一种生物素标记的依布硒啉探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一种生物素标记的依布硒啉探针及其制备方法和应用。

背景技术

依布硒啉(ebselen)是一种有机硒化合物小分子抗氧化剂，能清除机体内过多的过氧化物，阻断产生自由基的链式反应，因此可治疗多种疾病，如心血管疾病、关节炎、中风、动脉粥样硬化和癌症。此外，依布硒啉还是公认的可充当谷胱甘肽过氧化物酶活性(gpx)模拟物，可以催化一些重要反应来保护细胞成分免受自由基和氧化损伤的。也有研究说明依布硒啉是哺乳动物硫氧还蛋白(trxr)的极好底物，并充当脱氢抗坏血酸(dha)还原酶模拟物。然而，依布硒啉作用的分子机制仍不明确，破译依布硒啉的细胞机制迫切需要解决。

多年来，对于能够和依布硒啉进行共价靶向的蛋白的研究多是基于对所要研究的单个或者一类蛋白为对象进行研究的发现，现在只有19种潜在的蛋白质靶点可以被依布硒啉共价靶向。对于在蛋白组范围内能够和依布硒啉进行共价靶向的蛋白的研究还很少见。设计合成依布硒啉生物素化探针对探究依布硒啉所能共价靶向的蛋白的探究将起着十分重要的作用，但已有设计合成的依布硒啉类似物的生物素化探针，不能够更加精准的探究依布硒啉所能共价靶向的蛋白。所以，亟需一种合成简单，检测灵敏的生物素标记的依布硒啉探针。

技术实现要素：

本发明主要目的，是提供一种生物素标记的依布硒啉探针。本发明探针能够在细胞或者组织蛋白组范围内标记依布硒啉所能够靶向的蛋白，这对探究依布硒啉的作用机制具有深远的影响。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种生物素标记的依布硒啉探针，结构式如下所示：

本发明目的之二，提供所述生物素标记的依布硒啉探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将邻碘苯甲酰氯和对苯二胺进行反应，反应后水洗、分液，水相用ch2cl2萃取两遍后，合并有机相，干燥、旋干、色谱柱分离，得化合物i，结构式如下：

(2)将叔丁氧羰酰基6-氨基己酸、edci和hobt溶解混合，加入三乙胺后，冰浴条件下搅拌均匀，然后加入化合物i，反应24小时，得化合物ii，结构式如下：

(3)将碘化亚铜和1，10-邻菲罗啉溶解混合，搅拌均匀后，加入化合物ii、硒粉以及碳酸钾，加热反应24小时，反应结束后，将反应液倒入nacl溶液中，室温搅拌均匀，过滤、水洗、干燥后色谱柱分离，得到化合物iii，结构式如下：

(4)将化合物iii溶解，冰浴条件下加入三氟乙酸，室温搅拌过夜，得化合物iv，结构式如下：

(5)将生物素、n-羟基丁二酰亚胺和edci溶解在dmf中，搅拌均匀，24小时反应后，将混合溶液倾倒在冷水中，所得白色固体即为biotin-nhs。

(6)将化合物iv和biotin-nhs溶解混合，加入三乙胺，搅拌均匀，24小时反应即得。

具体的反应过程如下图1所示。

优选的，所述的步骤(1)中邻碘苯甲酰氯、对苯二胺的体积质量比为1-1.5：2-3；色谱柱分离洗脱剂为ch2cl2和甲醇按体积比35-45：1配制而成。

优选的，所述的步骤(2)中叔丁氧羰酰基6-氨基己酸、edci·hcl、hobt和化合物i的质量比为：1-1.5：0.6-1：0.9-1.4:1.3-2。

优选的，所述的步骤(3)的具体步骤为：反应在氮气保护的条件下进行，将碘化亚铜和1,10-邻菲罗啉溶于dmf中，搅拌均匀，加入化合物ii、硒粉以及碳酸钾，110℃加热反应24小时，反应结束后，将反应液倒入nacl溶液中，室温搅拌均匀，过滤、水洗、干燥后色谱柱分离，得到化合物iii；碘化亚铜、1,10-邻菲罗啉、化合物ii、硒粉、碳酸钾的质量比为0.13-0.16：0.13-0.16：2-2.5：0.35-0.4：0.8-1.0；色谱柱分离洗脱剂为ch2cl2和甲醇按体积比20-25：1配制而成。

