抑制素B化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及体外检测
技术领域：
，具体涉及一种抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
抑制素(inh)属于转化生长因子β多肽家族，成熟的inh是一种32kda的二聚体糖蛋白激素。inh由α亚基和两种β亚基(βa和βb)之一通过二硫键连接而成，即抑制素a(α-βa)和抑制素b(α-βb)。只有二聚体形式的inh才有生物学活性。男性inhb由睾丸支持细胞分泌，另一小部分由性腺外组织产生。抑制素a在男性循环血液中浓度很低、不易被检出，且无生物活性。抑制素b具有生物活性，是男性体内抑制素的主要生理产物与重要形式。男性体内抑制素b占绝对主导地位，主要由男性睾丸支持细胞产生，是男性生精能力的直接标志物。抑制素b可指导男性不育症分析、辅助生殖技术、检测放化疗对男性生精功能损伤、诊断性早熟、青春期延迟等。女性inhb由卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞分泌，抑制素b可指导卵巢储备功能评估：抑制素b水平能够比bfsh值更早、更直接反应卵巢储备情况，当抑制素b水平不足以维持bfsh在正常范围内时，才表现为血液bfsh的升高；预测卵巢早衰(pof)：pof患者中，抑制素b在闭经前已经开始下降，且早于fsh的升高，e2仅在进入绝经期时才明显改变；辅助诊断多囊卵巢综合征(pcos)；辅助诊断子宫内膜异位症；诊断监测卵巢颗粒细胞癌；指导选择辅助生殖技术方案等。目前测定抑制素b的方法有放射免疫分析(ria)、酶免疫分析(eia)、时间分辨荧光(trfia)等。但它们在应用中都存在一些固有的缺陷：ria法存在放射性核素污染、标记物的货价期短、操作复杂、测试结果不稳定。eia法存在酶的活性容易失活，导致eia法的灵敏度不高，难以精确定量。trfia法虽然灵敏度较ria法高，但存在稀有重金属污染的风险。技术实现要素：本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。本发明的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒用于测定抑制素b，具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其检测时间短，并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测的优点。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：一种抑制素b化学发光免疫检测试剂盒，包括：r1试剂、r2试剂和r3试剂；所述r1试剂为用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释的链霉亲和素磁颗粒固相试剂；所述r2试剂为用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释的化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液；所述r3试剂为偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液、甘油、和nan3或proclin300的混合溶液；所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液和甘油体积相同，所述nan3或proclin300的体积为所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液和甘油二者体积之和的0.1％。在上述技术方案中，所述链霉亲和素磁颗粒固相试剂的磁珠浓度为0.01％～1％。在上述技术方案中，所述链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm。在上述技术方案中，所述化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的抑制素b单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3～20。在上述技术方案中，所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的抑制素b单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:5～20。在上述技术方案中，所述化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。在上述技术方案中，所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的偶联标记物为生物素、抗原、或者二者的衍生物。在上述技术方案中，所述的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括a液和b液，所述a液为硝酸溶液，所述b液为氢氧化钠溶液。在上述技术方案中，所述的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒还包括抑制素b校准品，其浓度分别为0.0pg/ml、20.0pg/ml、100.0pg/ml、250.0pg/ml、500.0pg/ml、1300.0pg/ml和1500.0pg/ml的抑制素b溶液。一种抑制素b化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)r1试剂的制备取链霉亲和素磁颗粒溶液，加入tbst溶液充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复清洗3次后，用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释后配制成链霉亲和素磁颗粒固相试剂；(2)r2试剂的制备将抑制素b单克隆抗体放入离心管底部位置后，加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入化学发光标记物的dmf溶液，用离心机室温条件下离心，然后将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，再加入赖氨酸封闭液，接着放入气浴恒温振荡器中速混匀后进行封闭；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集，用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释后配制成化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液；(3)r3试剂的制备取抑制素b单克隆抗体，用ph为6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的偶联标记物，于2～8℃反应后，再转入室温继续反应，最后加入赖氨酸继续反应，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300，得到偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液。本发明的有益效果是：1、本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒所用的化学发光标记物有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。2、本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒采用链霉亲和素磁颗粒与偶联标记物的类似物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。3、本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守。4、本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒所用的化学发光标记物最优选为吖啶酯，其化学发光免疫分析系统线性范围宽。