本发明涉及一种褪黑素的快速检测方法及检测试剂盒，属于褪黑素的检测领域。
背景技术
褪黑素(mt)，又称为美拉酮宁、抑黑素、松果腺素，属于吲哚杂环类化合物，分子式为n-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种参与抗氧化系统、防止细胞产生氧化损伤的药物，具有安眠作用，但服用量需要控制，随意长期或过量使用，可能干扰或导致整个内分泌系统紊乱而引发其他疾病。
现有褪黑素含量的检测方法主要有以下几种:
1、薄层色谱法:
样品中的待测组分经甲醇提取后，所得溶液与对照品溶液在硅胶板上经展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视。在展开剂的作用下，由于不同物质的迁移速度不同，不同物质在博层色谱板上的不同位置以斑点的形式出现，根据待测样品是否在与对照品相应的位置出现斑点这一实验现象来判断待测样品中是否含有目标成分。如果与褪黑素对照品相应位置出现斑点，则提示样品中可能含有褪黑素成分。
薄层色谱法的优点是不需要昂贵的分析仪器，该法缺点是：色谱分辨率较低，中成药成分复杂，干扰因素多，容易产生误判，且薄层色谱需要干燥保存，分离效果受环境因素影响较大，不适合现场检测，不适合流动性较大的现场检测。
2、高效液相色谱法:
高效液相色谱法是常用的现代分析方法，在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同的色谱条件下褪黑素对照品与样品提取所得供试品溶液分别进样，根据色谱保留时间定性，根据峰高或峰面积定量可检测待测样品是否含有褪黑素成分。
高效液相色谱的优点是色谱分离效率高，灵敏度高。其缺点是：仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高；当共存成分的色谱峰保留时间与褪黑素保留时间接近时容易造成误判；仪器对环境的要求高，需固定放置，不适合现场检测；仪器对检测人员的专业技术要求较高，不适合基层人员操作。
3、高效液相色谱-质谱联用法
以高效液相色谱仪作为分离器，质谱仪作为分析器的高效液相色谱-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性。但高效液相色谱-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱更高，操作更加复杂的分析方法，仪器对环境的要求更高，需要固定放置，不适合现场检测，目前这种检测只能在少数实验室中进行，不易推广应用。
4、酶联免疫法
使抗原或抗体结合到某种固相表面，并保持其免疫活性。在测定时，把受检标本和酶标抗原或者抗体按照不同的步骤与固相载体表面的抗原或者抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物种的量成一定比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化变为有色底物，产物的量与标本中的受检物的量直接相关，所以可以根据颜色反应的深浅来进行定性或者定量分析。
酶联免疫法的缺点是酶联免疫试剂盒成本较贵，操作复杂繁琐，单个样品检测时间长，不适合应用于大量样品的筛查。
技术实现要素：
本发明提供一种褪黑素的快速检测方法及检测试剂盒，本发明检测方法，成本低、不需要分析仪器、试剂使用量少、操作方便、检测时间短，适合于大量样品的现场快速筛查药品、保健品中是否含有褪黑素。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种褪黑素的快速检测方法，包括顺序相接的如下步骤：
1)将待测样品与提取剂混合、静置，取上清液作为供试液；
2)滴供试液于定性滤纸上，静置待提取剂挥发后，在供试液的滴定位置上滴加对-二甲基氨基苯甲醛溶液，观察滤纸颜色变化，若滤纸颜色变为蓝色，则待测样品中含有褪黑素，若滤纸颜色没有变化，则待测样品中不含有褪黑素。
本申请在室温下操作即可。
本申请通过褪黑素与对二甲基氨基苯甲醛反应的颜色变化以达到快速检测的目的。
本申请步骤1)需要2分钟左右，显色反应在2分钟左右，整个操作过程在10分钟内完成，相对于高效液相色谱、液质联用和酶联免疫等方法简单快速，并且不需要对照品。
为了达到定量的目的，上述褪黑素的快速检测方法，还包括步骤3)：将步骤2)所得滤纸吹干，与标准色卡进行颜色比对，确定待测样品中褪黑素的具体含量；标准色卡的制备方法为：配制不同浓度的褪黑素溶液，分别进行步骤2)的操作，显色后将滤纸吹干，根据不同浓度的颜色制作浓度与颜色对应的标准色卡。
步骤3)中吹干为用吹风机对着滤纸吹2-3分钟，使所滴加溶液中的溶剂挥发即可。
为了保证提取的效率，提高检测的准确性，步骤1)中，提取剂为甲醇、乙醇或二氯甲烷的至少一种。
进一步优选，步骤1)中，提取剂为乙醇。
为了进一步提高检测的准确性，优选，步骤2)中，对-二甲基氨基苯甲醛溶液的浓度为10～50g/l。当对-二甲基氨基苯甲醛溶液大于50g/l时，在检测相同浓度的褪黑素时，显色没有显著的变化。
