本发明涉及药物质量控制
技术领域：
，具体涉及一种基于生物活性检测的双黄连注射液质量控制评价方法。
背景技术：
当前中药的质量控制方法是主要测定其所含的一种或两种化学成分，所测定的化学成分称为指标性成分，通过对指标性成分的定性或定量测定以反应该中药合格与否或评价质量优劣。由于目前绝大多数中药药效物质不明确，这种模式既难以保证该类中药质量的一致性和稳定性，也难以关联或反映其临床使用的安全性和有效性。《中国药典》2010年版编制大纲明确指出，要建立符合中医药特点的质量标准体系，逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分及和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化。由此而制定的“中药生物活性测定指导原则”已被《中国药典》(一部)2010年版附录收载。对于成分复杂的中药，《中国药典》提倡建立与其功效相关的生物活性测定方法，将生物活性测定法(又称生物鉴定bioassay)引入中药质量控制和评价体系，对于成分多样、结构复杂、理化性质不能表征其含量、理化测定不能反映生物活性和疗效的中药能凸显其优越性。双黄连注射液由黄芩、金银花和连翘三味药组成，具有清热解毒、清宣风热的功效。临床上治疗用于由外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛等症。可适用于病毒及细菌感染引起的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等病症。虽然双黄连注射液为常用中药注射液，但是目前尚缺乏相应的生物活性测定方法用于双黄连注射液质量控制评价。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种基于生物活性检测的双黄连注射液质量控制评价方法，该方法可以有效用于双黄连注射液的品质评价，以确定双黄连注射液质量的好坏，选优淘劣，保证双黄连注射液品质和药效，从而保证双黄连注射液用药的安全有效和在医药领域其他方面的合理应用。为此，本发明第一方面提供了一种基于生物活性检测的双黄连注射液质量控制评价方法，其包括双黄连注射液的清除自由基活性检测和/或抗炎活性检测。在本发明的一些优选的实施方式中，所述评价方法包括双黄连注射液的清除自由基活性检测和抗炎活性检测。在本发明的一些实施方式中，所述清除自由基活性检测的步骤包括：s1.双黄连注射液和工作对照品i的制备；1)配制同一批次系列浓度的双黄连注射液，所述双黄连注射液的浓度为0.01-1.0wt％；2)配制系列浓度在0-20mmol/l之间的工作对照品i，所述工作对照品i为自由基清除剂；s2.加样与检测；将双黄连注射液和工作对照品i分别与包含自由基的溶液混合并进行反应后，测定od值；s3.绘制标准曲线；1)以双黄连注射液的终浓度为横坐标、测得的od值为纵坐标，绘制双黄连注射液的终浓度-od值的标准曲线c1，获得双黄连注射液的终浓度的线性范围r1；2)以工作对照品i的浓度为横坐标、测得的od值为纵坐标，绘制工作对照品i-od值的标准曲线c2；s4.数据处理与效价计算；1)取不同批次双黄连注射液按照步骤s1-s2测定其与包含自由基的溶液反应后的od值；所述不同批次双黄连注射液的终浓度在线性范围r1内；2)根据标准曲线c1和标准曲线c2建立不同批次双黄连注射液浓度与工作对照品i的浓度关系，实现对不同批次双黄连注射液的质量控制评价。在本发明的一些实施方式中，所述线性范围r1为0.03-0.40wt％。在本发明的另一些实施方式中，所述双黄连注射液和工作对照品i与包含自由基的溶液的体积比均为1:(0.5-1.5)，其中，所述包含自由基的溶液为dpph*溶液，所述dpph*溶液的浓度为0.3-0.8mmol/l。在本发明一些具体的实施方式中，，在步骤s2中，所述反应时间为10-30min，优选为15-25min。在本发明的一些实施方式中，所述抗炎活性检测的步骤包括：t1.