5、本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒与仪器组成封闭系统，系统误差小。6、本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成对抑制素b的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间。这种化学发光免疫分析试剂盒的检测精度较高。7、本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒在准确度方面可以替代市面上酶联免疫法试剂盒，为客户提供更加准确的测量数据。8、本发明的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒用于测定抑制素b，具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其检测时间短，并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测的优点。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。图1为本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒的开发流程图。图2为实施例3得到的inhb标准曲线图。具体实施方式本发明的发明思想为：参见图1，本发明通过筛选原料确定固相磁珠，液相标记物，偶联标记物，再通过对各相抗体浓度调配及配方调整后，进而提供了一种包括化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液、链霉亲和素磁颗粒和偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒。本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒用于测定抑制素b相比传统的检测方法，抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应更加迅速灵敏；另一方面，抑制素b化学发光免疫检测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。本发明提供一种抑制素b化学发光免疫检测试剂盒，包括：r1试剂、r2试剂和r3试剂；所述r1试剂为用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释的链霉亲和素磁颗粒固相试剂；所述r2试剂为用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释的化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液；所述r3试剂为偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液、甘油、和nan3或proclin300的混合溶液；所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液和甘油体积相同，所述nan3或proclin300的体积为所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液和甘油二者体积之和的0.1％。优选所述链霉亲和素磁颗粒固相试剂的磁珠浓度为0.01％～1％。优选所述链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm。优选所述化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的抑制素b单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3～20。优选所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的抑制素b单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:5～20。优选所述化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。优选所述偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液中的偶联标记物为生物素、抗原、或者二者的衍生物。优选所述的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括a液和b液，所述a液为硝酸溶液，所述b液为氢氧化钠溶液。优选所述的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒还包括抑制素b校准品，其浓度分别为0.0pg/ml、20.0pg/ml、100.0pg/ml、250.0pg/ml、500.0pg/ml、1300.0pg/ml和1500.0pg/ml的抑制素b溶液。本发明还提供一种抑制素b化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)r1试剂的制备取链霉亲和素磁颗粒溶液，加入tbst溶液充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复清洗3次后，用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释后配制成链霉亲和素磁颗粒固相试剂；(2)r2试剂的制备将抑制素b单克隆抗体放入离心管底部位置后，加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入化学发光标记物的dmf溶液，用离心机室温条件下离心，然后将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，再加入赖氨酸封闭液，接着放入气浴恒温振荡器中速混匀后进行封闭；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集，用由50mmmes、0.05％吐温-20和0.05％proclin300组成的ph值为6.5的缓冲液稀释后配制成化学发光标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液；(3)r3试剂的制备取抑制素b单克隆抗体，用ph为6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的偶联标记物，于2～8℃反应后，再转入室温继续反应，最后加入赖氨酸继续反应，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300，得到偶联标记物标记的抑制素b单克隆抗体溶液。本发明提供的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒用于检测抑制素b时，利用全自动化学发光免疫分析仪(迪瑞cm180)对抑制素b校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的光量子数计算抑制素b的浓度；最后对抑制素b全自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、抗干扰/特异性)的评价。实施例1：抑制素b化学发光免疫检测试剂盒的制备：(1)链霉亲和素磁颗粒固相试剂的制备：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，加入10ml的tbst溶液充分混匀10分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05％的固相试剂，2～8℃保存。(2)吖啶酯标记的抑制素b单克隆抗体溶液的制备：将500μg抑制素b单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入1ml2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心0.5分钟。