进一步优选，步骤2)中，对-二甲基氨基苯甲醛溶液的浓度为20±2g/l。申请人经研究发现，此浓度范围内能更好的保障检测的灵敏度。
为了进一步提高检测的灵敏性，步骤2)中，对-二甲基氨基苯甲醛溶液由对-二甲基氨基苯甲醛溶于体积浓度为20％～60％的无机酸乙醇溶液中所得，无机酸为盐酸、硫酸或磷酸。
为了更进一步提高检测的灵敏性，步骤2)中，无机酸为盐酸，盐酸和乙醇的体积比为1:1，盐酸的质量浓度为15-38％。
进一步优选，盐酸的质量浓度为20±2％。
一种褪黑素的快速检测的试剂盒，包括盒体和设在盒体内的隔断层，隔断层上设有提取剂孔区、显色剂孔区、滴管孔区、称量纸储存区和定性滤纸储存区；提取剂孔区内设有8-12瓶2ml装的提取剂；显色剂孔区设有一瓶以上的2ml装的显色剂，显色剂为对-二甲基氨基苯甲醛溶液；滴管孔区设有一支以上的一次性滴管；称量纸储存区由隔断层的局部凹陷形成，称量纸储存区内设有八张以上的称量纸；定性滤纸储存区由隔断层的局部凹陷形成，定性滤纸储存区内设有八张以上的定性滤纸。
作为一种优选方案，提取剂孔区内设有10瓶2ml装的提取剂，提取剂为乙醇；显色剂为浓度为20g/l的对-二甲基氨基苯甲醛溶液，对-二甲基氨基苯甲醛溶液由对-二甲基氨基苯甲醛溶于体积浓度为20％～60％的盐酸乙醇溶液中所得，盐酸乙醇溶液中盐酸和乙醇的体积比为1:1，盐酸的质量浓度为15-38％；滴管孔区设有10支一次性滴管；称量纸储存区内设有10张称量纸；定性滤纸储存区内设有10张定性滤纸。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明具有如下有益效果：操作简单，显色时间短，提取过程2分钟，显色反应2分钟，整个操作过程在10分钟内完成，相对于高效液相色谱、液质联用和酶联免疫等方法简单快速，并且不需要对照品；准确率高，片剂、胶囊、丸剂、颗粒和口服液等常用辅料对褪黑素物质的检测不会产生干扰；灵敏度高，检出限小于0.04mg，用本方法检查中成药和保健品中是否含有褪黑素成分具有足够的灵敏度；实验过程中所需试剂只需1滴待测液和1滴对-二甲基氨基苯甲醛溶液，即可实现准确检测，减少了化合物对环境的污染和对实验人员的身体健康的伤害；成本低、效率高，适于任何环境下检测，易推广。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
一种褪黑素的快速检测的试剂盒，包括盒体和设在盒体内的隔断层，隔断层上设有提取剂孔区、显色剂孔区、滴管孔区、称量纸储存区和定性滤纸储存区；提取剂孔区内设有10瓶2ml装的提取剂，提取剂为乙醇；显色剂为浓度为10-50g/l的对-二甲基氨基苯甲醛溶液，对-二甲基氨基苯甲醛溶液由对-二甲基氨基苯甲醛溶于体积浓度为20％～60％的盐酸乙醇溶液中所得，盐酸乙醇溶液中盐酸和乙醇的体积比为1:1，盐酸的质量浓度为15-38％；滴管孔区设有10支一次性滴管；称量纸储存区内设有10张称量纸；定性滤纸储存区内设有10张定性滤纸。
制作标准色卡：配制0-10mg/g不同浓度的褪黑素溶液，以0.1为梯度(也即相邻两浓度的差值为0.1mg/g)，然后根据不同浓度的颜色制作浓度与颜色对应的标准色卡。
实施例1
市售保健品1：片剂，400mg/片，标识服用量为每日一次，每次1片(液相色谱-串联质谱法检测本品中褪黑素的含量为5.02mg/g，即每片含有褪黑素2.00mg)；
取一粒片剂的1/2，研磨粉碎均匀，放入2ml乙醇中，振摇萃取1min，静置1min后分层，上清液作为供试液。取40mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入20％盐酸-乙醇溶液(v20％盐酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置1min使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，静置2min后，观察滤纸，滤纸上有颜色表示该样品中含有褪黑素。吹风机对滤纸干燥2min，再次观察滤纸颜色，与标准色卡进行颜色比对，每片大约含有褪黑素2.0mg。
取1片市售保健品1，研磨粉碎均匀，称取8mg(市售保健品1每片含有2mg褪黑素，8mg该保健品即含有0.04mg褪黑素)，放入2ml乙醇中振摇萃取1min，静置1min分层，上清液作为供试液。取40mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入20％盐酸-乙醇溶液(v20％盐酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置1min使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，吹风机对滤纸干燥3min，观察滤纸颜色变化，在滴定位置的边缘有蓝色出现，也即当样品中每片含有0.04mg褪黑素时，该方法仍能检测出褪黑素。
实施例2
市售保健品2：胶囊，150mg/粒，标识服用量为每日一次，每次1粒(液相色谱-串联质谱法检测本品中褪黑素的含量为3.89mg/g，即每片含有褪黑素0.584mg)；
