ECM1作为血清学检测肝纤维化的标志物及其应用的制作方法

本发明涉及诊断领域。更具体地，本发明涉及一种可用于检测肝纤维化的血浆或血清标记物及其用途。

背景技术：

肝纤维由于是可逆的，肝硬化是不可逆的过程，因此安全、无创的早期诊断在肝纤维化治疗过程中起到十分重要作用。

现有的对肝纤维化的诊断主要分为一下几种：1、肝活体组织病理学检查仍是目前诊断肝纤维化和肝硬化的金标准，但是却存在着患者死亡、局部不能反映整体等缺点。2、fibroscan等无创检测。fibroscan通过测定肝脏瞬时弹性图谱来反映肝实质硬度，通过测量肝脏硬度来判断肝脏纤维化的程度，并对肝纤维化进行准确分级。fibroscan经常需要与其他指标联合检测，并且由于受到病人腹水以及脂肪变形的影响，导致检测结果准确度稍有欠缺。3、血清学检测主要包括血清ⅲ型前胶原氨基端肽、血清层粘连蛋白、血清透明质酸、血清ⅳ胶原、基质金属蛋白酶等一系列指标，现有的血清学指标也存在特异性和准确性不高的缺点，因此无法成为肝纤维化检测的优秀指标。原因有如下几点：1)大部分直接的血清学指标是反应基质代谢速率，并且与炎症反应紧密相关，当机体存在炎症的时候不能特异性检测肝纤维化程度。2)大部分没有肝脏特异性。3)很大程度受到机体代谢的影响。为了提高血清学指标的准确率，近十年国内外学者建立了很多基于多种指标的诊断模型(fibrometer、apri、hepascore、fibrotest等)来提高血清学指标的准确性。鉴于现有的血清学指标具有以上的缺点，因此寻找一个高特异性的血清学标准物与现有的检测方法联合或者单独使用来提高肝纤维化的检测准确性在肝纤维化检测过程中具有十分重要的意义。

因此，本领域迫切需要开发可用于检测或判断肝纤维化的血浆或血清特异标志物，以及肝纤维化的诊断的准确的血清学检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种可用于检测或判断肝纤维化的血浆或血清特异标志物。

在本发明的第一方面，提供了细胞外基质蛋白1(ecm1蛋白)或其特异性抗体的用途，它们被(a)用于制备检测肝纤维化的诊断试剂或试剂盒；和/或(b)用于制备血浆或血清检测肝纤维化的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的ecm1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述的特异性抗体是单克隆抗体。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述诊断试剂是单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的检测肝纤维化是血浆或血清检测。

在另一优选例中，所述的血浆或血清检测是elisa法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法(trfia法)。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测肝纤维化的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有ecm1蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝纤维化。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

(i)如果检测对象的血浆ecm1浓度低于5ug/ml，则该对象发生肝纤维化的几率大于正常人群。

在另一优选例中，所述的ecm1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述的特异性抗体是单克隆抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种细胞外基质蛋白1(ecm1蛋白)的用途，它被用作血浆或血清检测肝纤维化的标志物。

在本发明的第四方面，提供了一种细胞外基质蛋白1(ecm1蛋白)的激动剂的用途，它被用于制备抑制肝纤维化的药物或用于制备抑制肝纤维化的抑制剂。

在另一优选例中，所述的激动剂包括：ecm1蛋白、crgd或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了小鼠ecm1基因的获得。m：marker；1-2：ecm1-pcdna3.1-fc。

