一种检测食物中金黄色葡萄球菌肠毒素U蛋白的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种检测食物中金黄色葡萄球菌肠毒素u蛋白的试剂盒及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus,s.aureus)是与食物中毒相关的一种重要的食源性致病菌，广泛存在于水、空气和灰尘中，在健康成年人的皮肤、鼻腔和粘膜上也经常被发现。金黄色葡萄球菌同时可以引人和动物的诸多疾病，从轻微的呕吐、皮肤组织感染，到严重的肺炎、败血症等。引发金黄色葡萄球菌食物中毒病症的主要毒力因子就是金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins,ses)。ses具有很高的热稳定性，对胃肠蛋白酶如胰蛋白酶、凝乳酶等都有很高的耐受性，肠毒素进入肠胃系统，经过消化途径，其活性依然可以保持，引起食物中毒，导致休克、痉挛、呕吐等病症。

金黄色葡萄球菌肠毒素目前共发现24种不同血清型，根据其被发现的时间先后分别被命名为sea～selly，其中sea-see是传统肠毒素，seg～sely为新型肠毒素。传统肠毒素具有很高的致病性，例如sea在很小的剂量下就可以引起食物中毒的典型症状。随着近年来的研究发现，在食物中毒案件分离株和食物分离株中，新型肠毒素基因的检测率特别高，新型肠毒素也同样具有潜在的致病性。

目前检测肠毒素的方法中，应用最为广泛的是pcr方法，pcr方法具有良好的特异性和灵敏度，可以实现对样品的大量检测，但是其只能从基因水平进行检测，而真正引起人体致病的是肠毒素蛋白本身，pcr不能检测肠毒素蛋白，但elisa却能满足蛋白水平的测试需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种食物中检测金黄色葡萄球菌肠毒素u(seu)蛋白的elisa试剂盒及其应用，能够从蛋白水平上检测seu的含量以及产毒菌株的分泌和表达情况。

本发明提供了一种检测食物中金黄色葡萄球菌seu蛋白的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：包被seu蛋白的酶标板、抗seu蛋白抗体溶液、酶标记的羊抗鼠抗体溶液、洗涤液、终止液和底物溶液。

优选的，所述包被seu蛋白的酶标板中seu蛋白的包被浓度为1～8μg/ml。

优选的，所述抗seu蛋白单克隆抗体溶液的浓度为2～5μg/ml。

优选的，所述酶标记的羊抗鼠抗体溶液的稀释倍数为1:3000～1:6000。

优选的，所述酶标记的羊抗鼠抗体溶液的酶包括辣根过氧化物，所述底物溶液为tmb溶液。

优选的，所述洗涤液以水为溶剂，每升洗涤液包括：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g、500μl的tween-20；所述洗涤液的ph值为7.4。

优选的，所述终止液为硫酸溶液；所述硫酸溶液的浓度为2mol/l。

本发明提供了所述的试剂盒在检测食物中金黄色葡萄球菌肠毒素u的应用。

优选的，所述检测检测食物中金黄色葡萄球菌肠毒素u的方法，包括以下步骤：

a.将待检的样品溶液与抗seu蛋白单克隆抗体溶液等体积混合，在15～25℃下反应25～35min，得到反应液，

b.将所述反应液加入包被seu蛋白的酶标板中，在35～42℃下孵育45～90min，洗涤液洗涤，得到孵育后的酶标板；

c.将酶标记的羊抗鼠抗体溶液加入所述孵育后的酶标板中，在35～42℃下反应30～60min，洗涤液再次洗涤，得到酶标记的酶标板；

d.将底物溶液加入所述酶标记的酶标板中，在35～42℃下避光显色10～20min，加入终止液后，在450nm下测定吸光度值；

e.根据seu蛋白标准品的吸光值绘制标准曲线，将所述吸光度值代入标准曲线的对应方程中计算样品溶液中seu蛋白的浓度。

本发明提供了一种检测金黄色葡萄球菌seu蛋白的试剂盒，样品中若含有葡萄球菌seu蛋白，则会与其单克隆抗体溶液反应，消耗掉部分的单克隆抗体，反应后的溶液再与包被在酶标板底部的seu抗原反应，洗涤后，包被抗原和鼠源单克隆抗体复合物与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体结合，形成包被抗原-抗体-酶复合物，最后加入tmb底物显色，根据反应物吸光度值来实现样品中seu蛋白的定量检测。