取一粒胶囊，去掉胶囊壳，取一半内容物加入2ml乙醇中，震荡萃取1min，静置1min分层。上清液作为供试液。取20mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入30％盐酸-乙醇溶液(v30％盐酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置1min使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，静置2min后，观察滤纸，滤纸上有颜色表示该样品中含有褪黑素。吹风机对滤纸干燥2min，再次观察滤纸颜色，与标准色卡进行颜色比对，每片大约含有褪黑素0.4mg。
实施例3
市售保健品3：片剂，400mg/片，标识服用量为每日一次，每次1片(液相色谱-串联质谱法检测本品中褪黑素的含量为0.85mg/g，即每片含有褪黑素0.34mg)；
取一粒片剂的1/2，研磨粉碎均匀，加入2ml二氯甲烷中，振摇萃取1min，静置1min分层，上清液作为供试液。取60mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入25％盐酸-乙醇溶液(v25％盐酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置10秒使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，静置2min后，观察滤纸，滤纸上有颜色表示该样品中含有褪黑素。吹风机对滤纸干燥2min，再次观察滤纸颜色，与标准色卡进行颜色比对，每片大约含有褪黑素0.4mg。
实施例4
市售保健品4：软胶囊，500mg/粒，标识服用量为每日一次，每次1粒(液相色谱-串联质谱法检测本品中褪黑素的含量为0.95mg/g，即每片含有褪黑素0.238mg)；
将胶囊壳剪开，取大约一半内容物，滴入2ml甲醇中，振摇萃取1min，静置30秒分层，上清液作为供试液。取20mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入15％硫酸-乙醇溶液(v15％硫酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置30秒使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，静置3min后，观察滤纸，滤纸上有颜色表示该样品中含有褪黑素。吹风机对滤纸干燥2min，再次观察滤纸颜色，与标准色卡进行颜色比对，每片大约含有褪黑素0.2mg。
实施例5
市售保健品5：软胶囊，300mg/粒，标识服用量为每日一次，每次1粒(液相色谱-串联质谱法检测本品中褪黑素的含量为3.65mg/g，即每片含有褪黑素1.09mg)；
取一粒片剂的1/2，研磨粉碎均匀，加入2ml乙醇中，振摇萃取1min，静置10秒分层，上清液作为供试液。取100mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入38％盐酸-乙醇溶液(v38％盐酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置1min使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，静置3min后，观察滤纸，滤纸上有颜色表示该样品中含有褪黑素。吹风机对滤纸干燥2min，再次观察滤纸颜色，与标准色卡进行颜色比对，每片大约含有褪黑素1.2mg。
实施例6
市售保健品6：片剂，500mg/片，标识服用量为每日一次，每次1片(液相色谱-串联质谱法检测本品中褪黑素的含量为0.102mg/g，即每片含有褪黑素0.051mg)；
取一粒片剂的1/2，研磨粉碎均匀，加入2ml乙醇中，振摇萃取1min，静置0.5min分层，上清液作为供试液。取80mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入20％磷酸-乙醇溶液(v20％磷酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置1min使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，静置3min后，观察滤纸，滤纸上有颜色表示该样品中含有褪黑素。吹风机对滤纸干燥2min，再次观察滤纸颜色，与标准色卡进行颜色比对，每片大约含有褪黑素0.08mg。
实施例7
市售保健品7：口服液，标识服用量为每日一次，每次5～10ml(液相色谱-串联质谱法检测本品中未检出褪黑素)；
取一半服用量，加入2ml乙醇，振摇萃取1min，静置10秒分层，上清液作为供试液。取20mg对-二甲基氨基苯甲醛，加入20％盐酸-乙醇溶液(v20％盐酸：v乙醇＝1:1)2ml，使之溶解，装入滴瓶中，作为显色剂。
用一次性滴管吸取上清液，滴加一滴于定性滤纸上，静置1min使提取剂挥发，在原滴定位置上滴加显色剂一滴，静置3min后，观察滤纸，滤纸上无颜色变化表示该样品中不含有褪黑素。