图2显示了小鼠ecm1蛋白westernblot鉴定。m：marker；1：阴性对照；2：细胞上清。

图3显示了兔血清的proteing亲和层析纯化。图注m:marker；1：纯化的兔血清；2：未纯化的兔血清。

图4显示了纯化后抗体的活性检测。

图5显示了兔血清滴度测定。

图6显示了兔血清多抗蛋白浓度测定。

图7显示了小鼠elisa试剂盒检测范围的初步确定。

图8显示了小鼠elisa试剂盒的标准曲线。

图9显示了小鼠样品检测形式确定。图注wt：野生型小鼠，n＝5；he：杂合子小鼠，n＝5。

图10显示了小鼠血浆的稀释比例确定。

图11显示了不同类型小鼠的血浆中ecm1的含量水平。

图12显示了取12只小鼠进行ccl4造模4周，并且每周收集小鼠血浆，利用ecm1检测试剂盒检测血浆中的ecm1的含量。结果表明，随着ccl4造模深入，小鼠肝纤维化程度逐渐加深，小鼠血浆中的ecm1含量逐渐降低。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，血浆中ecm1蛋白的含量在肝纤维化的过程中逐渐下降。因此，利用血浆中ecm1蛋白含量与肝纤维化发生和发展程度的相关性，血浆或血清ecm1可以作为检测肝纤维化的标志物。在此基础上完成了本发明。

ecm1蛋白和基因

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“ecm1蛋白”、“ecm1多肽”或“细胞外基质蛋白ecm1”可互换使用，都指具有小鼠细胞外基质蛋白ecm1氨基酸序列(genbank:aai45382.1)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的细胞外基质蛋白ecm1。此外，该术语还包括全长的ecm1及其片段。本发明所指的ecm1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

在本发明中，术语“ecm1基因”、“ecm1多核苷酸”或“细胞外基质蛋白基因ecm1”可互换使用，都指具有小鼠ecm1核苷酸序列(geneid:13601)的核酸序列。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了ecm1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的ecm1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ecm1多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码小鼠ecm1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，ecm1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ecm1编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗ecm1的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对小鼠ecm1多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于小鼠ecm1基因产物或片段。较佳地，指那些能与小鼠ecm1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制小鼠ecm1蛋白的分子，也包括那些并不影响小鼠ecm1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的小鼠ecm1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab’或(fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子(ladner等人，美国专利no.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的小鼠ecm1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达小鼠ecm1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见kohler等人,nature256；495,1975；kohler等人,eur.j.immunol.6：511,1976；kohler等人,eur.j.immunol.6：292,1976；hammerling等人,inmonoclonalantibodiesandtcellhybridomas,elsevier,n.y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断小鼠ecm1蛋白功能的抗体以及不影响小鼠ecm1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用小鼠ecm1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与小鼠ecm1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如e.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗小鼠ecm1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是血浆样本)中的小鼠ecm1蛋白。

检测方法

利用ecm1存在于血浆或血清中，且与肝纤维化密切相关这一特点，本发明还提供了检测或判断肝纤维化的方法，尤其是血清学检测方法。

在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测血浆ecm1的elisa法以及时间分辨免疫荧光法(trfia)。

在本发明的另一个优选例中，本发明提供一种检测血清ecm1的elisa法以及时间分辨免疫荧光法(trfia)。

检测试剂盒

本发明还提供了一种检测肝纤维化的试剂盒，它含有本发明的抗ecm1的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。

本发明的小鼠肝纤维化血浆或血清学诊断试剂盒，已完成实验。

用本发明的小鼠肝纤维化的血浆学诊断试剂盒检测血浆中ecm1含量低于5ug/ml的小鼠的肝纤维化的发生几率明显增高。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的ecm1的激动剂，以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物可用于抑制肝纤维化。

ecm1蛋白可以作为抑制肝纤维化的药物。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于抑制肝纤维化。此外，还可与其他肝纤维化治疗剂联用。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的ecm1激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的ecm1拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

抑制或促进肝纤维化的方法和组合物

本发明还提供了ecm1拮抗剂及其在促进肝纤维化中的用途，尤其是在制备促进肝纤维化的促进剂或组合物的用途。在本发明中，用ecm1拮抗剂或含该拮抗剂的组合物，可以促进肝纤维化。

