神经自身免疫疾病的诊断的制作方法

本发明涉及一种诊断疾病的方法，该方法包括检测患者的包含抗体的样品中自身抗体的步骤，所述自身抗体与选自nsf、stx1b和vamp2的多肽结合，本发明还涉及包含选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽或其变体的多肽，所述多肽用于诊断疾病的用途，与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体，自身抗体用于诊断疾病的用途，用于分离与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体的方法，包含根据本发明的所述多肽的药物组合物或医学装置，用于诊断疾病的试剂盒，该试剂盒包含所述多肽或所述医学装置，以及所述多肽或自身抗体用于制备试剂盒或医学装置的用途。

背景技术：

开发用于神经系统疾病的诊断系统是生物医学科学中的一项持续的挑战，这在较大程度上是因为所遇到的许多症状可以由极其多样的原因(包括基因遗传疾病、药物滥用、营养不良、感染、损伤、精神性疾病、免疫缺陷和癌症)来解释说明。

由于神经系统疾病很少与临床症状的独特的特征性模式相关联，所以通常难以仅基于受影响的患者的观察和检查或者其医疗史来提供可靠的诊断。

早期诊断的重要性怎么强调都不为过。许多神经系统病症，最显著地，阿尔茨海默病和帕金森病以及多发性硬化，不能被治愈，但是可以用于减缓其进展的药物是可得的。此外，某些罕见类型的癌症与神经系统症状有关。诊断得越早，为了患者的充分益处而利用可获得的治疗谱的机会就越好。

这在与自身抗体相关的神经系统疾病的情况下更是如此。在一些情况下，特异性的可检测的自身抗体与病况之间的关联足够强从而允许进行即刻的诊断。

但是，即使不是这样，自身抗体的检测可以向主治医师指明可以用于改善患者病况的治疗手段。存在各种各样的广泛使用的免疫抑制剂，其可以不管自身抗体靶标的性质而进行使用。备选地，单采血液成分术可以用于从患者的血液中除去自身抗体。在许多情况下，患者在神经系统的自身免疫疾病的早期诊断和治疗后继续过正常的生活。

基于自身抗体检测的诊断测定还可以确证除了与自身抗体相关的那些疾病之外的其他疾病的诊断。如果结果是血液样品没有特异性自身抗体，这可能帮助主治医师排除一系列的可能性并因此缩小似乎可能的病况的范围。

与自身抗体的出现相一致的神经系统病况的实例包括：视神经脊髓炎(一种以视觉感知和脊髓功能的丧失为特征的疾病)，和抗-nmda受体脑炎(其与自主神经功能障碍相关)，通气不足，小脑性共济失调，轻偏瘫，意识丧失，或紧张症。虽然自身抗体的参与和这些病况本身的性质以前了解得很少，但是由于基于自身抗体检测的测定的可得性，此类疾病中的许多现在可以被诊断和有效地治疗。

因此，最重要的是开发新的方法来区分与自身抗体相关的神经系统疾病和非自身抗体相关的神经系统疾病。

wo1997/021729和us5693476公开了nsf、突触融合蛋白和vamp蛋白用作人工形成的复合物的一部分来鉴定调节突触传递的物质，但它们没有公开与选自nsf、stx1b和vamp2的多肽结合的自身抗体的存在，更不用说所述自身抗体的诊断有用性。

nicot等人报道在鼠实验性自身免疫脑炎中，stx1b的转录和蛋白水平下降(nicota,ratnakarpv,rony,chencc,elkabess.regulationofgeneexpressioninexperimentalautoimmuneencephalomyelitisindicatesearlyneuronaldysfunction.brain.2003feb；126(pt2):398-412)，但没有公开与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体的存在，更不用说所述自身抗体的诊断有用性。

hirai等人通过针对分泌性囊泡相关蛋白质体外转录/翻译免疫沉淀方案报道在21％的患有1型糖尿病的患者中针对vamp2的自身抗体(hiraih,miuraj,huy,larssonh,larssonk,lernmarka,ivarssonsa,wut,kingmana,tzioufasag,notkinsal.selectivescreeningofsecretoryvesicle-associatedproteinsforautoantigensintype1diabetes:vamp2andnpyarenewminorautoantigens.clinimmunol.2008jun；127(3):366-74)。在同一份报道中，作者公开他们没有检测到任何针对stx1a的抗体，stx1a是一种与stx1b具有97.6％同源性的蛋白质。他们没有公开与选自包含nsf和stx1b的组的多肽结合的自身抗体的存在，更不用说所述自身抗体的诊断有用性。此外，与vamp2结合的自身抗体没有被认为是用于诊断神经疾病的标志物。

技术实现要素：

作为本发明之基础的问题是提供新的试剂、装置和方法，其可以用于支持自身免疫疾病(优选神经系统或与神经系统疾病或神经系统症状相关的自身免疫疾病，更优选选自包含僵人综合征和脑炎的组、优选脑炎)的诊断和治疗。

作为本发明之基础的另一个问题是提供新的试剂、装置和方法，其可以用于区分自身免疫疾病(特别是神经系统的自身免疫疾病，更优选选自包含僵人综合征和脑炎的组、优选脑炎)和除了自身免疫疾病之外的其他疾病，这在较大程度上是为了确定最有希望的治疗方案，更具体地，免疫抑制治疗是否适度。

作为本发明之基础的问题通过所附的独立权利要求和从属权利要求的主题而得到解决。

在第一方面，该问题通过用于诊断疾病的方法来解决，该方法包括检测患者的包含抗体的样品中与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体的步骤。

在第二方面，该问题通过多肽来解决，该多肽包含选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽或其变体，所述多肽优选是经固定化的，更优选固定在固体载体上。

在第三方面，该问题通过根据本发明的多肽用于诊断疾病的用途来解决，该用途优选包括检测样品中与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体的步骤。

在第四方面，该问题通过用于治疗疾病的根据本发明的多肽来解决。

在第五方面，该问题通过自身抗体、优选与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的分离的自身抗体来解决，其中所述抗体优选与根据本发明的多肽复合。

在第六方面，该问题通过根据本发明的自身抗体用于诊断疾病的用途来解决。

在第七方面，该问题通过用于分离自身抗体的方法来解决，所述自身抗体与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合，该方法包括以下步骤：

a)使包含该自身抗体的样品与根据本发明的多肽在与复合物形成相容的条件下相接触，其中所述自身抗体与所述多肽结合，

b)分离在步骤a)中形成的复合物，

c)解离步骤b)中分离的复合物，以及

d)将该自身抗体与该多肽分开。

在第八方面，该问题通过包含根据本发明的多肽的药物组合物、或医学装置、优选诊断装置来解决。

在第九方面，该问题通过用于诊断疾病的试剂盒来解决，所述试剂盒包含根据本发明的多肽或根据本发明的医学装置，其中优选该试剂盒另外包含用于检测包含根据本发明的多肽和/或与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的抗体的复合物的工具。

在优选实施方案中，患者具有与一种或多种、优选两种或更多种选自包含以下的组的症状或者所述疾病与一种或多种、优选两种或更多种选自包含以下的组的症状相关：躯干肌(包括胸腰椎旁肌和腹肌、腹壁肌和近腿肌)进行性僵硬，强直步态，腰椎过度前凸，慢性疼痛，近端肢体和轴向肌肉痉挛，对触摸和声音敏感，过度惊骇，肌阵挛，抑郁，焦虑，恐惧症，发烧，头痛，意识错乱，构音障碍，吞咽困难，眼震，振动幻视，眩晕，恶心，共济失调，感觉异常，肌肉萎缩，头晕，发作，癫痫和震颤。

