本发明涉及食品领域，具体地，本发明涉及饲料中氨基酸的检测方法，更具体地，本发明涉及饲料中氨基酸提取液的制备方法以及检测饲料中氨基酸的方法。
背景技术
饲料中氨基酸的检测方法目前是以国家标准《gb/t18246-2000饲料中氨基酸的测定》为主，但是该国标方法中的前处理过程步骤比较繁琐。
因此，步骤简便、可操作性强、检测效果好的测定方法还需进一步研究。
技术实现要素：
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
发明人发现，国标方法《gb/t18246-2000饲料中氨基酸的测定》中记载的酸水解法不仅存在色氨酸无法测量，蛋氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸不能测准的问题；而且该方法的准确性、精密度和回收率较低，精密度仅为5.05～16.17％，回收率仅为51.3-91.7％。
基于上述问题，发明人通过无数的实验摸索后进一步发现，原因在于以下几个方面：其一，国标方法中的安瓿瓶密封性不够好，并且抽真空的条件在实际操作中根本无法实施，导致色氨酸全部被氧化破坏而无法测量，半胱氨酸和蛋氨酸部分被氧化而无法测准。其二，国标方法采用旋转蒸发器进行蒸发，存在以下几个问题，首先，旋转蒸发需要将样品逐个进行浓缩，导致浓缩效率低，耗时长，大约一个样品需要进行15～20min；其次，旋转蒸发使用的蒸发瓶一般容积较大，导致转移过程中样品损失较多；最后，由于水解液中包含盐酸，因此在旋转蒸发过程中挥发的盐酸势必会对旋转蒸发仪造成腐蚀而影响旋转蒸发仪的密封性，导致蒸发效率降低。其三，国标方法采用的浓缩器是在确定沸点的情况下浓缩速度较快，而本申请的水解液成分复杂，沸点各不相同，导致本申请样品水解后如果用浓缩器浓缩，耗时长，浓缩效率低，一批样品即使浓缩一小时以上也不一定能够符合要求。
最终，发明人通过用水解管代替安瓿瓶，同时充氮气进行保护，苯酚作为指示剂进行检测，并且将三角瓶置于电热板上在合适的温度下进行加热蒸发，克服了上述问题，进而，相比现有技术，本发明检测方法的准确性、精密度和回收率大大提高，精密度高达0.58-11.15％，回收率高达89-103.2％，并且本发明的检测方法能够一次性准确测定包括蛋氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等在内的17种水解氨基酸的含量。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种饲料中氨基酸提取液的制备方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)将待测饲料以及6mol/l的hcl溶液置于水解管中进行混合处理；
将3～4滴苯酚滴加在水解管中的混合物料中，之后向水解管中充满氮气，随后将水解管进行封口处理；
将封口的水解管中的混合物料进行水解处理；
(2)将水解处理产物用纯水定容后过滤，将滤液置于三角瓶中，将盛放有滤液的5～50ml，如10ml或25ml的三角瓶置于电热板上，将所述三角瓶中的滤液在温度为50～60℃的条件下进行蒸发处理；
(3)将蒸发处理产物进行稀释处理，所述稀释处理是通过向蒸发处理产物中加入0.02mol/l的hcl溶液进行的，以便获得所述提取液。
在制备饲料中氨基酸提取液的方法中，发明人发现，三角瓶的容量以及蒸发处理温度与最终样品中水解氨基酸的检测结果关系很大，若三角瓶的容量太大，虽然样液挥发速度快，但会导致上机时的稀释液无法很好地全部溶解瓶内残留物，从而给样品检测结果带来很大的偏差。若蒸发处理的温度过高，会使得部分样液烧焦在三角瓶底部，破坏待测氨基酸的结构，造成样品的损失，导致本发明检测方法的准确性和回收率降低；若蒸发处理的温度过低，会使得本发明检测方法的检测效率过低。采用根据本发明实施例的提取方法使本发明的检测方法与现有技术相比，准确性、精密度和回收率大大提高，精密度高达0.58-11.15％，回收率高达89-103.2％，并且能够一次性准确测定包括蛋氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等在内的17种水解氨基酸的含量。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述水解处理是在温度为109～111℃的条件下进行22～24小时。发明人发现，该条件下水解更充分，进而，后续的检测效果更好。
根据本发明的实施例，所述稀释处理前，进一步包括：向蒸发处理产物中加入纯水，重复蒸发2～3次。发明人发现，重复蒸发可以使盐酸蒸发完全，减小对后续检测的干扰，进而，检测效果更好。
根据本发明的实施例，所述待测饲料为30～50mg，所述6mol/l的hcl溶液的体积为10～15ml，所述定容后的体积为50ml，所述滤液为2～3ml。发明人发现，各容量与提取步骤相互配合，进而，后续的检测效果更好。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种饲料中氨基酸提取液的制备方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)将30～50mg待测饲料以及10～15ml6mol/l的hcl溶液置于水解管中进行混合处理；