在一优选例中，提供了一种体外促进肝纤维化的方法，包括步骤：在ecm1拮抗剂存在下，培养肝细胞。

本发明还提供了ecm1激动剂及其在抑制肝纤维化中的用途，尤其是在制备抑制肝纤维化的抑制剂或组合物的用途。在本发明中，用ecm1激动剂或含该激动剂的组合物，可以抑制肝纤维化。

在一优选例中，提供了一种体外抑制肝纤维化的方法，包括步骤：在ecm1或ecm1激动剂存在下，培养肝细胞。

本发明的主要优点包括：

(1)首次提供了通过血浆或血清标志物检测和判断肝纤维化的方法，有助于早期检测或辅助检测肝纤维化，从而有助于尽早确诊并采取相应治疗措施；

(2)血浆或血清检测方法更方便快速，准确、无创、更容易为病人接受；

(3)便于动态监察非酒精性脂肪肝、hbv感染、hcv感染、酗酒患者的病情进展。

(4)价格便宜，病人依从性好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实验方法

1.rna抽提

(1)培养小鼠th2细胞，人thp1细胞数量近10⁷个/孔，弃去培养基后加入适量200μltrizol，用枪头把细胞从板上吹下，然后转移到1.5mlep管中；

(2)加入氯仿200μl，用力振摇15秒。15－30℃下孵育2-3min，离心(4℃，12000g，15min)；

(3)离心后液体分为三层，小心吸取上层无色液体移入一新的ep管中；

(4)加入等体积异丙醇混匀，-20℃下孵育30min，离心(4℃，12000g，10min)；

(5)去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，轻微振荡15sec，离心(4℃，7，500g，5min)；

(6)小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min，最好是用枪头吸取上清，尽量除去；

(7)加入40μldepc水溶解rna。

2.cdna反转

使用tokobo反转录试剂盒进行反转录；

3.ecm1基因的克隆

小鼠ecm1引物序列

鼠-ecm1-正义链(sense)：5'atttgcggccgcaccatggggaccgtatccagagcagcct3'(seqidno.:1)

鼠-ecm1-反义链(anti)：5'cgcggatccttcttccttggacccaggggcg3'(seqidno.:2)

使用高保真性和高扩增效率的dna聚合酶primestarhsdnapolymerase(takara)对目的基因进行pcr扩增。其反应体系如下：

pcr反应程序如下：

4.构建ecm1pcdna3.1分泌性表达载体

扩增mouse-ecm1基因，mouse-ecm1和human-ecm1正反向5’端分别引入noti和bamhi两个酶切位点，分别通过限制内切酶双酶切，连接到同样双酶切处理的pcdna3.1-fc表达载体上。

双酶切的体系如下

连接体系

16℃连接30min或者4℃连接过夜

5.转化

(1)取50μldh5α加到连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min；42℃热激45s，然后快速将试管转(2)移到冰浴中3min；加入500μl未添加抗生素的lb液体培养基，37℃，200转/分钟培养1h，使细菌复苏；

(3)菌液涂布平板，将平板置于37℃至液体被吸收，倒置过夜；

(4)挑取菌落，37℃培养8h。利用pcr验证阳性克隆，阳性克隆进行测序；

(5)根据测序结果，将正确克隆保甘油菌(菌液：20％甘油＝1:1)，-70℃保存。

6.利用favorpreptm离心柱型质粒小提试剂盒抽取质粒

(1)向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl溶液fapd1(以1-4mllb菌体量为例)，使用移液器彻底悬浮细菌沉淀。

(2)向离心管中加入200μl溶液fapd2，立即轻柔颠倒离心管10次，混匀溶液至溶液透明粘稠，室温放置2min。

(3)向离心管中加入300μl溶液fapd3，立即温和颠倒离心管数次至出现大量白色絮状沉淀。最高转速离心5分钟。

(4)小心将上清转移至吸附柱中，最高转速离心30s。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重放回收集管中。

