本发明涉及自身免疫性肝病抗体的检测领域，具体涉及可一次性检测多项自免肝抗体的试剂盒。
背景技术：
：通常情况下，人不会产生自身抗体。免疫系统的主要功能是区分外来抗原(如感染性的抗原)和自身组织。当一个人的免疫系统产生对自身抗原有潜在破坏性的抗体(即自身抗体)时就会发生免疫混乱。大多数的自身免疫混乱可以分为非器官特异性(系统性)或器官特异性的。自身免疫性肝病作为一种发病机理不明的疾病与许多疾病有关联，且由于最初的临床症状与病毒性肝炎症状相似，临床上诊断比较困难。因此，准确及时地监测出自身免疫性肝病的特异性自身抗体无疑对诊断以及进一步治疗具有重要意义。自身免疫性肝病抗体包括抗ro-52(ssa52kda),线粒体(ama)、anti-cenpb、ama-m2、actin、lkm-1、sp100、gp210、nup62、pml、lc-1和sal/lp)等多种不同抗原的免疫球蛋白igg类抗体。ro-52抗体(ro-52)抗ro52抗体不具有疾病特异性，可在肌炎、系统性硬化症、其他胶原病、新生儿红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎及病毒性肝炎中检出该抗体。抗线粒体抗体-m2：ama-m2是原发性胆汁性肝硬化(pbc)最为灵敏、特异的诊断标志。高滴度ama-m2抗体对于pbc的诊断和预测pbc患者是否会出现肝功能障碍或者胆汁淤积症状意义重大。自身免疫性肝炎、进行性系统性硬化症、干燥综合征、与pbc重叠征患者中也可检测到ama-m2抗体。慢性hcv、系统性红斑狼疮可检测到低浓度ama-m2抗体。早幼粒细胞蛋白抗体(pml)pml抗体主要出现在sp100抗体阳性的患者中。两者具有相同的敏感性、特异性。出现pml抗体阳性与sp100抗体阳性的pbc患者病情进展较快预后较差。pml与sp100具有高度特异性提高了pbc患者的检出率，是pbc早期诊断的重要指标。核颗粒蛋白抗体(sp100)有少部分pbc及自身免疫性肝炎(aih)患者中可检测到sp100抗体。抗gp210抗体(gp210)抗gp210抗体对pbc具有较高的敏感性和高度的特异性，与sp100、ama-m2联合检测可以提高pbc患者的检出率并增加对pbc诊断的特异性。gp210、sp100对pbc诊断尤其对ama-m2阴性的患者具有重要意义。肝肾微粒体抗体(lkm-1)抗肝肾微粒体抗体-1是ii型aih的标志性抗体,在诊断及其鉴别诊断中起着非常重要的作用。分子生物学技术的发展为鉴定自身免疫性疾病的自身靶抗原提供了非常有用的实验手段。除了ii型自身免疫性肝炎外,少数丙型肝炎患者血清中也可出现lkm-1。lkm-1可在1％的成人aih患者中被检出，但在儿童aih患者中lkm-1阳性率更高。在1-2％hcv患者中lkm-1也可以被检出。肝溶质抗体(lc-1)lc-1对aih的诊断具有一定的敏感性与100％的特异性，与sla/lp一同检测可以提高aih患者检出率。⑼可溶性肝-肝胰抗体(sla/lp)sla/lp在aih患者中的阳性率为30％，但其特异性为100％，如果存在相应临床症状，仅sla/lp就基本可以确诊aih。平滑肌抗体(sma)：自身免疫性肝炎可出现高滴度的sma,常与ana同时出现。抗肌动蛋白抗体，常见于aih患者,也可见于多种肝脏疾病或风湿性疾病等。高效价的sma与ana同时出现(即呈阳性)是诊断i型aih最重要的参考指标,其阳性率高达92.2％,此类抗体灵敏度较高,但特异性差。单一的自身抗体检测不能诊断aih,需结合其他临床指标才能诊断。可溶性肝抗原/肝胰抗原(sla/lp)抗体sla/lp抗体是aih最特异的诊断标志。虽然它的阳性率只有10％～30％,但其阳性预告值几乎为100％。如果出现相应的临床症状,抗体阳性基本上可诊断aih。抗-sla/lp对aih具有高度特异性,且可在ana低滴度或其他自身抗体均阴性血清中检出。因此,在ana、sma及lkm-l抗体阴性或低滴度肝病患者中进行该抗体检测,可对隐源性慢性肝病患者进行重新分类,提高对aih诊断的准确率,减少漏诊及误诊,使不典型的aih患者得到及时有效的治疗。但抗-sla/lp的检出率较低。kanzler等报道仅有11％～32.5％的aih患者抗-sla/lp阳性。鉴于此种现状,需要寻找更敏感的检测方法以增加抗-sla/lp的检出率,使其发挥临床诊断作用。抗着丝点(centromere)抗体主要见于crest综合征，即钙化症、雷诺现象、食管运动障碍、硬指症及毛细血管扩张，检出率为38％～80％。也见于弥漫型硬皮病(检出率约为20％)以及原发性胆汁性肝硬化(pbc)。pbc患者中aca阳性常伴pbc其他相关自身抗体，pbc患者中约20％ama阳性同时伴aca阳性。aca伴抗核点抗体(sp100,pml等)、抗核包膜蛋白抗体(gp210,p62)也可见到。多种pbc相关自身抗体同时出现，可增加对pbc诊断的特异性。抗核孔蛋白(nuclearporeprotein)p62抗体，其靶抗原为位于核孔复合物上的62kd跨膜蛋白。抗p62抗体为pbc另一高特异性自身抗体，在其他肝病或自身免疫性疾病中未检出，其敏感性为23％-32％。抗gp210抗体和抗p62抗体倾向于相互独立，一般不同时出现阳性。近年来已有不同方法检测自身免疫性肝病抗体，如间接荧光法，乌赫特朗尼式凝胶扩散法，血液凝聚法，放免法或酶标法。但上述方法不能在免疫分析中同时对多个自身免疫性肝病抗体进行检测。技术实现要素：本发明的目的是提供一种自免肝抗体的多项检测试剂盒，以解决
背景技术：
存在的上述缺陷。本发明是通过如下的技术方案实现的：一种自免肝抗体的多项检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有复合微珠悬浮液、荧光标记物、样本稀释液、洗涤液的多个密封试剂瓶，(2)分隔并集中包装这些试剂瓶的试剂盒；微珠是大小均匀的聚苯乙烯微球，用不同的荧光染料对聚苯乙烯微球进行染色，从而获得不同编码(如1-100号)的微珠；所述复合微珠悬浮液中包含检测微珠、标准微珠、参考微珠和空白微珠，具体为：所述检测微珠是在不同编码的微珠表面分别包被不同的自身免疫性肝病抗原；所述标准微珠包含至少三种结合了不同浓度梯度人igg的微珠；所述参考微珠是结合了抗人igg的微珠；所述空白微珠是未加入任何抗原的微珠。优选的，所述微珠的直径为5-7微米，最好是5.6微米。所述自身免疫性肝病抗原包括：ssa52、anti-cenpb、ama-m2、actin、lkm-1、sp100、gp210、nup62、pml、lc-1和sal/lp。作为优选的技术方案，所述荧光标记物是藻红蛋白标记的羊抗-人igg(特异性γ链)。所述样本稀释液是含磷酸盐的缓冲液。优选的，样本稀释液中各组分的组成及含量如下：所述洗涤液的组分与所述样本稀释液相同，浓度是它的8-10倍。作为优选的技术方案，本发明自免肝抗体的多项检测试剂盒中还包括装有质控品的试剂瓶，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品是含有与所述检测微珠中包含的自身免疫性肝病抗原相对应的抗体的人混合血清，所述阴性质控品是对自身免疫性肝病抗原相对应抗体阴性的人阴性血清。所述阳性质控品的浓度范围具有批间特异性，即每一批试剂有其自己的浓度范围。所述复合微珠悬浮液的制备方法，包括如下步骤：使用不同编码的微珠分别包被不同的自身免疫性肝病抗原，混合制成检测微珠，然后和标准微珠、参考微珠、空白微珠一起转移至样本稀释液并混合，得到所述复合微珠悬浮液。所述检测微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，按照每毫升微珠中包含10-100ug抗原的比例加入任意一种自身免疫性肝病抗原，充分混合。包被不同自身免疫性肝病抗原，需要使用不同编码的微珠。所述微珠活化液，是将1000单位体积微珠加入反应管，加入5-50单位体积edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和5-50单位体积sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化而成。不同检测项包被不同抗原，且需要使用不同编码的微珠。所述标准微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，然后按照每毫升微珠中包含2-18ug人igg(免疫球蛋白g)的比例加入人igg，充分混合。三种或三种以上标准微珠中人igg的含量在2-18ug的范围内均匀的依次递增。例如，当采用3种标准微珠时，人igg的浓度分别为2-5ug/ml、6-10ug/ml、12-18ug/ml。所述参考微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，然后按照每毫升微珠中包含8-15ug抗人igg的比例加入抗人igg，充分混合。所述空白微珠即没有加入任何抗原的微珠活化液。本发明自免肝抗体的多项检测试剂盒的创新点在于，可以在同一时间同一孔内对一个人血清样本做多个自身免疫性肝病抗体的检测。自身免疫性肝病作为一种发病机理不明的疾病与许多疾病有关联，且由于最初的临床症状与病毒性肝炎症状相似，临床上诊断比较困难。因此，准确及时地监测出自身免疫性肝病的特异性自身抗体无疑对诊断以及进一步治疗具有重要意义。本发明无疑是为自身免疫性肝病患者提供了一个有效的实验室检测手段。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行阐述，但并不限制本发明。