瓶中加入250ml丙酸溶液，油浴加热至微沸，再加入11ml苯甲醛，将制得的滴加液慢慢滴加到反应瓶中回流1h，停止滴加，冷却至室温，放入冰箱12h；抽滤，用先用无水乙醇洗涤值溶液无色，然后再用200ml热水(50℃-65℃)洗涤2～3次，烘干后，得到紫色样品；用硅胶柱层析纯化，二氯甲烷和石油醚为洗脱剂（体积比为3︰1），旋蒸，烘干，制得5,10,15,20-四苯基卟啉（tpp）（0.3mm）；在100ml的三颈圆底烧瓶中，将制得的tpp溶于氯仿中，滴加10ml的浓硫酸，搅拌下加热至95℃，恒温回流4h，得到绿色澄清溶液，冷却至室温后，将其小心浸入冰水（0℃）中，得到紫色溶液，过滤，除去硫酸钠晶体，旋干，滤液用甲醇继续过滤后，在80℃真空干燥8h，粗产品溶于热甲醇中，加丙醇，搅拌，出现沉淀，过滤出现紫色产品，重复加丙醇搅拌过滤等操作2～3次，得到纯品四磺酸基苯基卟啉（tpps4）78.7mg，收率50%左右。

准确称取0.20mg实施例1制得的tpps4，真空干燥后置于核磁管中，加入dmso-d6溶剂，进行核磁共振氢谱测定，如图1所示，从图1可以看出实验测得的各化合物的化学位移值如下：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ，ppm:8.85(s,8h),8.17(d,8h,j=4.0hz),8.06(d,8h,j=8.0hz),-2.94(s,2h)。该tpps4的红外谱图，见图2，从图2可以看出苯环及卟啉环上c=c的伸缩振动吸收峰1445cm⁻¹左右；芳环上的c-h伸缩振动吸收峰在2580cm^-1~2940cm^-1左右；磺酸基的特征吸收峰分别为1179cm^-1、1129cm^-1和638cm^-1；1650cm^-1左右为c-o的伸缩振动，卟啉环上和苯环上n=c的伸缩振动吸收峰1667cm^-1和1609cm^-1左右。该tpps4的荧光发射图，如图3所示，从图3荧光发射光谱可以看出当用515nm的激发波长照射tpps4溶液时，在645nm和700nm会出现两个比较明显的荧光发射峰。

用实施例1制得的tpps4检测过氧化氢（h2o2）：用制得的tpps4配制浓度为0.1m的tpps4水溶液；移取200μl该（0.1m）tpps4水溶液，加入500μl超纯水，再分别加入30μlfe²⁺溶液（2.6mm）和500μl（0.1m）的tris-hcl缓冲溶液，得tpps4-fe²⁺探针储备液，在515nm的激发波长下激发，得到图3所示的荧光发射图，看到tpps4的激发波长为515nm，波长范围为600～800nm，狭缝宽度是10nm。

向制备的tpps4-fe²⁺探针储备液中加入不同浓度的h2o2溶液，观察荧光随着h2o2浓度的增加而逐渐猝灭的现象，当加入到一定程度时，荧光不再发生变化，见图4，从图4可以看出tpps4-fe²⁺体系的荧光强度随着不同浓度h2o2的溶液浓度的变化情况，随着h2o2溶液浓度的不断增加，tpps4-fe²⁺体系的荧光强度的不断降低，当加入到一定程度时，荧光不再发生变化，表明此刻tpps4荧光猝灭程度已经达到最低。

用本发明制备方法制得的tpps4检测h2o2，最低检测限（lod）为1.24nm。

由于溶液中的亚铁离子(fe²⁺)能够被过氧化氢氧化成为三价铁离子(fe³⁺)，反应式为：2fe²⁺(aq)+h2o2+2h⁺(aq)→2fe³⁺(aq)+2h2o(l)；而三价铁离子(fe³⁺)会与tpps4形成配合物，进一步发生电荷转移过程，其原理的荧光猝灭图，见图5。本发明利用这一过程使tpps4的荧光降低，最终达到对过氧化氢的检测。

为了进一步扩大tpps4-fe²⁺探针的的应用范围，本发明将该探针用于检测一些血液或者细胞中的葡萄糖。具体检测方法为：向上述的tpps4-fe²⁺探针储备液中加入一定量的葡萄糖氧化酶，然后加入不同浓度的葡萄糖，观察到发生荧光强度的变化，可以猝灭荧光。对血液或者细胞中的葡萄糖的最低检测限（lod）为0.38nm。

利用tpps4-fe²⁺荧光探针可以广泛应用于血液、尿液及细胞中葡萄糖的检测。

本发明不仅解决了对过氧化氢的检测，还基于上述原理展开了对常见的一般物质葡萄糖的检测，检测方法不仅操作简便而且成本低廉、灵敏性较强、耗时较少，因此可被推崇利用。