(5)向吸附柱中加入400μl溶液w1，最高转速离心30s，倒掉废液收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入600μlwash溶液，最高转速离心30s。倒掉废液收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，最高转速离心3min，尽量除去残留的溶液。

(7)小心取出吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱的膜中央加入50μl灭菌水。室温放置2min后，最高转速离心1min。

7.cho-s细胞无血清悬浮培养瞬时转染表达ecm1蛋白及纯化

(1)转染之前24h，cho-s细胞密度达到1.2-1.5x10⁶/ml，培养液稀释到5-6x10⁵cells/ml。摇瓶固定在旋转振荡器上。120-135rpmat37℃，8％co2，悬浮培养。

(2)转染当天，细胞计数，密度达到1.2-1.5x10⁶/ml，稀释到1x10⁶/ml，培养液体积用新鲜的无血清培养液加至150ml。

(3)用optiprotmsfm稀释200μg含有编码ecm1基因的pcdna3.1分泌性表达载体至2.5ml，准备单独的管子，用optiprotmsfm稀释200μlfreestyletmmax转染试剂至2.5ml，轻轻混匀，立即将两只管子的液体混合，轻轻地混匀，室温放置10min。

(4)缓慢的将混合物加到细胞培养液里面，一边加，一边慢慢地摇动转瓶。120-135rpmat37℃，8％co2。

(5)72h后，收集细胞培养上清。

8.proteing亲和层析纯化带fc标签的ecm1蛋白

(1)取2ml上一步收集的细胞上清，50％饱和硫酸铵沉淀初步纯化后，用紫外分光光度计测蛋白浓度；

(2)装2mlproteing-sepharose4b柱子，并用约10mlpb平衡；

(3)初步纯化后的蛋白上柱，并反复循环；

(4)pb洗脱未结合于柱的蛋白，测蛋白浓度，直至洗脱液内无蛋白为止；

(5)用0.1mol/lph2.7glycine洗脱结合在柱上的ecm1蛋白，同时洗脱下来的液体用1mph9.0tris-hcl中和，使其ph值为中性；

(6)收集洗脱液，测蛋白浓度；

(7)用pb洗涤柱子，使柱子的ph值为7.0左右；

(8)20％乙醇保存柱子。

9.单抗腹水制备

取经产f1代小鼠，于腹腔注射0.5ml降植烷(pristane)。7-10天后，再次腹腔注射0.5ml1×10⁶杂交瘤细胞。每天观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。

10.杂交瘤细胞的冻存与复苏

冻存：

(1)挑选生长状态良好的细胞，去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入完全培养液使细胞

悬浮：

(2)1000rpm离心10min，去上清。加入冻存液制成细胞悬液，使成1.0×10⁷细胞/ml；

(3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上；

(4)将细胞悬液分装冻存管，每瓶0.5-1.0ml；

(5)放-70℃冰箱；

(6)一周后，转入液氮罐内。

复苏：

(1)从液氮罐中取出冻存管，立即放37℃水浴中速溶；

(2)无菌操作打开冻存管，取出细胞悬液，转入含10ml完全培养液的离心管内；

(3)离心，1000rpm，3min；

(4)弃上清，加入完全培养液后混匀，转入培养瓶内，37℃二氧化碳培养箱内培养。

11.多克隆抗体制备

用于免疫的新西兰大白兔为健康雄性,体重为2～3kg。取ecm1500μg用1mlpbs稀释,加等体积弗氏佐剂充分乳化后,于兔背部皮下多点注射。第一次基础免疫用弗氏完全佐剂,以后的加强免疫用弗氏不完全佐剂。每次免疫间隔2周。每次免疫后10d在兔耳缘静脉抽取少许血,分离血清,检测免疫效果。在血清效价达到1∶40万以上时,从颈动脉放血,分离血清，7℃放置1h，之后4℃过夜，待血块充分收缩后迅速收集血清，并于4℃下2500rpm离心20min,收集上清与前面的血清混合，再于4℃下1500rpm离心20min，收集上清液并分装，-80℃冻存备用。