在第十方面，该问题通过根据本发明的多肽或根据本发明的自身抗体或针对来自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的抗体或根据本发明的医学装置用于制备试剂盒、医学装置的用途来解决，所述医学装置优选诊断装置，所述诊断装置优选用于诊断疾病。

在优选实施方案中，疾病是神经系统疾病，优选神经系统的自身免疫疾病，更优选选自包含僵人综合征和脑炎的组，优选脑炎。在优选实施方案中，根据本发明的方法或用途旨在确定疾病、优选神经系统疾病是否具有自身免疫成分、优选适合免疫抑制治疗的成分。

在优选实施方案中，样品是包含抗体的体液，优选选自包含全血、血清、脑脊液和唾液的组。

在优选实施方案中，使用选自包含以下的组的方法来检测自身抗体或复合物：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记的免疫测定例如来自包含放射性标记的免疫测定、酶免疫测定的组的那些的标记的免疫测定，更优选elisa、化学发光免疫测定和免疫荧光，优选间接免疫荧光。

在优选实施方案中，医学装置选自包含以下的组：载玻片，优选用于显微镜术，生物芯片，微量滴定板，测试条，膜，优选线性斑点印迹(lineblot)，色谱柱和珠，优选磁珠。

在优选实施方案中，使用选自包含以下的方法来检测自身抗体或复合物：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记的免疫测定例如来自包含放射性标记的免疫测定、酶免疫测定的组的那些的标记的免疫测定，更优选elisa，化学发光免疫测定和免疫荧光，优选间接免疫荧光。

本发明基于发明人的令人惊讶的发现，即存在针对nsf的自身抗体、针对stx1b的自身抗体和针对vamp2的自身抗体并且可以在来自许多患有神经系统症状的患者的样品中检测到，但不能在从健康受试者获得的样品中检测到。

此外，本发明基于发明人的令人惊讶的发现，即可通过检测针对选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的自身抗体的方式来诊断新型神经系统疾病。

不希望受任何理论束缚，此类自身抗体的存在表明在具有此类自体抗体的患者中选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的一种或多于一种多肽和/或下游效应子的活性和功能受损，从而发生神经系统症状。

n-乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白(nsf)、突触融合蛋白1b(stx1b)和囊泡相关膜蛋白2(vamp2)是细胞内外周膜蛋白，其高度表达于脑中，特别是神经元的细胞体和轴突中(hongw,levstetheringtheassemblyofsnarecomplexes.trendscellbiol.201424:35-43)。

它们是参与神经元中的突触囊泡与突触前膜的对接和/或融合的snare(可溶性nsf附着蛋白受体)复合物的一部分。因此，nsf、stx1b和vamp2分别调节神经递质释放，包括从抑制性神经元释放γ-氨基丁酸(gaba)和甘氨酸(südhoftc,rizoj.synapticvesicleexocytosis.coldspringharbperspectbiol.2011dec1；3(12).pii:a005637)。

通过来自肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)的肉毒杆菌毒素(由称为肉毒杆菌神经毒素a-g的几种蛋白酶组成)切割stx1b和vamp2，消除了神经递质乙酰胆碱从神经肌肉接头的轴突末端的释放，从而引起弛缓性麻痹。类似地，通过来自破伤风梭菌(clostridiumtetani)的破伤风毒素切割vamp2导致以肌肉痉挛为特征的牙关紧闭。

nsf是含有744个氨基酸的82kda多肽。它是囊泡介导的运输所必需的。它催化高尔基潴泡(cisternae)内运输囊泡的融合。它也是从内质网到高尔基堆(stack)的运输所必需的。它似乎起着将货物蛋白质递送到独立于囊泡起源的高尔基堆的所有区室所需的融合蛋白的作用。

stx1b是含有288个氨基酸的33kda多肽。它可能参与突触囊泡在突触前活性区域的对接。

vamp2是含有116个氨基酸的13kda多肽。它参与运输囊泡到其靶膜的靶向和/或融合。调节延迟整流器(rectifier)电压依赖性钾通道kcnb1的门控特性。

stx1b和vamp2是神经元中snare核心复合物的一部分。

本发明涉及包含哺乳动物、优选人多肽的多肽，其选自包含nsf、stx1b和vamp2的组，或与自身抗体具有反应性的抗原性变体，所述自身抗体分别与nsf、stx1b或vamp2结合。哺乳动物nsf、stx1b和vamp2包括来自人、猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠或猪的那些，优选人nsf、stx1b和vamp2。

在更优选实施方案中，nsf是由数据库代码p46459-1或p46459-2、优选p46459-1编码的多肽。相应cdna的数据库代码分别是nm_006178(ncbi)。在整个本申请中，所引用的任何数据库代码均指uniprot数据库，更具体地是本申请或其最早优先权申请的申请日期的版本。

在更优选实施方案中，stx1b是由数据库代码p61266-1或p61266-2、优选p61266-1编码的多肽。相应cdna的数据库代码分别是nm_052874(ncbi)。

在更优选实施方案中，vamp2是由数据库编码p63027-1编码的多肽。相应cdna的数据库代码分别是nm_014232(ncbi)。

本发明的教导不仅可以通过使用多肽，特别是包含选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的天然序列的多肽，或具有在本申请中明确地(例如通过功能、名称、序列或登录号)或隐含地提到的准确序列的核酸来实施，而且可以通过使用这样的多肽或核酸的变体来实施。

在优选实施方案中，本文所使用的术语“变体”可以是指所提到的全长序列的至少一种片段，更具体地一种或多种相对于全长序列而言在一个或两个末端处截短了一个或多个氨基酸的氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以为至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。

在另一优选实施方案中，术语“变体”不仅是指至少一种片段，而且还是指这样的多肽或其片段，所述多肽或其片段包含与所提到的参考氨基酸序列或其片段具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，其中删除或置换除了对于生物学活性(例如，抗原结合(自身)抗体的能力)或者多肽的折叠或结构来说必需的那些氨基酸之外的其他氨基酸，和/或以保守的方式替换一个或多个这样的必需氨基酸和/或添加氨基酸，从而使得多肽的生物学活性得到保留。现有技术包括可以用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种不同的方法，参见例如arthurlesk(2008),introductiontobioinformatics,oxforduniversitypress,2008,3^rdedition。在优选实施方案中，使用clustalw软件(larkin,m.a.,blackshields,g.,brown,n.p.,chenna,r.,mcgettigan,p.a.,mcwilliam,h.,valentin,f.,wallace,i.m.,wilm,a.,lopez,r.,thompson,j.d.,gibson,t.j.,higgins,d.g.(2007).clustalwandclustalxversion2.0.bioinformatics,23,2947-2948)，其中采用缺省设置。

在优选实施方案中，所述变体是线性、非折叠的多肽，其任选为变性的。

在优选实施方案中，所述多肽和其变体还可以包含化学修饰，例如同位素标记，或者共价修饰例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、甲基化、羟基化等等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。对任何修饰如此地进行设计，从而使得其不消除变体的生物学活性。