本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的方法能够在蛋白水平上检测seu蛋白的分泌和表达情况，灵敏度为0.15μg/ml，具有良好的稳定性、特异性和准确度。

附图说明

图1为seu蛋白检测方法的标准曲线；

图2为seu蛋白阴性菌株和阳性菌株培养液的western-blot检测验证结果；

图3为携带seu肠毒素的菌株在lb培养基中120h的生长曲线及蛋白含量曲线；

图4为携带seu肠毒素的菌株在脱脂牛奶中120h的生长曲线及蛋白含量曲线；

图5为携带seu肠毒素的菌株在无菌熟猪肉中120h的生长曲线及蛋白含量曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种食物中检测金黄色葡萄球菌seu蛋白的试剂盒，包括以下组分：包被seu蛋白的酶标板、抗seu蛋白抗体溶液、酶标记的羊抗鼠抗体溶液、洗涤液、终止液和底物溶液。

在本发明中，所述包被seu蛋白的酶标板中seu蛋白的包被浓度优选为1～8μg/ml，更优选为3～5μg/ml。所述seu蛋白为基因工程重组蛋白。

本发明所述包被seu蛋白酶标板的制备方法优选包括以下步骤：

1)将seu蛋白溶于缓冲液后，得到seu蛋白溶液；

2)将所述seu蛋白溶液添加到酶标板中进行一次孵育；

3)将一次孵育后的酶标板用洗涤液一次洗涤，得到一次洗涤酶标板；

4)用封闭液封闭一次洗涤酶标板，弃去液体，洗涤液二次洗涤后，得到封闭酶标板。

在本发明中，所述缓冲液优选以水为溶剂，每升包括：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g；所述缓冲液的ph值优选为7.4。所述试剂为常规化学纯试剂，按要求制备即可。

在本发明中，所述封闭液是以水为溶剂，每升封闭液包括：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g和脱脂乳粉50g，所述封闭液的ph值为7.4。

在本发明中，所述洗涤液一次洗涤的次数优选为3次。在本发明中，所述洗涤液加入酶标板的孔中优选静置3min后，弃去洗涤液。本发明对所述洗涤液的用量没有特殊限定，优选将洗涤液加满酶标板的孔即可。

本发明用封闭液封闭所述一次洗涤酶标板，弃去液体，洗涤液二次洗涤，得到封闭酶标板。

在本发明中，所述封闭液加入的体积优选为每孔加入180～220μl，更优选为190～210μl，最优选为200μl。

在本发明中，所述封闭的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述封闭的时间优选为60～120min，更优选为70～110min，最优选为80～100min。

在本发明中，所述抗seu蛋白单克隆抗体溶液的浓度优选为2～5μg/ml，更优选为2～3μg/ml。本发明将制备得到的抗seu蛋白单克隆抗体溶于缓冲液后，得到抗seu蛋白单克隆抗体溶液。在本发明中，所述缓冲液优选以水为溶剂，每升包括：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g；所述缓冲液的ph值优选为7.4。所述试剂为常规化学纯试剂，按要求制备即可。

在本发明中，所述酶标记的羊抗鼠抗体溶液的浓度优选为1:3000～1:6000，更优选为1:3000。本发明将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶于缓冲液后，得到酶标记的羊抗鼠抗体溶液。所述酶标记的羊抗鼠抗体溶液中的酶的种类优选为辣根过氧化物，对应的底物溶液优选为tmb。所述的tmb底物溶液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸)是常规商品化试剂，无特殊要求。本发明对所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

在本发明中，所述洗涤液以水为溶剂，每升洗涤液优选包括：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g和500μl的tween-20；所述洗涤液的ph值为7.4。所述试剂为常规化学试剂，按要求制备即可。