将3～4滴苯酚滴加在水解管中的混合物料中，之后向水解管中充满氮气，随后将水解管进行封口处理；
将封口的水解管中的混合物料在温度为109～111℃的条件下进行22～24小时的水解处理；
(2)将水解处理产物用纯水定容至50ml后过滤，取2～3ml滤液置于5～50ml的三角瓶中，将盛放有滤液的三角瓶置于电热板上，将所述三角瓶中的滤液在温度为50～60℃的条件下进行蒸发处理；
(3)将蒸发处理产物进行稀释处理，所述稀释处理是通过向蒸发处理产物中加入0.02mol/l的hcl溶液进行的，以便获得所述提取液。
发明人发现，采用根据本发明实施例的提取方法使本发明的检测方法相比现有技术，准确性、精密度和回收率大大提高，精密度高达0.58-11.15％，回收率高达89-103.2％，并且能够一次性准确测定包括蛋氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等在内的17种水解氨基酸的含量。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附件技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述稀释处理前，进一步包括：向蒸发处理产物中加入纯水，重复蒸发2～3次。发明人发现，重复蒸发可以使盐酸蒸发完全，减小对后续检测的干扰，进而，检测效果更好。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测饲料中氨基酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
利用上述任一项所述的方法获得提取液；以及
基于所述提取液进行检测，以便获得所述饲料中的氨基酸的种类及含量。
根据本发明实施例的检测方法步骤简便、易懂，可操作性强，同时相比现有技术，准确性、精密度和回收率大大提高，精密度高达0.58-11.15％，回收率高达89-103.2％，并且能够一次性准确测定包括蛋氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等在内的17种水解氨基酸的含量。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述检测是通过氨基酸分析仪进行的。发明人发现，采用氨基酸分析仪进行检测，检测效果更好，仪器检出限达到3pmol/ul。
根据本发明的实施例，所述氨基酸分析仪采用na+交换柱，柱温为135℃。发明人发现，氨基酸分析仪采用该条件时，检测效果更好。
附图说明
图1是根据本发明实施例的氨基酸混合标准液的上机检测图谱示意图；
图2是根据本发明实施例的检测方法对饲料样品进行检测获得的上机检测图谱示意图；以及
图3是根据国标方法对饲料样品进行检测获得的上机检测图谱示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，本发明的提取方法和检测方法既适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、单一饲料和预混料中氨基酸总量的提取和测定，也适用于溶菌酶、铁锌氨基酸营养成分分析标准物质等含有氨基酸或蛋白质的有机物中氨基酸总量的提取和测定。
需要说明的是，如无特别说明，本申请所述的“水解氨基酸”是指将饲料样品经过上述水解处理后获得的氨基酸，如本申请的检测方法所能测定出的17种水解氨基酸，即天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸以及脯氨酸。
实施例1
饲料中氨基酸含量的检测方法如下：
1)酸水解法：样品(配合饲料)经过酸水解处理后，定容、过滤，取过滤液一定量进行赶酸，选择合适样品的稀释倍数，利用超声波混合均匀，经0.22um滤膜过滤，待用，直接机上测定。
2)取氨基酸混合标液0.4ml(日本味之素公司生产，含量5ml)，用0.02mol/l盐酸溶液溶解并定容至10ml，即配制成2nmol/20ul氨基酸混合标准工作液(其中只有脯氨酸为4nmol/20ul)，作为上机测定用，检测图谱示意图参见图1。用日立l-8900型氨基酸自动分析仪以外标法(用已知不同含量的氨基酸标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，在测校正曲线相同条件下进等量的待测样品，由仪器自动算出样品的含量)检测待测样品中各氨基酸的含量。
3)氨基酸全自动仪上机测定采用na+交换柱分离，柱温135℃，按仪器说明书要求配制标准分析用ph1、ph2、ph3、ph4、ph6洗脱溶液和茚三酮溶液以及茚三酮缓冲液。进行梯度洗脱，采用多反应监测方式进行定量，仪器检出限达到3pmol/ul。