12.proteing亲和层析

(1)取2ml抗ecm1蛋白的杂交瘤腹水，50％饱和硫酸铵沉淀初步纯化后，用紫外分光光度计测蛋白浓度；

(2)装2mlproteing-sepharose4b柱子，并用约10mlpb平衡；

(3)初步纯化后的蛋白上柱，并反复循环；

(4)pb洗脱未结合于柱的蛋白，测蛋白浓度，直至洗脱液内无蛋白为止；

(5)用0.1mol/lph2.7glycine洗脱结合在柱上的抗体，同时洗脱下来的液体用1mph9.0tris-hcl中和，使其ph值为中性；

(6)收集洗脱液，测蛋白浓度；

(7)用pb洗涤柱子，使柱子的ph值为7.0左右；

(8)20％乙醇保存柱子。

13.抗体生物素标记

(1)计算加入生物素试剂量：按照每mol蛋白对应20mol生物素(biotin)计算，1ml2mg/ml的蛋白需要生物素试剂量：

1.计算配置20mol的biotin溶液所需要的biotin的量。

ml蛋白×(mg蛋白/ml蛋白)×(mmol蛋白/mg蛋白)×(20mmol生物素/mmol蛋白)＝mmol生物素

2.计算标记特定蛋白所需要的10mm的biotin的量。

mmol生物素×(1,000,000ul/l)×(l/10mmol)＝ul生物素

(2)配置biotinreagent试剂：向biotinreagent粉末中加入180μlddh2o，得到10mm的biotinreagent；

(3)加入8.6μlbiotinreagent至0.3mg/ml1ml纯化的单抗，4℃反应2h；

(4)4℃，用1x(一倍浓度)pbs过夜透析，换2-3次液。

(5)使用10kd超滤管进行过量biotinreagent除去，4℃，600rcf，5min。

14.基于双夹心的配对elisa的方法鉴定表位

(1)包被抗体：用包被液将包被抗体作适当稀释，浓度为10μg/ml，100μl/孔，4℃放置16～18小时。

(2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复三次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗液流尽。

(3)封闭：1％bsa封闭液200μl/孔，37℃放置2小时。

(4)洗涤：同2。

(5)加样：加入系列浓度的抗原(1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml)，100μl/孔，同时加入无关蛋白bsa作阴性对照，37℃反应2小时。

(6)洗涤：同2。

(7)二抗：生物素标记的另一个单克隆抗体，100μl/孔，37℃反应2小时。

(8)洗涤：同2。

(9)显色：加底物tmb，100μl/孔，室温下避光反应10-15min。

(10)终止反应：加终止液2mol/l浓h2so4，100μl/孔。

(11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

15.棋盘法测定配对抗体的工作浓度

对包被抗体与检测抗体分别做1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120的梯度稀释，采用棋盘法同时对双夹心elisa的被抗体与检测抗体的浓度进行优化，一般情况下，elisa方法条件的优化标准是以阳性孔吸光度值接近于1，同时，阴性对照空吸光度值较小，且阳性孔与阴性孔吸光度比值最小时为反应的最佳条件。

16.夹心elisa方法的建立

夹心酶联免疫吸附试验(elisa)

(1)包被抗体：用包被液将包被抗体作适当稀释，浓度为100μg/ml，100μl/孔，4℃放置16～18小时。

(2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复两次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

(3)封闭：封闭液200μl/孔，37℃放置2小时。

(4)洗涤：同2。

(5)加样：加入系列浓度的抗原(1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml)，100μl/孔，同时加入无关蛋白bsa作阴性对照，37℃反应2小时。