在本发明中，所述终止液为硫酸溶液，优选浓度为2mol/l。所述试剂为常规化学纯试剂，按要求制备即可。

在本发明中，所述检测食物中检测金黄色葡萄球菌肠毒素u的方法，优选包括以下步骤:

a.将待检的样品溶液与抗seu蛋白单克隆抗体溶液等体积混合，在15～25℃下反应25～35min，得到反应液，

b.将所述反应液加入包被seu蛋白的酶标板中，在35～42℃下孵育45～90min，洗涤液洗涤，得到孵育后的酶标板；

c.将酶标记的羊抗鼠抗体溶液加入所述孵育后的酶标板中，在35～42℃下反应30～60min，洗涤液再次洗涤，得到酶标记的酶标板；

d.将底物溶液加入所述酶标记的酶标板中，在35～42℃下避光显色10～20min，加入终止液后，在450nm下测定吸光度值；

e.根据seu蛋白标准品的吸光值绘制标准曲线，将所述吸光度值代入标准曲线的对应方程中计算样品溶液中seu蛋白的浓度。

在本发明中，所述样品溶液是指待检测的样品溶液或者是含seu蛋白的标准品。

本发明将样品溶液与抗seu蛋白单克隆抗体溶液等体积混合后，在15～25℃下反应25～35min，得到反应液，将所述反应液加入步骤2)所述封闭后的固相载体中，在35～42℃下孵育45～90min，弃去液体、洗涤液洗涤后，得到孵育后的固相载体；所述抗seu蛋白单克隆抗体溶液的浓度为2～5μg/ml。

在本发明中，所述seu蛋白溶液的浓度为1～8μg/ml，优选为3～5μg/ml。本发明将seu蛋白溶于缓冲液后，得到的seu蛋白溶液。在本发明中，所述缓冲液优选以水为溶剂，每升包括：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g；所述缓冲液的ph值优选为7.4。

在本发明中，所述抗seu蛋白单克隆抗体溶液的浓度为2～5μg/ml，更优选为2～3μg/ml。本发明对所述抗seu蛋白单克隆抗体的制备方法采用本领域技术获得。本发明将制备得到的抗seu蛋白单克隆抗体溶于缓冲液后，得到优选的抗seu蛋白单克隆抗体溶液。

本发明将样品溶液与抗seu蛋白单克隆抗体溶液等体积混合后，在15～25℃下反应25～35min，优选在18～22℃下反应28～32min，更优选在20℃下反应30min。

本发明将反应液加入封闭后的固相载体中，在35～42℃下孵育45～90min，优选在37℃下孵育55～80min，更优选孵育65～70min。

在本发明中，所述封闭后的固相载体的每孔中加入反应液的量优选为90～110μl，更优选为95～105μl，最优选为100μl。

本发明将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶液加入所述孵育后的固相载体中，在35～42℃下反应30～60min，弃去液体、洗涤液洗涤后，得到标记的固相载体；所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶液的稀释度为1:3000～1:6000，更优选为1:3000。本发明优选将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶于缓冲液后，得到辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶液。本发明对所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

在本发明中，所述孵育后的固相载体的每孔中加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶液的量优选为90～110μl，更优选为95～105μl，最优选为100μl。

本发明将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶液加入所述孵育后的固相载体中，在35～42℃下反应30～60min，优选在37℃下反应40～50min。

本发明将tmb底物溶液加入所述标记的固相载体中，在35～42℃下避光显色10～20min，加入终止液后，在450nm下测定吸光度值，根据seu蛋白标准曲线，计算样品溶液中seu蛋白的浓度。

在本发明中，所述seu蛋白标准曲线，按照检测流程，用竞争抑制elisa法检测不同质量浓度seu抗原(0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)，测定od450nm值，制作标准曲线。优选的回归方程为y＝-2.2057x+0.6915，r²＝0.9933，其中y＝ln(p/q)，p＝od450/od4500，od4500为seu蛋白溶液浓度为0μg/ml的吸光度值，q＝1-p，x＝lg(样品溶液中seu蛋白的浓度)。在本发明中，所述标准曲线的制备方法优选包括：将质量浓度为0～20μg/ml的seu蛋白溶液采用本发明的检测流程，测定吸光度值od450，制作得到。

在本发明中，所述标记的固相载体的每孔中加入tmb底物溶液的量优选为90～110μl，更优选为95～105μl，最优选为100μl。在本发明中，所述tmb底物溶液为常规购买试剂。

本发明将tmb底物溶液加入所述标记的固相载体中，在35～42℃下避光显色10～20min，优选在37℃下避光显色15min。

在本发明中，所述终止液优选包括硫酸溶液，所述硫酸溶液的浓度优选为2mol/l。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素u蛋白的试剂盒及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