此外，变体还可以通过与其他已知多肽或其变体相融合来产生，并且包含具有活性的部分或结构域，优选地，所述具有活性的部分或结构域当与参考序列的具有活性的部分进行比对时，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中本文所使用的术语“具有活性的部分”是指比全长氨基酸序列短的氨基酸序列，或在核酸序列的情况下编码比全长氨基酸序列短的氨基酸序列，和/或是天然序列的变体，但保留了至少一些生物学活性。

在优选实施方案中，术语核酸的“变体”包括这样的核酸，所述核酸的互补链与参考核酸或野生型核酸杂交，优选在严紧条件下杂交。杂交反应的严紧性是本领域普通技术人员可容易地确定的，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的根据经验的计算。通常，较长的探针需要较高的用于适当退火的温度，而较短的探针则需较低的温度。杂交通常取决于变性的dna与在环境中存在的互补链在低于其解链温度的温度下再退火的能力：探针和可杂交序列之间的所希望的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。因此，较高的相对温度将会倾向于使反应条件更严紧，而较低的反应温度将会更不严紧。关于杂交反应的严紧性的另外的细节和解释，参见ausubel,f.m.(1995),currentprotocolsinmolecularbiology.johnwiley&sons,inc。此外，本领域技术人员可以遵循在手册boehringermannheimgmbh(1993)thedigsystemusersguideforfilterhybridization,boehringermannheimgmbh,mannheim,germany中和在liebl,w.,ehrmann,m.,ludwig,w.,andschleifer,k.h.(1991)internationaljournalofsystematicbacteriology41:255-260中所给出的关于如何借助于杂交来鉴定dna序列的指导。在优选实施方案中，将严紧条件应用于任何杂交，即只有如果探针与靶序列具有70％或更高的同一性的情况下，杂交才出现。相对于靶序列而言具有较低的同一性程度的探针可以杂交，但此类杂交体是不稳定的并且将会在严紧条件下的洗涤步骤中被去除，例如降低盐浓度至2×ssc或，任选地和随后，至0.5×ssc，而温度为(以优选度渐增的顺序)大约50℃-68℃，大约52℃-68℃，大约54℃-68℃，大约56℃-68℃，大约58℃-68℃，大约60℃-68℃，大约62℃-68℃，大约64℃-68℃，大约66℃-68℃。在特别优选实施方案中，温度为大约64℃-68℃或大约66℃-68℃。可能的是，调节盐浓度至0.2×ssc，或甚至0.1×ssc。可以分离出具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相对于参考序列或野生型序列而言的同一性程度的核酸序列。在优选实施方案中，本文所使用的术语核酸序列的变体是指任何这样的核酸序列，其按照遗传密码的简并性而编码与参考核酸序列所编码的相同的氨基酸序列及其变体。

该多肽的变体具有生物学活性。在优选实施方案中，这样的生物学活性是结合于与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的各自多肽结合的如在患有自身免疫疾病的患者中发现的自身抗体的能力，所述自身免疫疾病与这种自身抗体相关，优选与神经系统疾病如僵人综合征、副肿瘤僵人综合征、具有强直和肌阵挛和脑炎的进行性脑脊髓炎相关，优选与这种自身抗体相关的僵人综合征。例如，可以通过确定目标变体是否与来自患者样品的自身抗体(所述自身抗体结合野生型nsf)结合来检查nsf的变体是否具有这样的生物学活性，优选如本申请实验部分所述的通过使用重组蛋白进行蛋白质印迹测定的那样。可以通过确定目标变体是否结合来自患者样品的自身抗体(所述自身抗体结合野生型stx1b)来检查stx1b的变体是否具有这样的生物学活性，优选如本申请实验部分所述的通过与表达stx1b哺乳动物细胞的间接免疫荧光测定的那样。可以通过确定目标变体是否结合来自患者样品的自身抗体(所述自身抗体结合野生型vamp2)来检查vamp2的变体是否具有这样的生物学活性，优选如本申请实验部分所述的通过与表达vamp2哺乳动物细胞的间接免疫荧光测定的那样。

当用于实施本发明的教导时，根据本发明的包含选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽或其变体(包括根据本发明的自身抗体)的多肽，可以以任何形式和以任何纯化程度来提供，从以内源形式包含所述多肽的液体样品、组织或细胞，更优选地，过表达所述多肽的细胞，此类细胞的粗制的或经富集的裂解物，直至经纯化的和/或分离的多肽，其任选地是基本上纯的。在优选实施方案中，所述多肽是天然多肽，其中本文所使用的术语“天然多肽”是指经折叠的多肽，更优选是指从组织或细胞中，更优选从哺乳动物细胞或组织中，任选地从非重组的组织或细胞中纯化出的经折叠的多肽。在另一优选实施方案中，所述多肽是重组的蛋白质，其中本文所使用的术语“重组的”是指通过使用基因工程方法在生产过程的任何阶段而产生的多肽，例如通过将编码所述多肽的核酸与用于在细胞或组织中过表达的强启动子相融合或者通过改造所述多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和所编码的多肽的方法(例如，在sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.(1989),molecularcloning,csh中或在brownt.a.(1986),genecloning–anintroduction,chapman&hall中所描述的)和用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如，由gehealthcarelifesciences公开的手册“strategiesforproteinpurification”,“antibodypurification”,“purifyingchallengingproteins”(2009/2010)，其在burgess,r.r.,deutscher,m.p.(2009),guidetoproteinpurification中)。在优选实施方案中，如果在各自样品中至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳以及随后的考马斯蓝染色和可视化检定所判断的，则多肽是纯的。

如果本发明的多肽以组织的形式来提供，那么优选的是，所述组织为哺乳动物组织，例如人、大鼠、灵长类、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或奶牛，更优选脑组织，最优选小脑。如果使用细胞裂解物，那么优选的是，所述细胞裂解物包含与细胞表面相关的膜或者实际上是膜中富集的级分。如果所述多肽以重组细胞的形式来提供，那么优选的是，所述重组细胞为真核细胞例如酵母细胞，更优选来自多细胞真核生物例如植物、哺乳动物、蛙或昆虫，最优选来自哺乳动物例如大鼠、人、灵长类、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或奶牛的细胞。

用于实施本发明教导的多肽(包括任何变体)优选设计为使得其包含至少一个表位，所述表位由与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体识别和/或与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体特异性结合。与除了针对nsf、stx1b或vamp2的自身抗体以外的抗体相比，任何表位更优选是仅由这种自身抗体识别的表位。在一个实施方案中，此类多肽包含分别来自nsf、stx1b和vamp2的6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个、优选至少9个但不超过16个连续氨基酸。本领域技术人员熟悉用于设计具有足够的免疫原性的肽的指导方针，例如在jackson,d.c.,fitzmaurice,c.j.,brown,l.e.,zeng,w.(1999),preparationandpropertiesoftotallysyntheticimmunogenes,vaccine,第18卷,第3-4期,1999年9月,第355-361页；和black,m.,trent,a.,tirrell,m.和olive,c.(2010),advancesinthedesignanddeliveryofpeptidesubunitvaccineswithafocusontoll-likereceptoragonists,expertrevvaccines,2010年2月,9(2):157-173中所描述的那些。简而言之，期望的是，肽尽可能多地满足下列要求：(a)它具有高的亲水性程度；(b)它包含选自包含天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的组的一个或多个残基；(c)为了更高的特异性，它与其他已知的肽或多肽不具有同源性或具有很低的同源性；(d)它需要是足够可溶的；和(e)它不包含糖基化或磷酸化位点，除非由于特殊原因而需要。或者，可以遵循生物信息学方法，例如由moreau,v.,fleury,c.,piquer,d.,nguyen,c.,novali,n.,villard,s.,laune,d.,granier,c.和molina,f.(2008),pepop:computationaldesignofimmunogenicpeptides,bmcbioinformatics2008,9:71所描述的那些。如果多肽是stx1b或其变体，则该表位优选在seqidno5中。

当根据本发明使用时，可以以任何种类的构象提供包含选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽或其变体的本发明多肽。例如，所述多肽可以是基本上未折叠的、部分折叠的或完全折叠的多肽。在优选实施方案中，所述多肽在这样的意义上进行折叠，即对于与本发明的自身抗体的结合来说必需的表位，或者该蛋白质或其变体以其整体，采取由天然蛋白质在其天然环境中所采取的折叠。本领域技术人员熟悉适合于测定多肽是否是折叠的，和如果是折叠的，那么它具有哪种结构的方法，例如有限蛋白酶解、核磁共振波谱、圆二色光谱或x射线晶体学(参见例如banaszakl.j.(2008),foundationsofstructuralbiology,academicspress；或tengq.(2013),structuralbiology:practicalapplications,springer)，优选地，使用圆二色光谱。

本发明的多肽可以是融合蛋白，其包含除了取自nsf、stx1b和vamp2的那些之外的其他氨基酸序列，特别是c-末端或n-末端标签，优选c-末端标签，其在优选实施方案中如本文所使用的为具有功能的额外的序列基元或多肽，其具有一些生物学或物理功能和可以例如用于纯化、固定化、沉淀或鉴定本发明的多肽。在更优选实施方案中，所述标签是能够与配体特异性地结合的序列或结构域，例如选自包含以下的组：his标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽s-转移酶的标签、荧光标签，其例如选自包含绿色荧光蛋白的组。

本发明的多肽可以是经固定化的多肽。在优选实施方案中，本文所使用的术语“经固定化的”是指结合至在水溶液中不可溶的固体载体的分子，更优选通过共价键、静电相互作用、包囊或包载(例如通过使球状多肽在凝胶中变性)，或通过疏水相互作用，最优选通过一个或多个共价键。各种不同的合适载体，例如纸、聚苯乙烯、金属、硅或玻璃表面、微流控通道、膜、珠粒例如磁珠、柱色谱法介质、生物芯片、聚丙烯酰胺凝胶等等，已在文献中进行了描述，例如在kim,d.和herr,a.e.(2013),proteinimmobilizationtechniquesformicrofluidicassays,biomicrofluidics7(4),041501中。如此，可以以直截了当的方式将经固定化的分子连同不可溶的载体一起与水溶液分开，例如通过过滤、离心或滗析。经固定化的分子可以是以可逆或不可逆的方式进行固定化的。例如，如果分子与载体通过可以经由添加高浓度的盐而掩蔽的离子相互作用来进行相互作用，或如果分子通过可裂开的共价键例如二硫桥(其可以通过添加含巯基的试剂来进行裂开)进行结合，那么固定化是可逆的。相反地，如果分子通过不能在水溶液中裂开的共价键(例如，通过经常用于将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的环氧化物基团和胺基团的反应而形成的键)而拴系至载体，那么固定化是不可逆的。蛋白质可以间接地进行固定化，例如通过使抗体或其他对于该分子具有亲和力的实体固定化，随后是复合物的形成，以致于分子-抗体复合物被固定化。各种不同的用于使分子固定化的方式描述在文献中，例如在kim,d.,herr和a.e.(2013),proteinimmobilizsationtechniquesformicrofluidicassays,biomicrofluidics7(4),041501中。另外，各种不同的用于固定化反应的试剂和试剂盒是商购可得的，例如购自piercebiotechnology。

必要的是，用于按照根据本发明的自身抗体的检测进行诊断的样品包含抗体，其也称为免疫球蛋白。典型地，体液样品包含代表性的一全套受试者的免疫球蛋白。但是，一旦提供了，可以使样品经历进一步的加工，其可以包括分级分离、离心、富集或分离受试者的全体免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，这可以影响各种不同类别的免疫球蛋白的相对分布。

在本申请全文中所描述的试剂、装置、方法和用途可以用于疾病诊断。在优选实施方案中，所述疾病为神经系统疾病。在更优选实施方案中，本文所使用的术语“神经系统疾病”是指任何与神经系统的缺陷相关的疾病，在另一优选实施方案中，如本文所用，术语“pns”(副肿瘤性神经综合征的缩写)是指由于存在肿瘤而间接引起的全身性病症，例如由于物质如通常不产生的激素或细胞因子的产生释放通过肿瘤起源的细胞或以增加的浓度产生或产生和释放生物活性细胞。肿瘤可能太小而无法检测。

在优选实施方案中，本文所使用的术语“诊断”是指任何类型的旨在下列目的的程序：获得在评估患者是否在过去、在诊断之时或在未来罹患或可能罹患或比平均或比较受试者(其优选具有相似的症状)更可能罹患某种疾病或病症之中有帮助的信息；发现疾病正在如何进展或在未来可能如何进展；或者评价患者对于某一治疗(例如，施用免疫抑制药物)的应答性。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括预测和/或监测疾病或病症的过程。

在许多情况下，单纯的检测(换言之，测定样品中是否存在可检测水平的抗体)对于诊断来说是足够的。如果可以检测到自身抗体，那么这将是对于临床医师的诊断来说有帮助的信息，并且指明了增加的患者罹患疾病的可能性。在优选实施方案中，如果可以使用选自包含免疫沉淀、间接免疫荧光、elisa或线性斑点印迹的组、优选免疫沉淀的一种或多种方法检测自身抗体，则该自身抗体被认为是可检测的。实验细节在本申请的实验部分中描述，或者如在本申请的优先权日期可获得的教科书或实践手册中所述。在优选实施方案中，可以测定相比于在平均健康受试者中可以发现的水平而言的在血清中抗体的相对浓度。尽管在许多情况下测定自身抗体在样品中是否存在或可检测可以是足够的，但是为了获得对于诊断来说有帮助的信息而实施的方法可以包括测定浓度是否以至少0.1倍，优选以0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100、200、500、1000、10000或100000倍比在平均健康受试者中所发现的浓度高。在优选实施方案中，使用选自包含半定量免疫沉淀、半定量间接免疫荧光、elisa或半定量线性斑点印迹的组的一种或多种方法，优选elisa测定自身抗体的相对浓度。实验细节在本申请的实验部分中描述，或者如在本申请的优先权日期可获得的教科书或实践手册中所述。

本领域技术人员将会意识到，临床医师通常并不仅仅基于单一的诊断参数来对患者是否罹患或可能罹患疾病、病况或病症作出结论，而是需要考虑其他方面，例如其他自身抗体、标志物的存在、血液参数、患者症状的临床评估或者医学成像或其他非侵入性方法(例如，多导睡眠描记法)的结果，以便达到结论性的诊断。参见baenklerh.w.(2012),generalaspectsofautoimmunediagnostics,renz,h.,autoimmunediagnostics,2012,degruyter，第3页。诊断试剂或方法的价值也可以在于可能排除一种疾病，因此允许间接诊断另一种疾病。在优选实施方案中，贯穿本申请提及的任何症状或疾病的含义与本领域技术人员理解的一致，如本申请的申请日或优选最早的优先权日，如由教科书和科学出版物证明的。应该提及的是，本发明的方法或用途或产品单独使用不能用于达成明确的最终诊断。

因此，术语“诊断”优选不是暗示根据本发明的诊断方法或试剂对于基于单一测试(更不必说参数)来完成诊断来说将会是确定的和足够的，而是可以是指对于所谓的“鉴别诊断”(即基于一系列诊断参数考虑了一系列可能病况的可能性的系统诊断程序)的贡献。因此，本发明的方法、多肽或用途(其任选地用于确定患者是否罹患疾病)可以包括：从患者(优选人患者)中获得样品；测定在所述样品中是否存在与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽相结合的自身抗体，其中所述测定通过下述方式来进行，使样品与本发明的多肽相接触并检测在所述多肽和所述自身抗体之间是否出现结合，优选通过使用经标记的二抗来进行检测，其中所述自身抗体如果存在于样品中则与所述多肽相结合；和如果测定到自身抗体存在于样品中，则将患者诊断为罹患或更可能罹患所述神经系统病症。

在优选实施方案中，根据本发明的方法包括从包含针对多肽nsf、stx1b、vamp2、gad65、gad67、ia-2、znt8和双载蛋白中的每一个的自身抗体的组检测超过一种自身抗体。在更优选实施方案中，这可以涉及：a)从包含针对多肽gad65、gad67、ia-2、znt8和双载蛋白中的每一个、优选gad65和gad67的自身抗体的组检测自身抗体，并且b)从包含针对多肽nsf、stx1b、vamp2中的每一个、优选nsf的自身抗体的组检测自身抗体。

术语“诊断”还可以是指用于在两个或更多个与相似或相同的症状相关的病况之间进行区分的方法或试剂。

术语“诊断”还可以是指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或试剂。换言之，所述方法或试剂可以涉及为受试者挑选治疗方案。例如，检测到自身抗体可以表明，将会选择免疫抑制疗法，其可以包括向患者施用一种或多种免疫抑制药物。

本发明涉及包含与本发明的多肽相结合的抗体(优选地，自身抗体)的复合物。作为用于诊断疾病的方法的一部分，可以使用或检测这样的复合物。如果待检测针对选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的自身抗体，来自受试者的包含抗体的液体样品可以用于实施所述方法。这样的液体样品可以是任何来自受试者的包含具有代表性的一组抗体的体液，优选来自受试者的包含igg免疫球蛋白类别的抗体的样品。例如，样品可以是脑脊液(csf)、血液或血清、淋巴、组织液，优选是血清或csf，更优选是血清。它优选是离体样品。

使包含抗体的液体样品与本发明的多肽相接触的步骤可以通过下述方式来进行：在包含抗体的样品存在下，在与包含各自多肽和结合本发明多肽的抗体(优选自身抗体)的复合物形成相容的条件下，孵育固定化形式的所述多肽。随后，可以移除在那时耗尽了与本发明的多肽相结合的抗体的液体样品，接着是一个或多个洗涤步骤。最后，可以检测包含所述抗体和所述多肽的复合物。在优选实施方案中，术语“与复合物形成相容的条件”是这样的条件，其允许特异性的抗原-抗体相互作用从而建立包含所述多肽和所述抗体的复合物。在优选实施方案中，此类条件可以包括将所述多肽在于pbs缓冲液中以1:100稀释的样品中在25℃下孵育30分钟。在优选实施方案中，本文所使用的术语“自身抗体”是指与产生所述自身抗体的动物(优选哺乳动物)的内源性分子特异性地结合的抗体，其中此类抗体的水平更优选相比于任何与此类内源性分子特异性地结合的其他抗体的平均值而言是升高的。在最优选实施方案中，所述自身抗体为与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽相结合的自身抗体。

根据本发明的方法优选为体外方法。

在优选实施方案中，用于根据本发明的预后、诊断、方法或测试试剂盒的复合物的检测包括使用选自包含以下的组的方法：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记免疫测定例如选自包含放射性标记免疫测定、酶免疫测定、优选elisa、化学发光免疫测定和免疫荧光、优选间接免疫荧光技术的组的那些。本领域技术人员熟悉这些方法，其也描述在现有技术中，例如在zane,h.d.(2001),immunology–theoretical&practicalconceptsinlaboratorymedicine,w.b.saunderscompany中，特别是在第14章中。

或者，可以使用除了液体样品之外的包括包含本发明多肽的组织的样品。所述组织样品优选来自表达内源性的选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的组织，优选以与相应生物体、优选人体中的平均组织相比增加的水平表达所述多肽。然后，可以使这样的样品(其可以以固定在载体例如用于显微分析的载玻片上的组织切片的形式)与结合本发明多肽的本发明抗体(优选自身抗体)相接触。优选地，对所述抗体进行标记以允许与结合本发明多肽的内源性抗体相区分，从而使得可以对新形成的复合物进行检测，和任选地进行定量。如果所形成的复合物的量低于在取自健康受试者的样品中所发现的量，那么受检查样品所取自的受试者可能罹患疾病。

可以将任何证明包含抗体和本发明多肽的复合物存在或不存在的数据与参考数据相关联。例如，检测到所述复合物指示，提供所分析样品的患者已经罹患、正在罹患或在未来可能罹患疾病。如果患者以前已被诊断并且再次运行用于获得在诊断上有关的信息的方法，那么可以将在这两次运行中检测到的复合物的量相关联以获悉有关疾病进展和/或治疗成功的信息。例如，如果发现复合物的量增加，那么这暗示病症正在进展从而可能在未来显现，和/或所尝试的任何治疗是不成功的。

在优选实施方案中，使用微滴定板、膜、斑点印迹或线性斑点印迹之类的印迹来实施根据本发明的诊断方法。本领域技术人员熟悉实验设置，其描述在现有技术(raoult,d.和dasch,g.a.(1989),thelineblot:animmunoassayformonoclonalandotherantibodies.itsapplicationtotheserotypingofgram-negativebacteria.j.immunol.methods,125(1-2),57-65；wo2013041540)中。

在另一优选实施方案中，按照本发明教导的预后、诊断、方法或测试试剂盒考虑使用间接免疫荧光。本领域技术人员熟悉此类技术和合适样品的制备，其描述在现有技术(us4647543；voigt,j.,krause,c.,e,saschenbrecker,s.,hahn,m.,danckwardt,m.,feirer,c.,ens,k,fechner,k,barth,e,martinetz,t.和w.(2012),automatedindirectimmunofluorescenceevaluationofantinuclearautoantibodiesonhep-2cells,”clinicalanddevelopmentalimmunology,vol.2012,doi:10.1155/2012/65105；bonilla,e.,francis,l.,allam,f.etal.,immuno-fluorescencemicroscopyissuperiortofluorescentbeadsfordetectionofantinuclearantibodyreactivityinsystemiclupuserythematosuspatients,clinicalimmunology,vol.124,no.1,pp.18–21,2007)中。合适的试剂、装置和软件包是商购可得的，例如购自euroimmun,lübeck,germany。

可以对样品进行测试以仅确定是否存在与选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽结合的自身抗体，但是优选诊断方法、测试、装置等考虑确定是否存在针对一种或多种其他多肽的自身抗体，优选与神经系统自身免疫疾病相关，优选选自包含以下的组：hu、yo、ri、cv2、pnma1、pnma2、dner/tr、arhgap26、itpr1、atp1a3、nbc1、神经软骨蛋白、carpviii、zic4、sox1、ma、mag、mp0、mbp、gad65、双载蛋白、恢复蛋白、gabaa受体(ep13189172.3)、gabab受体(ep2483417)、甘氨酸受体、桥蛋白(gephyrin)、iglon5(2016/0349275)、dppx(us2015/0247847)、水孔蛋白-4、mog、nmda受体、ampa受体、grm1、grm5、lgi1、vgcc和mglur1和caspr2，该抗原优选是经固定化的，例如固定在医学装置例如线性斑点印迹上。在更优选实施方案中，检测针对选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的自身抗体和针对gad65的自身抗体。已经在现有技术中描述了可以另外检测针对诊断相关标志物神经软骨蛋白(ep15001186)、itpr1(ep14003703.7)、nbc1(ep14003958.7)、atp1a3(也称为人神经元na(+)/k(+)atp酶的α3亚基(ep14171561.5))、flotillin1/2(ep3101424)和rgs8(ep17000666.2)的一种或多种的自身抗体。

根据本发明的教导，提供与本发明的多肽相结合的抗体、优选自身抗体用于疾病诊断。本领域技术人员熟悉用于纯化抗体的方法，例如在hermanson,g.t.,mallia,a.k.和smith,p.k.(1992),immobilizedaffinityligandtechniques,sandiego:academicpress中所描述的那些方法。简而言之，将与目的抗体(其抗原是本发明的多肽)特异性地结合的抗原固定化，并用于经由亲和色谱来从适当的来源中纯化出目的抗体。来自罹患由发明人所鉴定的神经系统病症的患者的包含抗体的液体样品可以用作来源。

根据本发明，提供能够与本发明的多肽特异性地结合的抗体，例如自身抗体。在优选实施方案中，本文所使用的术语“抗体”是指任何基于免疫球蛋白的结合部分，更优选包含至少一个免疫球蛋白重链和至少一个免疫球蛋白轻链的结合部分，其包括但不限于单克隆和多克隆抗体以及抗体的变体，特别是片段，所述结合部分能够与各自的抗原相结合，更优选与之特异性地结合。在优选实施方案中，本文所使用的术语“特异性地结合”表示，所述结合比以1×10^-5m，更优选1×10^-7m，更优选1×10^-8m，更优选1×10^-9m，更优选1×10^-10m，更优选1×10^-11m，更优选1×10^-12m的解离常数为特征的结合反应更强，所述解离常数通过使用biacore设备在25℃下在ph7的pbs缓冲液中通过表面等离子体共振来测定。所述抗体可以是自身抗体制备物的一部分，所述自身抗体制备物是异源的或可以是同源的自身抗体，其中异源制备物包含许多不同的自身抗体种类，如通过从人供者血清进行制备而可获得的，例如通过使用经固定化的抗原进行亲和层析以纯化任何能够与所述抗原相结合的自身抗体。所述抗体可以是经糖基化的或非糖基化的。本领域技术人员熟悉可以用于鉴定、产生和纯化抗体及其变体的方法，例如在ep2423226a2以及其中的参考文献之中所描述的那些方法。所述抗体可以用作诊断试剂，单独地，或相组合地，例如与本发明的多肽复合。

本发明提供了用于分离与本发明的多肽相结合的抗体(优选自身抗体)的方法，其包括下列步骤：a)使包含该抗体的样品与本发明的多肽相接触，从而形成复合物，b)分离在步骤a)中形成的复合物，c)解离在步骤b)中分离的复合物，和d)将该抗体与本发明的多肽分开。可以将来自罹患由发明人所鉴定的新的神经系统病症的患者的样品用作抗体的来源。合适的方法描述在现有技术中，例如在由gehealthcarelifesciences公开的手册“affinitychromatography”、“strategiesforproteinpurification”和“antibodypurification”(2009/2010)中，和在philips,terry,m.,analyticaltechniquesinimmunochemistry,1992,marceldekker,inc中。

本发明提供了包含本发明的多肽的药物组合物，所述组合物优选适合于向受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人进行施用。这样的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。所述药物组合物可以例如经口服途径、经肠胃外途径、通过吸入喷雾剂、经局部途径、通过滴眼剂、经直肠途径、经鼻途径、经颊途径、经阴道途径或经由植入型储器进行施用，其中本文所使用的术语“经肠胃外途径”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、损伤内和颅内注射或输注技术。所述药物组合物可以以合适的剂型来提供，例如胶囊、片剂以及水性悬浮液和溶液，优选以无菌的形式。它可以在治疗疾病的方法中进行使用，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。在优选实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽的疫苗，其任选地包含辅助试剂例如佐剂或缓冲液；和本发明的多肽用于制备疫苗的用途。

在本发明的范围内，提供了包含优选包被有用于检测本发明(自动)抗体和/或本发明多肽的试剂的医疗或诊断装置。优选地，这样的医疗或诊断装置包含本发明的多肽，其形式允许以直接的方式使其与水溶液、更优选液体人样品接触。特别地，包含的本发明的多肽可以固定在载体的表面上，所述载体优选选自包含以下的组：玻璃板或载玻片，生物芯片，微量滴定板，珠，例如磁珠，血液成分分离(apharesis)装置，色谱柱，膜等。示例性医学装置包括线性斑点印迹，微量滴定板，显微镜用载玻片，珠，优选磁珠，和生物芯片。除了本发明的多肽之外，医疗或诊断装置可以包含另外的多肽，例如阳性或阴性对照，例如包含或不包含与目标多肽结合的抗体的样品，或与诊断价值的自身抗体结合的已知的其他抗原，特别是涉及与一种或多种相同或类似症状相关的其他疾病的那些。

本发明的教导提供了试剂盒，其优选用于诊断疾病。这样的试剂盒可以包含详细说明如何使用该试剂盒的说明书，和用于使本发明的多肽与来自受试者(优选人受试者)的体液样品相接触的工具，例如线性斑点印迹，其中本发明的多肽被固定化在线性斑点印迹上。进一步地，所述试剂盒可以包含阳性对照，例如一批已知与本发明的多肽相结合的自身抗体或重组抗体；和阴性对照，例如与本发明的多肽不具有可检测的亲和力的蛋白质例如牛血清白蛋白。最后，这样的试剂盒可以包含用于制备校准曲线的抗体或抗原的标准溶液。

在优选实施方案中，所述试剂盒包含用于检测与本发明的多肽相结合的自身抗体的工具，所述检测优选通过检测包含本发明的多肽和与本发明的多肽相结合的抗体的复合物来进行。这样的工具优选是这样的试剂，所述试剂与所述复合物相结合并且修饰该复合物或者携带标记从而使得该复合物可检测。例如，所述工具可以是经标记的抗体，其在除了被一抗所识别的结合位点之外的其他结合位点处与所述多肽相结合或者与一抗的恒定区相结合。备选地，所述工具可以是与所述自身抗体的恒定区相结合的二抗，优选对于哺乳动物igg类抗体来说特异的二抗。许多用于检测此类复合物的方法和工具在现有技术中已有描述，例如在philips,terry,m.,analyticaltechniquesinimmunochemistry,1992,marceldekker,inc中。