双黄连注射液和工作对照品ii的制备；1)用培养炎症模型细胞系的细胞培养基配制同一批次系列浓度的双黄连注射液，所述双黄连注射液的浓度为0.1-10wt％；2)配制系列浓度在10-800μmol/l之间的工作对照品ii，所述工作对照品ii为一氧化氮合酶抑制剂；t2.加样与检测；将双黄连注射液和工作对照品ii分别与lps、炎症模型细胞系混合进行反应，然后向获得的反应产物加入griess试剂再次反应后，测定od值；t3.绘制标准曲线；1)以双黄连注射液的终浓度为横坐标、测得的od值为纵坐标，绘制双黄连注射液的终浓度-od值的标准曲线c3，获得双黄连注射液的终浓度的线性范围r2；2)以工作对照品ii的浓度为横坐标、测得的od值为纵坐标，绘制工作对照品ii-od值的标准曲线c4；t4.数据处理与效价计算；1)取不同批次双黄连注射液按照步骤t1-t2，检测其od值；所述不同批次双黄连注射液的终浓度在线性范围r2内；2)根据标准曲线c3和标准曲线c4建立不同批次双黄连注射液浓度与工作对照品ii的浓度关系，实现对不同批次双黄连注射液的质量控制评价。在本发明的一些实施方式中，所述线性范围r2为0.062-1.00％。在本发明的一些具体实施方式中，在步骤t2中，所述双黄连注射液、lps及炎症模型细胞系体积比为1:(0.5-1.5):(1.5-2.5)。在本发明的另一些具体实施方式中，在步骤t2中，所述工作对照品ii、lps及炎症模型细胞系体积比为1:(0.5-1.5):(1.5-2.5)。在本发明的一些优选的实施方式中，在步骤t2中，所述lps浓度为30-50μg/ml。在本发明的另一些优选的实施方式中，在步骤t2中，所述炎症模型细胞系浓度为1.5×106-2.5×106个/ml。在本发明的一些具体实施方式中，在步骤t2中，所述炎症模型细胞系为巨噬细胞系或成纤维上皮细胞系，优选巨噬细胞raw264.7。本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述评价方法在药物生物活性评价或药物质量控制中的应用。本发明以双黄连注射液为对象，建立以药效为基础的中药质量生物测定方法，能够从清除自由基和抗炎活性等多重角度共同把关其内在质量，完善现行质量控制和品质评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的技术条件，且本发明的评价方法易操作，实用性强，应用面广，是中药质量控制和评价上的创新。附图说明下面将结合附图来说明本发明。图1为本发明的清除自由基活性检测中双黄连注射液的终浓度-od值线性分析图；图2为本发明中工作对照品i(trolox)-od值线性分析图；图3为本发明的抗炎活性检测中双黄连注射液的终浓度-od值线性分析图；图4为本发明中工作对照品ii(l-name)-od值线性分析图；图5为本发明中同一质量浓度不同批次的双黄连注射液样品与工作对照品i(trolox)清除自由基作用和工作对照品ii(l-name)对lps刺激炎症模型细胞系(raw264.7)分泌no的浓度关系图。具体实施方式使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。除非另有定义，本文使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。ⅰ.术语本发明所述用语“包含自由基的溶液”是指含有自由基且呈某种颜色的自由基溶液，其在某波长处有强的吸收峰，当有自由基清除剂存在时，由于自由基清除剂与其自由基的单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可通过测定吸光值进行快速的定量分析，例如本发明一个优选的实施方式选用dpph*溶液作为包含自由基的溶液。本发明所述用语“dpph*溶液”为1,1-二苯基-2-三硝基苯(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl)的醇溶液，分子式为c18h12n5o6，是一种自由基，带有单电子。