上述步骤1)中样品(配合饲料)的处理方法具体如下：
a)称样(30-50mg)加入水解管中，加入(10-15)ml的6mol/l的hcl溶液后，混匀，继续向水解管内加入3-4滴苯酚。充氮气1分钟后快速封口，将水解管放在(110士1)℃的恒温干燥箱中，水解22-24小时。
b)完毕冷却后，开管、用高纯水定容至50ml、过滤、取2-3ml的滤液置于三角瓶(10ml的三角瓶)中，在电热板上在50-60℃的条件下蒸发至近干，必要时向三角瓶内可加少许水重复蒸干2—3次，自然冷却后，加入0.02mol/l的hcl溶液将样品稀释到所需浓度、利用超声波混合均匀，经0.22um滤膜过滤，待用。
c)准确配制浓度为2.00nmol/20ul的标准溶液，作为上机测定用，用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样测定液的氨基酸含量。
检测结果如下：
本发明检测方法获得的检测图谱示意图参见图2。国标法获得的检测图谱示意图参见图3。
针对同一饲料样品，因前处理提取方法不同，检测结果的精密度也会大不相同。本发明检测方法与国标法对实施例1的配合饲料中氨基酸精密度及种类的检测结果对比见下表1。
表1：本发明检测方法与国标法对配合饲料中氨基酸精密度及种类的检测结果对比
由上表1数据分析可知，本发明检测方法与国标法相比，准确度大大提高，且检测氨基酸种类很全面。本发明检测方法步骤简便、易懂，可操作性强，同时相比现有的国标方法，准确性、精密度和回收率大大提高，本方法的精密度在0.58-11.15％之间，国标法的精密度在5.05～16.17％之间。并且本发明检测方法能够一次性准确测定包括蛋氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等在内的17种水解氨基酸的含量。
因氨基酸项目的特殊性，无法运用传统测定回收率的方法实施，为了验证本发明检测方法的准确性，将本发明检测方法与国标法对已知氨基酸理论含量的溶菌酶中氨基酸的含量及种类的检测对比结果列于下表2中。
表2：本发明检测方法与国标法对溶菌酶中氨基酸含量及种类的检测结果对比
由上表2数据分析可知，本发明检测方法与国标法相比，准确度大大提高，且检测氨基酸种类很全面。本发明检测方法步骤简便、易懂，可操作性强，同时相比现有的国标方法，准确性、精密度和回收率大大提高，本方法的回收率在89-103.2％之间，国标法的回收率在51.3～91.7％之间。并且本发明的检测方法能够一次性准确测定包括蛋氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等在内的17种水解氨基酸的含量。
对比例1
检测方法与实施例1的区别仅在于：所测的样品为铁锌氨基酸营养成分分析标准物质，在电热板上是40℃的条件下蒸发至近干，所用的三角瓶分别为50ml和100ml，所消耗的时间和检测结果如下表3所示。
表3：对比例1中提取时所用参数及检测结果列表
由上表3的结果可以看出，对同一份样品在上述条件下进行上机测定前的前处理过程，所采用的蒸发器具不同，不仅会导致蒸发时间相差近20min，更重要的是，由于100ml的三角瓶相对于样品量来说容积太大，上机液又不能加的太多(否则影响样品最终稀释倍数和结果)，所以存在残留氨基酸溶解不彻底的现象，最终导致总氨基酸精密度偏差达到12.7％，超出了检测方法要求。
由于检测样品为铁锌氨基酸营养成分分析标准物质(国家标准物质中心所购)，氨基酸总量标准值为25.5g/100g，所以在上述40℃条件下，使用50ml的三角瓶比100ml的三角瓶得到的氨基酸总量回收率要高出很多。因此，最好使用容量为5～50ml的三角瓶进行加热蒸发。
另外，在温度为40℃条件下加热蒸发，对最终检测结果的回收率和精密度的影响不大，主要是检测效率会大大降低。
对比例2
检测方法与实施例1的区别仅在于：所测的样品为铁锌氨基酸营养成分分析标准物质，在电热板上是70℃的条件下蒸发至近干，所用的三角瓶分别为50ml和100ml，所消耗的时间和检测结果如下表4所示。
表4：对比例2中提取时所用参数及检测结果列表
由上表4的结果可以看出，对同一份样品在上述条件下进行上机测定前的前处理过程，所采用的蒸发器具不同，对蒸发时间造成的影响并不大。更重要的是，在70℃的条件下进行蒸发时，蒸发温度过高，使得部分样品不可避免地存在糊焦现象，进而导致整体检测准确性都大幅降低。
由于检测样品为铁锌氨基酸营养成分分析标准物质(国家标准物质中心所购)，氨基酸总量标准值为25.5g/100g，所以在上述70℃条件下，50ml的三角瓶和100ml的三角瓶得到的氨基酸总量回收率都非常低，仅仅在60％以下，严重影响检测结果的准确性。因此，最好在50～60℃的条件下进行蒸发，若蒸发处理的温度过高，检测方法的准确度和回收率将大幅降低。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。