(6)洗涤：同2。

(7)二抗：生物素标记的另一个单克隆抗体，100μl/孔，37℃反应2小时。

(8)洗涤：同2。

(9)显色：加底物tmb，100μl/孔，室温下避光反应10-15min。

(10)终止反应：加终止液2mol/l浓h2so4，100μl/孔。

(11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

17.检测灵敏度测定

灵敏度是指应用该法能检出待测物的最低量，即最小检出量，最小检出量越低，灵敏度越高，在酶联免疫试剂中，可用测“0”标准管的光密度值来确定，测定10个或10个以上“0”标准管，求出平均数，再加上两倍标准差所对应的待测物浓度为最低检测限。

18.检测线形范围测定

采用在测定范围内的多个浓度样品进行测定范围的研究，该样品浓度应平均分布于试剂盒的整个测定范围。

19.检测准确度(回收率)测定

某种方法测定结果接近真值的程度，称为该方法的准确度，常通过添加回收率试验进行评价，对于定量测定产品而言，可以采用对国际或国家标准品的测定、加入回收试验等方法，评价该产品的测定准确度。

20.检测精密度测定

精密度又称可重复性，反映测定方法对某一特定样本多次测定所得结果的重复程度，这是评定质量最基本的参数，精密度可以用变异系数(cv)表示。免疫测定的标准曲线比较复杂，通常不呈线性包括经过直线化处理的曲线，曲线中点附近斜率绝对值较大，测定准确度较高。在高浓度和低浓度端斜度变化较大，变异增加，限制了可测范围。

实施例1小鼠ecm1蛋白的获得

1.1小鼠ecm1基因的获得

以本实验室保存的th2细胞为模板，用mouse-ecm1-sense和mouse-ecm1-anti引物扩增出1600bp的片段，

pcr产物跑胶割胶回收后用noti和bamhi双酶切，连接到同样双酶切处理的pcdna3.1-fc表达载体上，转化大肠杆菌dh5α，质粒插入片段经菌液pcr验证，阳性克隆进行dna测序(测序由博尚生物有限公司完成)。从图1中可以看出，获得表达载体pcdna3.1-fc，表达片段长1600bp。

1.2pcdna3.1-fc-ecm1蛋白的表达纯化，westernblot鉴定

westernblot的方法验证小鼠ecm1表达情况。瞬时转染pcdna3.1-fc-ecm1质粒的细胞、瞬时转染pcdna3.1-fc质粒(阴性对照)的细胞上清，各10μl加上样缓冲液，煮沸，上样，加入loadingbuffer，sds电泳，转膜，封闭，洗涤后，加入小鼠ecm1单抗(够买于义翘神州)，孵育，显影。

从图2中可以看到转染了pcdna3.1-fc-ecm1质粒的细胞上清在110kd处有条带(泳道2)，转染了阴性对照质粒pcdna3.1-fc细胞上清在无明显条带(泳道1)，说明ecm1-fc表达成功。

实施例2多克隆抗体的制备

2.1protein-g亲和层析纯化

对免疫后的兔血清进行纯化后，将收集的纯化前样本、protein-g纯化后样本进行sds-page，检验纯化效果，见图3，纯化后的兔血清具良好的纯度和浓度。

2.2anti-mecm1兔血清纯化后性质鉴定

从图4中可以看出，纯化并且biotin标记的抗体的od值远远高于阴性对照组，表明纯化并且标记的抗体的亲和活性很好，没有受到纯化和biotin标记影响。

2.3anti-mecm1兔多抗滴度测定

采取了包被mecm1浓度10ng/ml，每个稀释度2个平行样，于聚苯乙烯板孔内加100μl，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次，封闭液100μl/孔，37℃2小时，洗涤缓冲液洗涤3次，酶标记抗体从1:1000倍比稀释，稀释8个梯度。抗体滴度的计算方法是高于空白对照组od450值加2倍对照组标准差的最高稀释度。由图5可知纯化后的多抗的效价为1：120,000。