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀4小时。加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2～8℃保存。使用时将纯化后的抑制素b抗体浓溶液用50mmmes、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/ml，2～8℃保存。(3)生物素标记的抑制素b单克隆抗体溶液的制备：取抑制素b单克隆抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入15倍摩尔比已活化的长链磺化生物素sulfo-nhs-lc-biotin，2～8℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应30min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300。实施例2：抑制素b化学发光免疫检测试剂盒检测方法：以全自动化学发光免疫分析仪(cm180)为检测工具，方法学模式为双抗体夹心法，即仪器依次加入20μl的样本，50μl实施例1制备的吖啶酯标记的抑制素b单克隆抗体溶液，50μl实施例1制备的生物素标记的抑制素b单克隆抗体溶液及40μl实施例1制备的链霉亲和素磁颗粒固相试剂。反应20分钟后，进行磁分离。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光底物液a液(hno3溶液)和b液(naoh溶液)进行反应，最后记录光量子数。实施例3：抑制素b化学发光免疫检测试剂盒性能评价(1)线性的检测：将校准品浓度为0.0pg/ml、20.0pg/ml、100.0pg/ml、250.0pg/ml、500.0pg/ml、1300.0pg/ml和1500.0pg/ml作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.998，线性范围为10-1300pg/ml。参见表1和图2。表1浓度光量子数0179020345010092602501337950026620130060074150069485(2)灵敏度计算分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次光量子数测定，取其平均值减去两倍的标准差，所得光量子数带入标准曲线所得即为灵敏度；计算抑制素b化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为11.97pg/ml，详见表2。表2(3)抗干扰特异性实验：取纯血清添加干扰物质包括：胆红素，血红蛋白，甘油三酯，生物素，分别测定添加干扰物质的混合血清及单纯血清，计算抗干扰率，以±10％为界限。结果显示，干扰物质不会显著影响抑制素b的测定。表3附抗干扰特异性实验数据：实施例4：抑制素b化学发光免疫检测试剂盒的制备：(1)链霉亲和素磁颗粒固相试剂的制备：取浓度是50mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液1.5毫升(75mg)，加入15ml的tbst溶液充分混匀15分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％的固相试剂，2～8℃保存。(2)吖啶酯标记的抑制素b单克隆抗体溶液的制备：将1000μg抑制素b单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心30s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入1.5ml2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心1分钟。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(26℃)，混匀5小时。加入2ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(26℃)，中速混匀，封闭时间为2h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2～8℃保存。使用时将纯化后的抑制素b抗体浓溶液用50mmmes、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/ml，2～8℃保存。(3)生物素标记的抑制素b单克隆抗体溶液的制备：取抑制素b单克隆抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素sulfo-nhs-lc-biotin，2～8℃反应1h，再转入室温继续反应10min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应20min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300。实施例5：抑制素b化学发光免疫检测试剂盒的制备：(1)链霉亲和素磁颗粒固相试剂的制备：取浓度是200mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液2毫升(400mg)，加入10ml的tbst溶液充分混匀20分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗4次后在50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为1％的固相试剂，2～8℃保存。(2)吖啶酯标记的抑制素b单克隆抗体溶液的制备：将2000μg抑制素b单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心60s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入20ml2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心2分钟。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(27℃)，混匀6小时。加入4ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(27℃)，中速混匀，封闭时间为4h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2～8℃保存。使用时将纯化后的抑制素b抗体浓溶液用50mmmes、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/ml，2～8℃保存。(3)生物素标记的抑制素b单克隆抗体溶液的制备：取抑制素b单克隆抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入20倍摩尔比已活化的长链磺化生物素sulfo-nhs-lc-biotin，2～8℃反应3h，再转入室温继续反应60min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应50min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300。将上述实施例中所用的化学发光标记物吖啶酯分别替换为鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌，将偶联标记物生物素替换为抗原，即可以制备得到含有上述标记物标记的r2、r3试剂的试剂盒。上述实施例制备的抑制素b化学发光免疫检测试剂盒用于测定抑制素b，具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其检测时间短，并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测的优点。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12