标准曲线制备

(1)取最优选的4μg/mlseu蛋白溶液，每孔100μl加入到酶标板中，4℃冰箱包被过夜；

(2)倒出包被液，每孔加满洗涤液，静置3min，倒出洗涤液，重复3次，在报纸或纸巾上拍干至无液体流出；洗涤液以水为溶剂，每升包括：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，500μl体积的tween-20，洗涤液的ph值为7.4；

(3)每孔加入200μl封闭液，在37℃恒温培养箱中封板60min，封闭液以水为溶剂，每升包括：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，脱脂乳粉50g，封闭液的ph值为7.4；

(4)倒出封闭液，按照步骤2洗板；

(5)用0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10、20μg/mlseu蛋白溶液与最优选的2.33μg/ml抗seu蛋白单克隆抗体溶液等体积混合，在室温下反应30min，每孔100μl加入酶标板中，放入37℃恒温培养箱孵育45min；

(6)倒出液体，洗板，步骤同2；

(7)每孔加入100μl稀释后的1:3000辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶液，37℃作用30～60min；

(8)倒出抗体溶液，洗板5次，步骤同2；

(9)每孔加入100μltmb底物溶液，37℃恒温培养箱避光显色10min；

(10)加入终止液，每孔100μl，用酶标仪测定450nm处吸光度值，终止液为硫酸溶液，浓度为2mol/l。

对450nm处吸光度值进行直线回归，令p＝od450/od450，q＝1-p，y＝ln(p/q)，x＝lgseu蛋白溶液中蛋白的浓度，其中:od450为吸光度检测值，od4500为seu蛋白浓度为0的吸光度检测值的均值。回归方程如图1所示，回归方程为y＝-2.2057x+0.6915，r²＝0.9933。

实施例2

灵敏度实验

(1)取最优选的4μg/mlseu蛋白溶液，每孔100μl加入到酶标板中，4℃冰箱包被过夜；

(2)倒出包被液，每孔加满洗涤液，静置3min，倒出洗涤液，重复3次，在报纸或纸巾上拍干至无液体流出；洗涤液以水为溶剂，每升包括：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，500μl体积的tween-20，洗涤液的ph值为7.4；

(3)每孔加入200μl封闭液，在37℃恒温培养箱中封板60min，封闭液以水为溶剂，每升包括：氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，脱脂乳粉50g，封闭液的ph值为7.4；

(4)倒出封闭液，按照步骤2洗板；

(5)取不同浓度0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5μg/mlseu蛋白溶液与最优选的2.33μg/ml抗seu蛋白单克隆抗体溶液等体积混合，在室温下反应30min，每孔100μl加入酶标板中，放入37℃恒温培养箱孵育45min；

(6)倒出液体，洗板，步骤同2；

(7)每孔加入100μl稀释后的1:3000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体溶液，37℃作用30～60min；

(8)倒出抗体溶液，洗板5次，步骤同2；

(9)每孔加入100μltmb底物溶液，37℃恒温培养箱避光显色10min；

(10)加入终止液，每孔100μl，用酶标仪测定450nm处吸光度值，终止液为硫酸溶液，浓度为2mol/l；

(11)根据吸光度值计算抑制率，抑制率＝(1-od450nm阳性值p/阴性值n)×100％。

根据阴性血清od450的吸光度值的均值和标准差而给出判定标准，取均值±3倍标准差为阳性临界值，均值±2倍标准差为阴性临界值，结果为抑制率≥31％为阳性，≤28％为阴性。

利用上述方法检测不同浓度的seu蛋白(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5μg/ml)，测试上述检测方法的灵敏度，抑制率，结果见表1。

表1不同浓度的seu蛋白的检测结果

从表1中可以得出，当seu蛋白浓度达到0.1μg/ml时，抑制率就低于了31％，所以灵敏度为0.15μg/ml。

实施例3

精密度和稳定性实验

批内变异将阳性对照组(不同浓度的seu蛋白稀释液)，阴性对照组(不含seu蛋白的pbs)分别作5个孔，用实施例1的方法同时检测其吸光度值；批间变异将上述标本作于同一个板上，每隔2h检测一次450nm处的吸光度数值。变异系数的计算公式为cv＝(标准差s/平均值x)×100％，结果见表2。