2.4anti-mecm1兔多抗蛋白浓度测定

采用碧云天bca法蛋白测定试剂盒测定，并且测定标准曲线如图6所示，标准品和习惯度的线性关系良好，r²＝0.9984将anti-mecm1的吸光值代入得到兔多抗的浓度是2.1ug/ul。

实施例3elisa试剂盒制备

3.1抗体配对实验

利用义翘神州购买的小鼠ecm1单抗与已经进行biotin标记的兔多抗进行配对，利用纯化的ecm1作为抗原依次稀释到1000ng、100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng，检测义翘神州单抗作为捕获抗体，biotin标记兔多抗作为检测抗体的吸光值，并且初步确定配对抗体的检测范围是10ng/ml-0.1ng/ml，见图7。

3.2配对抗体的棋盘法优化

利用棋盘法确定包被抗体和检测抗体的最适合浓度，包被抗原的浓度是10ng/ml，选取od450nm值在2.0-1.5之间的孔所对应的抗体包被浓度和酶标抗体浓度为最适包被抗体和酶标抗体的工作浓度，由下表1可以看出包被抗体在1.1ug/ml，检测抗体在1ug/ml时候符合标准。

表1小鼠elsia试剂盒棋盘法优化

3.3试剂盒的标准曲线和灵敏度

利用实验室自己纯化的mecm1蛋白作为标准品对elisa试剂盒的线性范围进行检测，设置10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.31ng/ml、0.15ng/ml、0.075ng/ml。实验结果如图8所示，elisa试剂盒的检测范围是0.1ng/ml-10ng/ml，线性回归方程y＝5.3608x-1.4513，残差r²＝0.9953，参考检测灵敏度测定的方法。ecm1elisakit的灵敏度0.01ng/ml。

3.4准确度检测

将小鼠的血浆稀释1000倍，并且加入标准品浓度10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.31ng/ml、0.15ng/ml、0.075ng/ml，利用制备的kit对血浆中样品进行检测并且计算检出比例，结果如下表2所示。

表2小鼠elisa试剂盒添加回收实验

实施例4小鼠血浆样品检测

4.1确定小鼠血清、血浆的检测结果。

为了确定检测的小鼠样品的形式，实验中分别设置wt、he两组小鼠，每组小鼠分别取血浆和血清，稀释之后分别用实验室自制检测试剂盒进行检测，实验结果如图9所示。由于同一只小鼠的血浆中的ecm1的含量较血清含量高，为了更加方便的检测ecm1的含量，实验中采取小鼠血浆作为样品检测形式。

4.2确定小鼠血浆的稀释比例

将小鼠血浆梯度稀释，通过实验室制备kit检测不同稀释倍数下的吸光值，结果如图10所示，确定1:512作为小鼠血浆样品的合适稀释倍数。

4.3wt、he、基因敲出(ko)以及ccl4造模小鼠的血浆中ecm1含量比较

本发明中，设置四组小鼠每组中有5只小鼠，通过用实验室自制kit检测其血浆中ecm1的浓度，实验结果如图11所示：野生型(wt)小鼠浓度最高达到7.5ng/ml，而杂合子(he)和ccl4造模的小鼠的ecm1含量明显下降。表明在小鼠肝纤维化过程中其ecm1的含量明显降低。

4.4小鼠ccl4造模过程中连续采血检测ecm1含量

为了进一步验证ecm1在小鼠肝纤维化过程中含量的变化，实验中取12只小鼠作为实验对象对同一只小鼠在ccl4造模过程中每周采血一次一共持续5周，连续检测其在纤维化过程中血浆中ecm1的含量变化，实验结果如图12所示：在肝纤维化过程中小鼠血浆中ecm1的含量在逐渐下降。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海巴斯德研究所

<120>ecm1作为血清学检测肝纤维化的标志物及其应用

<130>p2017-0070

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atttgcggccgcaccatggggaccgtatccagagcagcct40

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgcggatccttcttccttggacccaggggcg31