禽流感病毒H5亚型Re-6株抗体鉴定试剂盒的制作方法

本发明属于动物疫病检测领域，涉及一种禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒。

背景技术：

禽流感（avianinfluenza）是由甲型流感病毒引起的动物传染病。根据其致病能力差异可分为高致病性型和普通型，h5亚型即属于高致病性病毒。我国目前防控禽流感病毒h5的主要疫苗毒株为h5re-6株、re-7株、re-8株等，批准的疫苗产品为单联苗或多联苗，来源于单个亚型毒株（如青岛易邦生物工程有限公司生产的重组禽流感病毒灭活疫苗（h5n1亚型，re-6株））或者多个亚型毒株（如哈药集团生物疫苗有限公司生产的禽流感二价灭活疫苗（h5n1re-6株+h9n2re-2株））。

为了监控疫苗免疫效果，准确评价免疫动物抗体效价，常采用免疫学方法如血凝和酶联免疫法（elisa）。实际生产中动物个体差异会导致其对多联疫苗的反应不同，血清中抗体总效价高不代表其对不同流感病毒多种亚型的抵抗能力强，还要进一步监测分析其针对不同亚型流感病毒的抗体效价，才能做到防控准确，降低禽流感爆发带来的风险。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒，其能够特异性地准确检测禽类血清中的禽流感病毒h5亚型re-6株抗体，为h5亚型禽流感防控策略提供参考。

本发明所提供的禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒，主要包括：

1）包被有禽流感h5亚型re-6株特异性抗原的酶标板；

2）辣根过氧化物酶标羊抗鸡igg抗体溶液；

3）h5亚型re-6株抗体阳性对照；

4）h5亚型re-6株抗体阴性对照；

5）显色底物；

6）终止液；

7）洗涤液；

8）样本稀释液。

其中所述的包被有禽流感h5亚型re-6株特异性抗原的酶标板中禽流感h5亚型re-6株特异性抗原为重组表达的禽流感h5亚型re-6株ha抗原，其是通过昆虫细胞杆状病毒表达系统重组表达获得。

进一步地，所述的禽流感h5亚型re-6株ha抗原基因来源于genbank公开序列经过人工突变筛选，其序列信息如seqidno.1所列，扩增所述ha基因所用引物为：

上游引物：5’-cgacccggggattgtagtgtagcaggatg-3’，

下游引物：5’-cgccagctgttccacttcacttttcataattg-3’。

所述辣根过氧化物酶标羊抗鸡igg抗体溶液为商品化抗体稀释后分装。

所述h5亚型re-6株抗体阴性对照为spf血清。

所述h5亚型re-6株抗体阳性对照为标准h5亚型re-6株阳性血清。

所述显色底物单组份tmb显色底物。

所述终止液为0.5m硫酸溶液。

所述洗液为添加有0.1%吐温-20的0.01mpbs（ph7.2）溶液。

本发明的另一个目的是提供上述禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：

1)禽流感h5亚型re-6株特异性抗原的制备

根据如seqidno1所列的ha基因序列，设计特异性引物，通过pcr技术扩增，并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pfastbac1中，构建含有h5re6ha基因的重组质粒，转化至含穿梭载体bacmid的受体菌dh10bace.coli感受态中，经半乳糖苷酶的蓝白斑筛选，获得重组杆粒，然后转染sf9细胞以获得重组杆状病毒，ha基因会随着杆状病毒的增殖而表达。表达产物经镍柱纯化后，sds-page电泳鉴定，可见与预期大小相符的目的条带。

2)禽流感h5亚型re-6株特异性抗原包被板的制备

包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释至1µg/ml，加入至酶标板条中，4℃过夜，pbst清洗一次，拍干后用5%bsa封闭，37℃2小时，拍干备用。

3)试剂盒其他组分的配液、分装及组装：

将制备的包被有禽流感h5亚型re-6株特异性抗原的酶标板用铝箔袋真空密封；

商品化辣根过氧化物酶标羊抗鸡igg抗体稀释后添加稳定剂定量分装；

取spf鸡血清定量分装作为h5亚型re-6株抗体阴性对照；

取标准h5亚型re-6株阳性血清定量分装作为h5亚型re-6株抗体阳性对照；

取商品化的单组份tmb底物液分装；

取终止液、样本稀释液、洗涤液等分装；

打印标签，并粘贴至各个组分瓶体或包装袋上，继续与试剂盒操作说明书、质控报告等放置于试剂盒外包装盒中。至此，禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒制备完毕。

本发明还涉及一种使用禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒检测血清中禽流感病毒h5亚型re-6株抗体的检测方法，包括如下步骤：

第一步，将待测血清样本按照一定比例稀释备用；

第二步，将准备好的样品按照检测试剂盒的操作方法进行操作；

第三步，利用分析软件分析数据，判断结果。

本发明提供的禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层兽医实验室检测应用。

与传统方法相比，本发明具有以下有益效果：

1）所需原料制备简单、易于获取。

2）检测无需特殊设备、耗时短、效率高。基层实验室无需自行包被酶标板，稀释好检测样本后可直接检测；检测孵育温度为室温，无需购买恒温孵育箱；整体检测时间即酶联吸附检测的反应时间不超过1h；利用酶标板96孔检测，做双孔平行，可以单次实验中同时检测至少40份样本，效率高。

3）检测灵敏度高，结果可靠。

本发明提供的禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒在当前禽流感防控形势复杂的前提下，具有非常广阔的市场前景，可在基层兽医实验室检测和政府疫情监控中发挥重大作用。

附图说明

图1为禽流感h5亚型re-6株特异性抗原纯化鉴定图，其中m为分子量marker，1、2、3、4代表不同纯化时间收集的ha抗原。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性质，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。下列方法如无特殊说明均为常规方法，试剂、仪器、设备等如无说明，均可从商业来源获得。

实施例1禽流感h5亚型re-6株特异性抗原的制备

(1)设计引物：针对如seqidno.1所列的ha基因序列设计并合成了一对引物，上游引物为5’-cgacccggggattgtagtgtagcaggatg-3’，

下游引物为5’-cgccagctgttccacttcacttttcataattg-3’；

(2)pcr扩增：反应体系：tsingke金牌mix45µl、上下游引物（10µm）各2µl、模板质粒1µl，反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸20s，循环30次，最后72℃延伸1min。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带。

(3)双酶切：目的片段酶切体系：目的片段47.5µl、限制性内切酶smaⅰ1µl、pvuⅱhf1µl、cutsmartbuffer5.5µl，载体pfastbac1酶切体系：载体15µl(1.5µg)、限制性内切酶smaⅰ1µl、pvuⅱhf1µl、cutsmartbuffer5.5µl、ddh2o31.5µl。反应条件：先加smaⅰ25℃反应1h,再加pvuⅱhf37℃反应0.5h。目的片段酶切产物用产物回收试剂盒回收，载体酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带。

(4)连接：反应体系：插入体7µl、消化过的载体1.5µl、t4连接酶0.5µl、t4连接酶缓冲液1µl，反应条件：常温反应0.5h。

(5)转化dh5αe.coli：将连接物加入到100µldh5αe.coli感受态中，冰上孵育0.5h，42℃热激90s，再在冰上孵育2m，加lb无菌液体培养基至1ml，放置于摇床中摇45m，摇床参数设置为220rpm、37℃，然后离心弃掉大部分上清，剩余液体重悬菌体后涂板，固体培养基抗性为ampicillin。将平板放置于37℃生化培养箱中倒置培养过夜。

(6)pcr鉴定：挑取单克隆，用pfastbac通用引物进行pcr，pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪中观察结果，挑阳性克隆扩培，提质粒送测序公司测序。

(7)转化dh10bace.coli：将序列正确的重组质粒加到100µldh10bace.coli感受态细胞中，冰上孵育0.5h，42℃热激90s，再在冰上孵育2m，加lb无菌液体培养基至1ml，放置于摇床中摇4h，摇床参数设置为220rpm、37℃,取部分菌液涂三抗板，37℃培养36-48h,固体培养基中含有：kanamycin50µg/ml、tetracycline10µg/ml、gentamicin7µg/ml、x-gal100µg/ml、iptg40µg/ml。

(8)获得单克隆：挑取单个白斑在上述三抗板中划线，37℃培养36-48h后，挑白色单克隆摇菌，大提质粒为重组杆粒，-20℃保存。

(9)转染sf9细胞：①在组织培养皿中接入sf9细胞，静置贴壁；②取1µg质粒加入到200µl无添加的grace培养基中为a液，取12µlcellfectinreagent加入到grace培养基中静置30m为b液；③将b液加到a液中混匀，静置30m；④将混合物加到sf9细胞培养基中，混匀，27℃培养3-5h,换为sfⅱ-900培养基培养；

(10)观察病变并传代：72h后观察是否病变，病变明显说明已获得重组杆状病毒，取上清保存为第一代p1，接种sf9细胞传代。

(11)表达及纯化：接种少量重组杆状病毒液到200mlsf9细胞悬液中，悬浮培养，待病变明显时收集上清过镍柱纯化，纯化步骤：①平衡镍柱；②细胞培养上清过镍柱；③洗镍柱；④洗脱；⑤透析脱咪唑，测定浓度后分装，-80℃保存。