优选的，所述的步骤(4)中，化合物iii、三氟乙酸的质量体积比为1-2：5-10。

优选的，所诉的步骤(5)中，生物素、n-羟基丁二酰亚胺、edci的质量比为：1.2-1.5：0.7-0.9：1.2-1.4。

优选的，所述的步骤(6)中化合物iv、biotin-nhs的质量比为0.8-1：0.7-0.9。

本发明目的之三，提供所述生物素标记的依布硒啉探针和/或所述制备方法在检测依布硒啉共价靶向蛋白中的应用。

本发明目的之四，提供一种检测依布硒啉共价靶向蛋白的检测方法，包括以下步骤：

(1)采用超声破碎法对细胞进行裂解，得浓度为2mg/ml的蛋白溶液；将权利要求1所述的生物素标记的依布硒啉探针加入蛋白溶液中，25℃反应1小时。

(2)将上述步骤(1)反应后的蛋白溶液进行westernblot实验，在膜上观察所标记到的蛋白；

(3)将上述步骤(1)反应后的蛋白溶液用ch3oh/chcl3进行沉淀，然后用冷甲醇进行洗涤；超声复溶，用streptavidinbeads进行富集，用trypsin进行酶切，得肽段；

(4)上述步骤(3)中肽段进行二甲基化标记，并利用高效液相色谱进行碱性分级；

(5)将分级好的肽段进行合并后，利用lc-ms进行数据采集，对数据进行搜库分析。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1.本发明生物素标记的依布硒啉探针制备方法简单，标记速度快，检测过程中不需要长时间的孵育；

2.本发明生物素标记的依布硒啉探针结构相对比较精准，所得到的靶向蛋白更能接近依布硒啉药物所能靶向的蛋白；

3.本发明生物素标记的依布硒啉探针能够通过westernbolt比较直观地观察标记的情况，同时能够对所标记的蛋白进行富集。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是biotin-ebselen探针反应过程图。

图2是本发明的不同浓度对的biotin-ebselen探针和hela细胞蛋白组作用后的westernblot图。

图3是本发明的biotin-ebselen探针和hela细胞蛋白组作用不同时间后的westernblot图。

图4是本发明的biotin-ebselen探针分别和dmso以及ebselen在以hela细胞蛋白组为对象的条件下的竞争的westernblot图。

图5是本发明biotin-ebselen探针在细胞蛋白组范围内探究依布硒啉共价靶向蛋白的工作流程图。a图是dmso和biotin-ebselen探针作用蛋白的流程图；b图是biotin-ebselen探针和依布硒啉竞争作用蛋白的流程图。

图6是以hela蛋白组为例，通过两次重复实验所得到biotin-ebselen探针探究到依布硒啉共价靶向蛋白数量结果的维恩图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例一种生物素标记的依布硒啉探针的制备方法

所述生物素标记的依布硒啉探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将邻碘苯甲酰氯(1.33g)和对苯二胺(1.08g)分别溶解在ch2cl2(各10ml)中，并在对苯二胺溶液中加入三乙胺(1.04ml)，然后将邻碘苯甲酰氯溶液在冰浴条件下滴加到对苯二胺的溶液中，室温过夜反应，反应水洗，分液后，水相在用ch2cl2进行萃取两遍，有机相合并，干燥后，旋干，用色谱柱分离(洗脱剂：v石油醚：v二氯甲烷＝40：1)，所得固体即化合物i。

esi-ms:calculatedfor[m+h]⁺＝338.9988,found338.9969.

(2)将叔丁氧羰酰基6-氨基己酸(1.02g)、edci·hcl(0.93g)和hobt(0.65g)溶解在ch2cl2(30ml)中，再加入三乙胺(0.74ml)，在冰浴条件下搅拌半小时，然后加入化合物i(1.35g)，反应24小时，得到析出的固体，过滤，用溶剂对固体进行洗涤，即得化合物ii。

esi-ms:calculatedfor[m+h]⁺＝574.1173,found574.1155.

(3)反应在氮气保护的条件下进行，将碘化亚铜(114mg)和1,10-邻菲罗啉溶(108mg)于dmf(5ml)中，搅拌15min后，加入化合物ii(1.65g)、硒粉(284mg)以及碳酸钾(621mg)，110℃加热反应24小时，反应结束后，将反应液倒如nacl溶液中，室温搅拌3小时，过滤，水洗固体，干燥后色谱柱分离(v二氯甲烷：v甲醇＝25：1)，得到化合物iii；

esi-ms:calculatedfor[m+h]⁺＝526.1216,found526.1233.