其醇溶液呈紫色，当有自由基清除剂存在时，可与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度表明了抗自由基成分与dpph*单电子结合的数量或能力，因而可用分光光度计进行测定反应体系吸光度的变化，而定量表征抗氧化成分或物质的抗氧化能力，如测定生物试样、化学物质和食品等的抗氧化能力。dpph*的溶剂优选醇类，包括但不限于甲醇和乙醇。本发明所述用语“自由基清除剂”包括酶类清除剂和/或非酶类清除剂，其中，酶类清除剂包括但不限于超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶；非酶类清除剂包括但不限于维生素e、维生素c、β-胡萝卜素及微量元素硒，本发明一个优选的实施方式选用水溶性维生素e作为自由基清除剂。本发明所述用语“双黄连注射液的终浓度”是指所有反应物加入后，双黄连注射液的质量浓度。例如，本发明清除自由基活性检测中，双黄连注射液的终浓度指双黄连注射液和包含自由基的溶液混合后双黄连注射液的浓度；本发明抗炎活性检测中，双黄连注射液的终浓度指双黄连注射液和lps、炎症模型细胞系混合后双黄连注射液的浓度。本发明所述用语“炎症模型细胞系”包括但不限于巨噬细胞系、成纤维上皮细胞系等体外抗炎细胞模型，例如，本发明抗炎活性检测中一个优选的实施方式选用巨噬细胞raw264.7作为炎症模型细胞系。本发明所述用语“lps”为脂多糖(lipopolysaccharides)的简称，其激活巨噬细胞模型被广泛用于评价各种化学物质的抗炎作用。当巨噬细胞受到lps剌激时，释放大量炎症因子(no，pge2，tnf-a，il-6等)，若药物能抑制炎性介质或抑制产生炎症因子的酶活性(cox-2，inos等)，就具有抗炎作用。no作为炎症反应中的重要信使分子，既是炎症反应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子，它由一氧化氮合酶(inos)催化而成，参与多种炎症信号传导，并与多种炎症因子相互作用，产生于炎症反应的每一阶段，故可以通过测定no含量来评价某一抗炎药物的抗炎活性。本发明所述用语“griess试剂”是指n-1-萘乙二胺二盐酸盐溶液与磺胺溶液的混合物，该试剂可用于测定no的含量。具体测定原理：no在体内或水溶液中极易氧化成no2-，在碱性条件下，no2-与磺胺发生重氮反应生成重氮化合物(重氮盐)，后者进一步与n-1-萘乙二胺二盐酸盐发生耦合反应，生成有颜色的化合物，该反应生成的产物浓度与no浓度具有线性关系，可在540-560nm处测定吸光度，并制作标准曲线，通过曲线可求得样品中no含量。本发明所述用语“一氧化氮合酶抑制剂”是一类可阻止一氧化氮过量合成的物质。炎症模型细胞系受到lps剌激释放的no是由no合成酶氧化l-精氨酸产生，而一氧化氮合酶抑制剂可通过占据底物的结合部位，抑制no合成酶的活性，从而阻止l-精氨酸代谢生成no。例如，本发明抗炎活性检测中一个优选的实施方式选用l-name(亚硝基左旋精氨酸甲酯)作为一氧化氮合成酶抑制剂以抑制lps刺激巨噬细胞raw264.7释放no。ⅱ.具体实施方案本发明提供了一种基于生物活性检测的双黄连注射液质量控制评价方法，其包括双黄连注射液的清除自由基活性检测和/或抗炎活性检测。其中，清除自由基活性检测的原理为：双黄连注射液具有抗氧化、清除自由基作用，将同一批次系列浓度的双黄连注射液与在某波长处有强的吸收峰的包含自由基的溶液混合进行反应，由于双黄连注射液与包含自由基的溶液的单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可通过测定吸光值进行快速的定量分析，利用对同一批次系列浓度的双黄连注射液与包含自由基的溶液反应后测得的吸光值，绘制双黄连注射液的终浓度-od值的标准曲线c1，获得双黄连注射液的终浓度的线性范围r1；另一方面，配制系列浓度的自由基清除剂作为工作对照品i，将其分别与包含自由基的溶液混合进行反应，同样获得工作对照品i-od值的标准曲线c2。