(12)鉴定：纯化所得蛋白sdspage电泳，目的条带明显。

实施例2禽流感h5亚型re-6株特异性抗原包被板的制备

(1)配制包被溶液（ph9.6的0.02m碳酸盐缓冲液）。

(2)将禽流感h5亚型re-6株特异性抗原用包被液稀释至1µg/ml，50µl/孔分装至酶标板条中，4℃过夜。

(3)pbst（含有0.1%吐温-20的0.01mpbsph7.2溶液）洗涤一次（300µl/孔）后拍干。

(4)封闭液（含质量体积比为5%bsa的pbs）封闭（200µl/孔），37℃2小时，弃去封闭液后拍干，铝箔袋分装4℃保存。

实施例3禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒组装

禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒试剂包括：抗原包被板、酶标抗体溶液、样本稀释液、阴性对照、阳性对照、tmb显色液、终止液、25倍浓缩洗液、试剂盒使用说明书，制备过程如下：

(1)将制备的包被有禽流感h5亚型re-6株特异性抗原的酶标板用铝箔袋真空密封；

(2)取spf鸡血清用样本稀释液1:100稀释，定量分装至瓶中，作为阴性对照；

(3)取标准h5亚型re-6株阳性血清用样本稀释液1:100稀释，定量分装至瓶中，作为阳性对照；

(4)取商品化酶标抗体（购买于美国sigma公司），用hrp稳定剂（购买于湖州英创生物科技有限公司）稀释5000倍，定量分装至瓶中；

(5)取商品化的tmb底物液（购买于北京梅科万德生物科技有限公司）定量分装至瓶中；

(6)配制2mh2so4终止液,定量分装至瓶中；

(7)配制0.01mph7.2的pbs溶液为样本稀释液，配制25倍浓缩洗涤液（含有0.1%0.1%吐温-20的0.25mpbsph7.2溶液），分别分装至瓶中；

(8)打印标签，并粘贴至各个组分瓶体和铝箔袋上，与使用说明书一起放入包装盒内，4℃保存。

实施例4禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒检测标准血清

使用自制试剂盒同时检测禽流感h5亚型re-6、re-7、re-8、禽流感h7亚型、禽流感h9亚型、新城疫ndv标准血清（购买于哈尔滨维科生物技术开发公司和中国兽医药品监察所），验证禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒的特异性。

(1)将试剂盒中的包被板及试剂放置室温平衡；

(2)用样本稀释液（0.01mph7.2的pbs）稀释spf鸡血清（1:100）做阴性对照，稀释h5亚型re-6、re-7、re-8标准血清（1:100）,加入抗原包被板中（50µl/孔），将包被板放置37℃培养箱，孵育25分钟；

(3)拍干包被板内液体，用洗涤液清洗三遍（300µl/孔），试剂盒内的洗涤液需用纯水稀释25倍后使用，洗板后液体拍干；

(4)检测孔中加入50µl酶标抗体，放置37℃培养箱，孵育25分钟；

(5)重复步骤3；

(6)检测孔中加入50µltmb底物溶液，室温（20℃-25℃）孵育10分钟；

(7)检测孔中加入50µl终止液终止反应，立即用酶标仪（购买于thermo公司）读取od450数据，并以阴性对照od值的2倍作为临界值，大于等于临界值为阳性，小于临界值为阴性。

具体检测结果如下表：

表1

上述结果可见，h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒可以明确区分h5的三种re-6、re-7、re-8亚型，并且与h7、h9及ndv无明显交叉反应。

实施例6使用禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒检测临床样本

用自制的禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒检测临床收集的血清样本，并与禽流感抗体血凝抑制实验（hi）结果作对比（结果见表2），其中35份hi效价>2⁵的血清中，elisa检出阳性率100%；6份hi效价>2²中elisa检出2份阳性，4份阴性，综合来看，hi和自制elisa阳性符合率为100%，总体符合率为95.12%。

表2

序列表

<110>北京纳百生物科技有限公司

北京市动物疫病预防控制中心

<120>禽流感病毒h5亚型re-6株抗体鉴定试剂盒

<130>f0099

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1704

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>1

atggagaaaatagtgcttcttcttgcagtggttagccttgttaaaagtgatcagatttgc60

attggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacgataatggaaaaaaacgtc120

actgttacacatgcccaagacatactggaaaagacacacaacgggaggctctgcgatctg180

aatggagtgaaacctctgattttaaaggattgtagtgtagctggatggcttcttggaaac240

ccaatgtgcgacgagttcatcagagtgccggaatggtcttacatagtggagagggctaac300

ccagccaatgacctctgttacccagggaacctcaatgactatgaagaactgaaacaccta360

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