(4)将化合物iii(1g)溶解于ch2cl2/ch3oh(v/v＝10:1)(15ml)中，冰浴条件下加入三氟乙酸(5ml)，室温搅拌过夜后，即得检化合物iv；停止反应时，旋干，加入饱和nahco3(10ml)淬灭反应，分液，有机相用饱和氯化钠进行洗涤，干燥，旋干，所得的固体即为化合物iv；

(5)将生物素(1.47g)、n-羟基丁二酰亚胺(0.76g)和edci(1.38g)溶解在dmf(10ml)中，室温搅拌，24小时后终止反应，将反应液倾入冷水中，所得白色固体，过滤，甲醇洗涤几次，干燥即为biotin-nhs。

(6)将化合物iv(0.8g)和biotin-nhs(0.75g)溶解在dmf(10ml)中，加入三乙胺(0.61ml)，常温搅拌，24小时反应即得biotin-ebselen。停止反应时，将反应液倒入冷水中，过滤，所得的固体用甲醇洗一下即为化合物biotin-ebselen。

核磁及质谱表征：

¹1hnmr(400mhz,dmso)δ10.00(s,1h),8.08(d,j＝7.8hz,1h),7.89(d,j＝7.5hz,1h),7.77(s,1h),7.66(d,j＝8.6hz,2h),7.60–7.40(m,3h),6.41(d,j＝27.8hz,2h),4.29(s,1h),4.12(s,1h),3.20–2.94(m,3h),2.81(dd,j＝11.5,4.4hz,1h),2.57(d,j＝12.9hz,1h),2.40–2.24(m,2h),2.04(t,j＝6.4hz,2h),1.59(d,j＝6.5hz,3h),1.46(dd,j＝26.1,5.5hz,5h),1.26(d,j＝29.1hz,5h).¹³cnmr(400mhz,dmso)δ172.27,171.69,165.38,163.18,139.35,137.6,134.89,132.60,128.91,128.35,126.69,126.29,125.67,120.00,61.50,59.65,55.92,38.76,36.80,35.69,29.49,28.69,28.50,26.59,25.72,25.33.

esi-ms:calculatedfor[m+h]⁺＝630.1648,found630.1637.

试验例

(一)不同浓度的探针biotion-ebselen对hela细胞蛋白组标记的westernblot实验。

分别用0、10、25、50、100μm的本发明实施例制备得到的探针biotion-ebselen与100μl2mg/ml的hela细胞蛋白组溶液进行作用，25摄氏度作用一小时后，进行sds-page实验，然后进行转膜等一系列的westernblot的实验操作。以hrp-labeledstreptavidin为抗体进行孵育，最终在凝胶成像系统下进行显影成像。实验结果如图2，所能标记到蛋白的量随着探针浓度的增大而增大。

(二)探针biotion-ebselen对hela细胞蛋白组不同时间段标记的westernblot实验。

将100μm本发明实施例制备得到的探针biotion-ebselen与600μm2mg/ml的hela细胞蛋白组溶液进行作用，分别在10、30、60、90、120min时取出100μl并加入上样缓冲终止反应，然后在进行westernbolt的一系列操作，以hrp-labeledstreptavidin为抗体进行孵育，最终在凝胶成像系统下进行显影成像。实验结果如图3，探针与蛋白组溶液作用10min就基本已经标记完成。

(二)本发明的biotin-ebselen探针分别和dmso以及ebselen在以hela细胞蛋白组为对象的条件下的竞争的westernblot实验。

蛋白组样品分为四组：组一用dmso进行作用，组二蛋白组样品用探针进行作用，同时作用1小时后，加入上样缓冲溶液淬灭反应。组三、组四蛋白组样品分别用dmso和依布硒啉作用0.5小时，然后两组蛋白组样品再用探针同时作用1小时后，加入上样缓冲溶液淬灭反应。此后在进行westernbolt的一系列操作，以hrp-labeledstreptavidin为抗体进行孵育，最终在凝胶成像系统下进行显影成像。实验结果如图4，图中从左至右孔道分别为组一至组四，由图4可知，本发明探针能够标记到依布硒啉靶向的蛋白。

图5为本发明实施例的探针biotion-ebselen在细胞蛋白组范围内探究依布硒啉共价靶向蛋白的工作流程图。a图是组一、组二的实验，通过最后定量结果找出探针所能标记到的蛋白并且排除非特异性蛋白。b图是组三、组四的实验，通过最后的定量结果确认探针所能标记到的依布硒啉所能共价靶向的蛋白。两个流程都包括探针与蛋白作用、富集、酶切、二甲基化、碱性分级、lc-ms检测、搜库等步骤。

图6以hela蛋白组为例，通过两次重复实验所得到biotin-ebselen探针探究到依布硒啉共价靶向蛋白数量结果的维恩图。此处结果设置定量的r值分别是rprobe/dmso≥10和rprobe/competitor≥1.5。同时满足这两个r值的蛋白即认定为依布硒啉所能共价靶向到的蛋白。第一次生物鉴定到625个依布硒啉所能共价靶向到的蛋白；第二次生物实验鉴定到838个依布硒啉所能共价靶向到的蛋白。两次生物实验所共同鉴定到的蛋白即最后所认为的依布硒啉所能共价靶向到的蛋白，共462个。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。