取不同批次双黄连注射液，将其配制为终浓度在线性范围r1内，按照上述步骤测得吸光值，将该吸光值对应于工作对照品i-od值的标准曲线c2中，建立不同批次双黄连注射液浓度与工作对照品i的浓度关系，获得不同批次双黄连注射液清除自由基活性的效价，从而实现对不同批次双黄连注射液的质量控制评价。抗炎活性检测的原理：双黄连注射液具有抑制产生炎症因子的酶活性的作用，其可抑制炎症模型细胞系中no合成酶的活性，从而阻止l-精氨酸代谢生成no。将同一批次系列浓度的双黄连注射液与lps、炎症模型细胞系混合进行反应，然后向获得的反应产物加入griess试剂进行griess反应后，在540-560nm处测定反应产物的吸光值，绘制双黄连注射液的终浓度-od值的标准曲线c3，获得双黄连注射液的终浓度的线性范围r2；另一方面，配制系列浓度的一氧化氮合酶抑制剂作为工作对照品ii，将其分别与lps、炎症模型细胞系混合进行反应，后通过griess反应并测定反应产物的吸光值，获得工作对照品ii-od值的标准曲线c4。取不同批次双黄连注射液，将其配制为终浓度在线性范围r2内，按照上述步骤测得吸光值，将该吸光值对应于工作对照品ii-od值的标准曲线c4中，建立不同批次双黄连注射液浓度与工作对照品ii的浓度关系，获得不同批次双黄连注射液抗炎活性的效价，从而实现对不同批次双黄连注射液的质量控制评价。本发明以双黄连注射液清除自由基活性和抗炎活性为指标进行效价计算，并用以表征双黄连注射液品质，可以对不同批次双黄连注射液样品进行定量的评价。建立以药效为基础的中药质量生物测定方法，能够从清除自由基和抗炎活性等多重角度共同把关其内在质量，本发明可以有效用于中药注射液双黄连注射液的品质评价，以确定双黄连注射液质量的好坏，选优淘劣，保证双黄连注射液品质和药效。与现有技术相比，具有显著的特征，首次提出并研究出双黄连注射液品质评价的生物活性测定方法，是中药质量控制和评价上的创新。实施例实施例1：清除自由基活性检测仪器、试剂及样品仪器：多功能连续波长酶标仪(tecan，infinitem1000)；ab265-s型分析天平(梅特勒-托利多)；215862z型和370615z型移液枪(eppendoff)；ts-2000a脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；酶标板costar。试剂：dpph，美国sigma公司，其余均为国产分析纯。样品：双黄连注射液由多多药业有限责任公司生产，共6个不同批次样品，分别以1～6#表示。具体为：1#(lot：13091711)、2#(lot：13091811)、3#(lot：13091911)、4#(lot：13110911)、5#(lot：13111011)及6#(lot：13110811)。本发明在具体实施时，通过以下步骤实现：(1)供试溶液和dpph*溶液的制备取1#双黄连注射液，用ddh2o配制成质量浓度分别为0.06％、0.1％、0.18％、0.28％、0.48％、0.8％的供试品溶液；用无水乙醇溶液将dpph配制成0.5mmol/l，冰箱避光保存。(2)加样与检测分别将供试溶液按每孔100μl加入96孔酶标板，再加入100μl0.5mmol/ldpph*溶液，此时双黄连注射液样品终浓度分别为0.03％、0.05％、0.09％、0.14％、0.24％、0.4％，将反应体系在微型振荡器上振荡30秒，室温避光反应孵育20min。在酶标仪540nm处测定od。(3)绘制标准曲线作为双黄连注射液品质评价方法(抗氧化效价测定方法)研究的基础，首先进行了双黄连注射液清除dpph*量效关系的线性考察，方法如下：按上述方法进行实验，以双黄连注射液的终浓度为横坐标x，以吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线c1：y＝-1.4045x+0.9021，r2＝0.9958，线性范围：0.03～0.40。详见附图1。