表2检测结果的精密度与稳定性

根据表2可以得出，批内变异系数小于2％，批间变异系数小于4％，说明该方法具有良好的稳定性。

实施例4

人工污染样品中seu蛋白的回收率

培养基质分别选择lb肉汤、牛肉糜和熟米饭，通过添加一定浓度的seu蛋白，使基质中seu蛋白的含量分别为1.25μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml。采用实施例1的检测方法分别测定样品和阴性对照的od450的吸光度值，每个梯度重复三次，计算样品的回收率并进行评价，(回收率＝测量浓度/实际浓度×100％)结果见表3。

表3人工污染样品的回收率结果

根据表3可以得出，牛肉糜、熟米饭和lb肉汤样品中seu蛋白都具有较好的回收率，在90％及以上，并且三种污染样品中seu蛋白的回收率随着添加浓度的增加而增高，其中在牛肉糜和lb肉汤中的回收率好。说明本发明提供的方法具有较高准确度。

实施例5

特异性检验

挑选出携带seu基因的阳性菌株和不携带seu基因的阴性菌株各1株，将这两株菌在bp平板上划线培养37℃培养20h，挑取单菌落放入5ml的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，37℃培养过夜。取菌液1ml，4℃，15000r/min，离心20min，取离心后的上清液，利用实施例1的方法进行seu含量的检测，同时利用抗seu蛋白单克隆抗体进行western-blot的检测，western-blot检测与上述方法检测结果进行比较，验证了方法的特异性和准确性，结果见图2。

结果为：用本发明提供的方法检测阳性菌株和阴性菌株，结果阳性菌株培养上清液中蛋白含量为0.21μg/ml，阴性菌株培养上清液蛋白含量不能检出。

结果见图2，其中泳道1为阴性菌株培养上清液western-blot检测结果，泳道2为阳性菌株培养上清液western-blot检测结果。从图2中可以看出，阴性菌株的上清液通过western-blot检测处未出现目的条带，阳性菌株的上清液处的western-blot检测出现了目的条带，证实本发明方法的正确性和特异性。

实施例6

检测表达seu蛋白的阳性菌株在lb培养基中蛋白表达的变化，检测方法同实施例1；

取表达seu蛋白的阳性菌株进行培养，将菌株以初始浓度为10⁵cfu/ml接入到培养基中，培养120h，其中从0h开始，每隔12h取菌液1ml，4℃，15000r/min离心20min，并取上清液，对seu蛋白含量进行检测。

结果为：从图3中可以看出，培养液上清中seu蛋白的含量在0～48h内不断增加，含量持续上升，seu蛋白的含量在120h时，检出结果为0.69μg/ml。

实施例7

检测表达seu蛋白的阳性菌株在脱脂乳中蛋白分泌的变化，检测方法同实施例1；

取阳性菌株进行培养，将菌株以初始浓度为10⁵cfu/ml接入到脱脂乳中，培养120h，其中从0h开始，每隔12h取菌液1ml，4℃，15000r/min离心20min，并取上清液，检测上清液中的蛋白含量。

结果为：从图4中可以看出，培养液上清中seu蛋白的含量在12～120h内都有持续的上升，seu蛋白的含量在12～72h内增长迅速，在72～120h内增长缓慢，在120h时，蛋白含量为0.26μg/ml。

实施例8

检测表达seu蛋白的阳性菌株在无菌熟猪肉中蛋白分泌的变化，检测方法同实施例1；

取阳性菌株进行培养，将菌株以初始浓度为10²cfu/ml，取100μl菌悬液加入到有10g无菌熟猪肉的锥形瓶中，放入恒温培养箱，37℃条件下培养48h。在0，8，16，24，32，40，48h取样。取样时在锥形瓶中加入10ml生理盐水洗脱，取1ml洗脱液在15000r/min，4℃条件下离心20min，检测seu蛋白含量。

结果为：从图5中可以看出，培养液上清中seu蛋白的含量在0～24h内增长迅速，在24～48h内增长较为缓慢，在48h时蛋白含量为7.12μg/g猪肉。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的方法能够在蛋白水平上检测肠毒素蛋白的分泌和表达情况，灵敏度为0.15μg/ml，具有良好的稳定性、特异性和较高的准确度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。