包含选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽或其变体的本发明的多肽可以以包含和/或表达编码所述多肽的核酸的细胞的形式来产生或提供。如果使用包含编码本发明的多肽或其变体的序列的核酸，那么这样的核酸可以是未修饰的核酸。在优选实施方案中，所述核酸为这样的核酸，其本身不在自然界中出现，并且相比于天然核酸而言包含至少一个修饰，例如同位素内容物或化学修饰，例如甲基化、序列修饰、标记等，其指示了合成来源。在优选实施方案中，所述核酸为重组核酸或核酸的一部分，和在更优选实施方案中，为载体的一部分，在所述载体中它可以与允许所述核酸表达(优选过表达)的启动子功能性地相连接。本领域技术人员熟悉各种各样的合适的载体，其是商购可得的，例如购自origene。例如，可以使用编码具有c-末端gfp的融合构建体的载体。所述细胞可以是真核或原核细胞，优选真核细胞，例如酵母细胞，和更优选为哺乳动物细胞，更优选人细胞例如hek293细胞。哺乳动物细胞的实例包括hek293、cho或cos-7细胞。包含编码本发明的多肽的核酸的细胞可以是重组细胞或分离的细胞，其中术语“分离的”表示，所述细胞是经富集的，从而使得相比于所述细胞的野生型的环境而言，存在很少的其他分化或种类的细胞或者实际上不存在这样的其他细胞。

本发明的教导可以不仅用于诊断，而且还用于预防或治疗疾病，更特别地，用于预防或治疗疾病的方法，其包括下列步骤：a)降低在受试者血液中与本发明的多肽相结合的自身抗体的浓度，和/或b)施用一种或多种免疫抑制药学物质，其优选选自包含以下的组：利妥昔单抗、波尼松、甲波尼龙、环磷酰胺、吗替麦考酚酯、静脉内免疫球蛋白、他克莫司、环孢菌素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤，和/或药物组合物。

在优选实施方案中，本发明提供了用于检测针对选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的自身抗体或检测编码nsf、stx1b或vamp2的核酸或变体或包含所述核酸的载体或细胞的工具在用于制备用于诊断疾病如僵人综合征的试剂盒中的用途。在另一个优选实施方案中，本发明提供了用于检测针对选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的自身抗体，或检测编码nsf、stx1b或vamp2的核酸或其变体或者包含所述核酸的载体或细胞的试剂在用于制备用于诊断疾病如僵人综合征的试剂盒中的用途。

在优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可用于非诊断用途，即用于除诊断患者之外确定针对选自包含nsf、stx1b和vamp2的组的多肽的自身抗体的存在。例如，所述方法或用途可以用于体外测试医学装置的效率，所述医学装置设计用于从患者血液中去除自身抗体，其中所述测试是对患者血液以外的液体进行的。在优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可用于产生自身抗体谱，优选用于检测哺乳动物、优选人的疾病。在优选实施方案中，任何方法或用途可以用于检测来自神经系统疾病患者的样品中的疾病相关标志物。

附图说明

图1显示了小脑的免疫荧光染色。在第一步中用患者血清(p11:32；p21:100)并在第二步中用与alexa488标记的山羊抗人igg孵育冰冻切片。通过分子层上的最强反应获得小脑分子层和颗粒层的平滑染色。

图2显示了免疫沉淀和抗原鉴定。用患者或对照血清孵育大鼠小脑的裂解物。用蛋白g包被的磁珠分离免疫复合物，用sds洗脱并进行sds-page分析，然后(a)用胶体考马斯染色或(b)蛋白质印迹和用抗stx1b小鼠抗体孵育。箭头表示免疫沉淀抗原在约33kda处的位置。

图3显示了通过间接免疫荧光和蛋白质印迹使用重组抗原验证stx1b为新型自身抗原。(a)使用用患者csf(1:1)或血清(1:10)或健康对照血清(1:10)孵育的丙酮固定的stx1b或模拟转染的hek293细胞的间接免疫荧光。(b)用抗his、患者血清(1:200)或健康对照血清(1:200)孵育的stx1b(ic)-his的蛋白质印迹。(c)中和神经元组织的免疫荧光反应。将患者血清与用stx1b或用空载体作为对照转染的hek293细胞提取物进行预孵育。含有stx1b的提取物消除了免疫反应。

图4显示了通过ifa和wb测定抗stx1b。使用(a)用患者血清(1:32)孵育的冰冻切片或(b)在第一步中用患者血清(1:10)和在第二步中用alexa488标记的山羊抗人igg孵育的丙酮固定的stx1b或模拟转染的hek293细胞进行间接免疫荧光。(c)用患者血清(1:200)或健康对照血清(1:200)孵育的stx1b(ic)-his的蛋白质印迹。

图5显示了通过用重组抗原的蛋白质印迹验证nsf为新型自身抗原。用抗his、患者血清或健康对照血清(1:1000)孵育nsf转染的hek293细胞提取物进行蛋白质印迹。

图6显示了通过用重组抗原的间接免疫荧光验证vamp2为新型自身抗原。使用(a)用患者血清(1:32)孵育的冰冻切片或(b)在第一步中用患者或健康对照血清(1:10)和在第二步中用alexa488标记的山羊抗人igg孵育的丙酮固定的vamp2或模拟转染的hek293细胞进行间接免疫荧光。

本发明包括一系列序列，更具体地

seqid1(nsf,uniprot)

magrsmqaarcptdelsltncavvnekdfqsgqhvivrtspnhrytftlkthpsvvpgsiafslpqrkwaglsigqeievslytfdkakqcigtmtieidflqkksidsnpydtdkmaaefiqqfnnqafsvgqqlvfsfneklfgllvkdieamdpsilkgepatgkrqkievglvvgnsqvafekaensslnligkaktkenrqsiinpdwnfekmgiggldkefsdifrrafasrvfppeiveqmgckhvkgillygppgcgktllarqigkmlnarepkvvngpeilnkyvgeseanirklfadaeeeqrrlgansglhiiifdeidaickqrgsmagstgvhdtvvnqllskidgveqlnnilvigmtnrpdlideallrpgrlevkmeiglpdekgrlqilhihtarmrghqllsadvdikelavetknfsgaeleglvraaqstamnrhikastkvevdmekaeslqvtrgdflaslendikpafgtnqedyasyimngiikwgdpvtrvlddgellvqqtknsdrtplvsvllegpphsgktalaakiaeesnfpfikicspdkmigfsetakcqamkkifddayksqlscvvvddierlldyvpigprfsnlvlqallvllkkappqgrklliigttsrkdvlqememlnafsttihvpniatgeqllealellgnfkdkerttiaqqvkgkkvwigikkllmliemslqmdpeyrvrkflallreegaspldfd

seqidno2(nsf,rec)