(4)方法学验证本发明为了保证准确性和实用性特别还进行了以下的验证：按照药品生物检定的基本要求，对测定方法的①精密度②重复性③稳定性分别进行验证，以确定所建立方法的科学性与合理性。按照药品生物检定的要求，在上述研究(双黄连注射液清除dpph*活性检测研究)基础上，通过对样品多次反复检测，进行方法学验证，结果如下：1)精密度准确吸取同一供试溶液，连续测定5次，按上述方法进行实验，测定的od值的rsd代表其精密度，求得od值的rsd为1.51％。见表1。表1.双黄连对dpph清除作用的精密度考察2)重复性精确取同一双黄连注射液300μl共5份，并分别用蒸馏水配制成10ml溶液(5份)，再分别取1ml用蒸馏水配制成10ml溶液(5份)，进行测定，得每份测定的od值的rsd代表其重复性。求得od值的rsd为1.85％。见表2。表2.双黄连对dpph的清除作用的重复性试验结果3)稳定性准确吸取同一供试品溶液分别于不同时间进行测定，平行设置3-10个复孔，其od值的平均值的rsd代表其稳定性(设：0、4、8、24、48、72h)。求得rsd为2.07％。表3.双黄连对dpph的清除作用的稳定性试验结果(5)数据处理与效价计算用ddh2o将trolox(水溶性维生素e)配制成浓度分别为0mm、1.671mm、2.785mm、4.462mm、7.736mm的工作对照品i，同以上步骤(1)-(3)，测定其对dpph*的清除作用，并考察其线性关系，获得工作对照品i-od值的标准曲线c2：y＝-0.0802x+1.0657，r2＝0.9925。详见附图2。取6批次双黄连注射液配制为终浓度为0.15％的溶液，按照步骤(1)-(3)测定其对dpph*的清除作用，测得吸光值，将该吸光值对应于工作对照品i-od值的标准曲线c2中，建立不同批次双黄连注射液浓度与工作对照品i的浓度关系，获得不同批次双黄连注射液清除自由基活性的效价，从而实现对不同批次双黄连注射液的质量控制评价。结果见表4和附图5。表4.0.15％各样品双黄连相当于trolox的量mm样品号1#2#3#4#5#6#(mm)4.565.124.695.074.734.97实施例2：抗炎反应活性检测仪器、试剂及样品仪器：multiskanascent酶标仪，美国thermoelectron公司；eppendorf5ml单道移液器；大龙10μl、200μl、1000μl单道移液器；梅特勒ab265-s电子分析天平；bsz-2型自动双重纯水蒸馏器，上海博通；微孔板恒温振荡器，杭州奥盛仪器有限公司；雷磁3phs-3b型精密ph计，上海精密科学仪器有限公司；ms1minishaker微型振荡器；细胞培养板，酶标板，costar；三洋电机mco-15ac型二氧化碳孵箱，日本三洋电机；离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；yt-cj-1nd型超净工作台，北京亚泰科隆仪器制造有限公司；ckx41倒置显微镜，olympus；微型空气压缩机，绍兴市卫星医疗设备制造有限公司；dsx-280b不锈钢手提式消毒器，上海申安医疗器械厂；yg-1000型圆筒式不锈钢过滤器。细胞：raw264.7细胞系，协和基础所细胞中心提供。试剂：griess法测定no试剂盒，碧云天公司；lps，sigma公司，dmem细胞培养基，胎牛血清，gibco；其余均为国产分析纯。样品：双黄连注射液由多多药业有限责任公司生产，共6个不同批次样品，分别以1～6#表示。具体为：1#(lot：13091711)、2#(lot：13091811)、3#(lot：13091911)、4#(lot：13110911)、5#(lot：13111011)及6#(lot：13110811)。本发明在具体实施时，由以下步骤实现：(1)供试溶液的制备取1#双黄连注射液，用ddh2o配制成浓度分别为0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、2.00％、4.00％的供试品溶液；(2)加样与检测取对数生长期的raw264.7细胞以2×106个/ml(终浓度为1×106个/ml)加入96孔细胞板中，每孔100μl(对照孔加100μl培养基)。