实施例1：本发明自免肝抗体的多项检测试剂盒的具体制备过程如下：1、制备样本稀释液配制8l的配方如下：编号试剂名称浓度1nacl8.0g/l2na2hpo4·12h2o2.9g/l3kcl2.4g/l4kh2po42.4g/l5tris0.3g/l6nan30.5g/l2、微珠的活化取1ml5.6微米的微珠(美国luminex公司的聚苯乙烯微球)加入1.5ml离心管中，加入5-50uledc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和5-50单位体积sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)进行活化，得到微珠活化液。以上微珠活化液制作16份，每一份均使用不同编码的微珠。3、复合微珠悬浮液的制备取11份微珠活化液，分别加入一种自身免疫性肝病抗原10-100ug，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。上述自身免疫性肝病抗原分别如下：ssa52、anti-cenpb、ama-m2、actin、lkm-1、sp100、gp210、nup62、pml、lc-1和sal/lp。制成检测微珠。取3份微珠活化液，分别标记为标准微珠1、标准微珠2和标准微珠3，校准微珠1中加入2-5ug/ml的人igg，校准微珠2中加入6-10ug/ml的人igg，校准微珠3中加入12-18ug/ml的人igg，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成标准微珠。取1份微珠活化液，加入8-15ug/ml的抗人igg，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。制成参考微珠。取1份微珠活化液，不加入任何抗原作为空白微珠。将上述各微珠抽滤洗涤，经洗涤后的微珠转移至样本稀释液中，混合，最后用样本稀释液定容至120ml。检验合格后，分装成20瓶，每瓶5.5ml。3、荧光标记物：藻红蛋白标记的羊抗-人igg(igg-pe)：初始浓度1mg/ml。用样本稀释液稀释至工作浓度即可。工作浓度为0.6mg/l。4、浓缩液：组分及配方和样本稀释液相同，浓度是它的10倍。即本来配成8l,现在配成800ml。5、质控品：阳性质控品：将含有上述多种自身免疫性肝病抗原阳性血清混合，获得分析物阳性的人混合血清，测定阳性分析物的浓度范围，每一批试剂有其特异的浓度范围。阴性质控品：将阴性血清混合，获得阴性质控品。6、将上述配制好的复合微珠悬浮液、荧光标记物、样本稀释液、洗涤液、质控品分别装入试剂瓶中，然后采用试剂盒分隔并集中包装这些试剂瓶。实施例2：本发明自免肝抗体的多项检测试剂盒在人血清样本中同时检测多个自身免疫性肝病抗体的具体应用。具体步骤如下：1.把各成分从储存条件中取出，避免强光，使之恢复至室温(20-25℃)。2.确定试验所需质控品和样本总的数量。阴性质控设在a1孔，阳性质控设在b1孔，每个质控和样本都需要一个微孔(见表1样本排列)。a.复合微珠悬浮液在使用前应彻底混匀以获得最佳读取结果时间。最有效的方法是将微珠悬浮液用混漩器振荡30秒，然后超声仪处理30秒。b.各试剂在使用时应彻底混匀。较合适的方法包括将微孔板放在混漩器上以约800rpm混匀30秒，或使用移液器吸取约1/2体积的反应液体反复吸打至少5次。表13.在稀释板中，按1：21稀释比例稀释阴性质控品、阳性质控品和每个病人的血清样本(例如：将10ul血清样本+200ul样本稀释液)。注意：正确的操作要求：样本和样本稀释液要混合均匀，可按上述注2b操作。4.在确定检测所需的微孔数后，使用多通道移液器或重复使用移液器在过滤板的每个孔中加入50ul复合微珠悬浮液。5.向过滤板的每孔中加入10ul经过1：21稀释后的样本和质控品。正确的操作要求：加入的物质要与孔中的复合微珠悬浮液混合均匀，可按上述注2b操作。6.过滤板置室温(20-25℃)温育30分钟。7.温育后，用真空抽滤泵按以下步骤对微珠进行洗涤。a.将过滤板放在真空抽滤泵的托盘上，打开真空抽滤泵，移除孔内溶液，只剩下微珠在板的底部。b.关闭真空泵，向过滤板的各孔内加入1x洗板液200ul。c.再次使用真空泵移除溶液。d.重复7b、7c步骤，总共需要进行三次洗涤。8.最后一次洗涤结束后，轻轻吸干过滤板的底部，在下一步操作前，允许过滤板在空气干燥3-5分钟。9.在过滤板的每孔中加入150ul荧光标记物，按照样本加入的顺序和速率依次加入到过滤板中。正确的操作要求：加入的荧光标记物要与孔中的微珠混合均匀，可按上述注2b操作。作为一种选择，当加入荧光标记物混匀时，可以把混合物转移至一个空的聚苯乙烯反应板中。10.过滤板室温(20-25℃)温育30±10分钟。11.选择美国luminex公司的luminex200多功能流式点阵仪的自免肝抗体模板分析试验结果。可以从过滤板或反应板中读取结果。12.过滤板在荧光标记物温育完成后的60分钟内读取结果。读数之前振荡过滤板大约15秒。这个可选择的步骤可以减少读板所需的时间。本发明自免肝抗体的多项检测试剂盒实现了在同一时间同一孔内对一个人血清样本做多个自身免疫性肝病抗体的检测。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12