同时加入不同浓度的双黄连注射液50μl(对照孔加入50μl培养基)和浓度为40μg/ml(终浓度为10μg/ml)的lps50μl，双黄连注射液供试品溶液的终浓度分别为0.062％、0.125％、0.188％、0.25％、0.5％、1％，将反应体系孵育24小时，取上清50μl加室温griess试剂i50μl、室温griess试剂ii50μl，微型振荡器上振荡30秒混匀，5min后在540nm处测od值。(3)绘制标准曲线作为双黄连注射液品质评价方法(抗炎活性效价测定方法)研究的基础，首先进行了双黄连注射液对lps刺激raw264.7细胞释放no的影响的量效关系的线性考察，方法如下：按上述方法进行实验，以双黄连注射液的终浓度为横坐标x，以吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线c3：y＝0.4891e-2.142x，r2＝0.9928，线性范围：0.062～1％。详见附图3。(4)方法学验证本发明为了保证准确性和实用性特别还进行了以下的验证：按照药品生物检定的基本要求，对测定方法的①精密度②重复性③稳定性分别进行验证，以确定所建立方法的科学性与合理性。按照药品生物检定的要求，在上述研究(双黄连注射液抗炎活性检测研究)基础上，通过对样品多次反复检测，进行方法学验证，结果如下：1)精密度日内精密度(n＝5)：准确吸取用完全培养基配制成的同一供试溶液，连续测定5次，按上述方法进行实验，测定的od值的rsd代表其日内精密度，求得od值的rsd为3.21％。见表5。表5.双黄连对lps刺激的264.7细胞分泌no测定结果的日内精密度2)重复性精确取同一双黄连注射液200μl共5份，并用完全培养基配制成10ml溶液(5份)，进行测定，得每份测定的od值的rsd代表其重复性。求得od值的rsd为3.55％。见表6。表6.双黄连对lps刺激的264.7细胞分泌no测定结果的重复性试验3)稳定性准确吸取同一供试品溶液分别于不同时间进行测定，其od值的rsd代表其稳定性(设：0、4、8、24、48、72h，每次测定一次)。求得od值的rsd为4.46％。结果见表7。表7.双黄连对lps刺激的264.7细胞分泌no测定结果的稳定性试验(5)数据处理与效价计算将l-name配制成50μm、75μm、100μm、200μm、300μm、600μm的工作对照品ii，同以上步骤(1)-(3)，测定其对lps刺激raw264.7细胞释放no的影响，并考察其线性关系，获得工作对照品ii-od值的标准曲线c4：y＝0.292e-0.002x，r2＝0.9932，详见附图4。取6批次双黄连注射液配制为0.5％浓度，按照步骤(1)-(3)测定其lps刺激raw264.7细胞释放no的影响，测得吸光值，将该吸光值对应于工作对照品ii-od值的标准曲线c4中，建立不同批次双黄连注射液浓度与工作对照品ii的浓度关系，获得不同批次双黄连注射液抗炎活性的效价，从而实现对不同批次双黄连注射液的质量控制评价。结果见表8和附图5。表8.0.5％各样品双黄连相当于l-name的量样品号1#2#3#4#5#6#(μm)270285276290288274上述不同批次样品显示出不同效价值。如果以双黄连注射液清除dpph*活性和抗炎活性为指标进行效价计算，并用以表征双黄连注射液品质，可以对不同批次双黄连注射液样品进行定量的评价。说明方法的适用性较好、方法可行。可以有效用于中药注射液双黄连注射液的品质评价，以确定双黄连注射液质量的好坏，选优淘劣，保证双黄连注射液品质和药效。本发明与现有技术相比，具有显著的特征，首次提出并研究出双黄连注射液品质评价的生物活性测定方法，是双黄连注射液品质评价方法研究的一大创造。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。当前第1页12