magrsmqaarcptdelsltncavvnekdfqsgqhvivrtspnhrytftlkthpsvvpgsiafslpqrkwaglsigqeievslytfdkakqcigtmtieidflqkksidsnpydtdkmaaefiqqfnnqafsvgqqlvfsfneklfgllvkdieamdpsilkgepatgkrqkievglvvgnsqvafekaensslnligkaktkenrqsiinpdwnfekmgiggldkefsdifrrafasrvfppeiveqmgckhvkgillygppgcgktllarqigkmlnarepkvvngpeilnkyvgeseanirklfadaeeeqrrlgansglhiiifdeidaickqrgsmagstgvhdtvvnqllskidgveqlnnilvigmtnrpdlideallrpgrlevkmeiglpdekgrlqilhihtarmrghqllsadvdikelavetknfsgaeleglvraaqstamnrhikastkvevdmekaeslqvtrgdflaslendikpafgtnqedyasyimngiikwgdpvtrvlddgellvqqtknsdrtplvsvllegpphsgktalaakiaeesnfpfikicspdkmigfsetakcqamkkifddayksqlscvvvddierlldyvpigprfsnlvlqallvllkkappqgrklliigttsrkdvlqememlnafsttihvpniatgeqllealellgnfkdkerttiaqqvkgkkvwigikkllmliemslqmdpeyrvrkflallreegaspldfd

seqidno3(stx1b,uniprot)

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seqidno4(stx1b,rec)

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seqidno5(stx1b(ic)-his,rec)

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seqidno6(vamp2,uniprot)

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seqidno7(vamp2,rec)

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seqidno8(有义nsf)

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seqidno9(反义nsf)

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seqidno10(有义stx1b)

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seqidno14(反义vamp2)

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seqidno17(ptriex-1-stx1b(ic)-his)

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seqidno18(ptriex-1-vamp2)

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通过以下非限制性实施例进一步说明本发明，可以从这些实施例中取得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。

具体实施方式

实施例

概要

方法：对两个患有特发性脑炎和具有自身免疫背景的患者(p1-p2)进行血清学调查。为此，来自两个患者的血清和来自p2的匹配的脑脊液(csf)通过间接免疫荧光测定(ifa)和免疫印迹进行全面的自身抗体筛选。用小脑裂解物进行免疫沉淀接着进行质谱(ms)用来鉴定自身抗原，其通过用针对各自靶抗原的单特异性动物抗体的蛋白质印迹(wb)以及通过hek293细胞中的重组表达和使用免疫分析中的重组蛋白来进行验证。此外，针对抗stx1b抗体筛选具有神经系统症状和确定的抗神经自身抗体的患者血清、具有与患者1和2相似的染色模式而没有已知自身抗体反应性的血清以及阴性对照血清。另外通过ifa或蛋白质印迹与作为基底的其他重组snare复合物蛋白(vamp2、nsf)分析所有血清。

结果：p1和p2的ifa筛选揭示了血清和csf中的igg与啮齿动物和猴子小脑中的分子和颗粒层的反应性。此外，在一组30种重组表达的已建立的神经自身抗原中未发现igg反应性。通过考马斯染色的sds-page接着进行maldi-tof质谱检测，p1和p2的血清与突触融合蛋白1b(stx1b)发生免疫沉淀。当使用抗stx1b的单特异性动物抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀物时，抗stx1b显示出与p1和p2的免疫沉淀物的反应性。在45个健康对照中的任意一个中没有发现抗stx1b抗体。然而，在就小脑而言具有与p1和p2相似的染色模式的两个患者血清(p3和p4)中，可以通过rc-ifa和蛋白质印迹用重组蛋白检测到抗stx1b抗体。此外，预先诊断为僵人综合征的两个患者(p6和p7)的抗gad65阳性血清在用重组stx1b的ifa中为阳性。针对其他重组snare蛋白筛选对照和抗stx1b阳性血清揭示了三个抗nsf(p3、p6和p7)阳性和一个抗vamp2(p5)阳性样品。

这些结果表明，自身抗体的出现和检测分别与ae和sps的出现特异性相关，因此在诊断上是有用的。

患者

对照组包括45个健康供体，33个患有神经系统症状和确定的抗神经自身抗体的患者(3x抗caspr2、3x抗nmdar、3x抗lgi1、3x抗hu、3x抗ri、2x抗yo/抗ri、3x抗yo、3x抗aqp4、10x抗gad65)和10种具有与p1和p2相似的染色模式而没有已知自身抗体反应性的血清。

间接免疫荧光测定(ifa)

使用具有脑组织冰冻切片(大鼠的海马、大鼠和猴的小脑)的生物芯片阵列的载玻片与分别表达30种不同的脑抗原的重组hek293细胞组合进行ifa，所述30种不同的脑抗原为hu、yo、ri、cv2、pnma2、itpr1、homer3、carpviii、arhgap26、zic4、dner/tr、gad65、gad67、双载蛋白、恢复蛋白、gabab受体、甘氨酸受体、dppx、iglon5、谷氨酸受体(类型nmda、ampa、mglur1、mglur5、glurd2)、lgi1、caspr2、aqp4(m1和m23)、mog、atp1a3、ncdn(euroimmun,fa111a-1003-51,fa1112-1003-50,fa-1128-1003-50,fa112d-1003-1,fa112m-1003-50,fa1151-1003-50,misker,hahns,rosenkranzt,müllerm,dettmannim,mindorfs,dennoy,brakopps,scharfm,teegenb,probstc,melzern,meinckhm,terborgc,w,komorowskil.,2016,autoantibodiesagainstglutamatereceptorδ2afterallogenicstemcelltransplantation.neurolneuroimmunolneuroinflamm.,3(4):e255；scharfm,misker,heidenreichf,giessr,landwehrp,im,begemannn,dennoy,tiedes,c,schlumbergerw,ungerm,teegenb,w,probstc,komorowskil,2015,neuronalna+/k+atpaseisanautoantibodytargetinparaneoplasticneurologicsyndrome,neurology；84(16):1673-9；misker,grosscc,scharfm,golombeckks,hartwigm,bhatiau,schulte-mecklenbecka,k,strippelc,l,synofzikm,lohmannh,dettmannim,deppem,mindorfs,warnecket,dennoy,teegenb,probstc,brakopps,wandingerkp,wiendlh,w,meuthsg,komorowskil,melzern,2016,neurochondrinisaneuronaltargetantigeninautoimmunecerebellardegeneration,neurolneuroimmunolneuroinflamm.；4(1):e307))。将每个生物芯片镶嵌体(biochipmosaic)与70μl经pbs稀释的样品在室温下孵育30分钟，用pbs-tween洗涤并浸入pbs-tween中5分钟。在第二步中，应用alexa488标记的山羊抗人igg(jacksonresearch,suffolk,unitedkingdom)或异硫氰酸荧光素(fitc)标记的山羊抗人igg(euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag,lübeck)并在室温孵育30分钟。用pbs-tween冲洗再次洗涤载玻片，然后浸入pbs-tween中5分钟。将载玻片埋在pbs缓冲的含甘油的dabco(每个视野约20μl)中并通过荧光显微镜检查。包括阳性和阴性对照。与未转染的细胞和对照样品直接比较，根据转染细胞的荧光强度将样品分类为阳性或阴性。终点效价是指能够显示可见荧光的最后稀释度。

由两个独立观察员使用eurostarii显微镜(euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag,lübeck,germany)评估结果。如果没有另外指定，从merck,darmstadt,germany和sigma-aldrich,heidelberg,germany获得试剂。

免疫印迹

溶于0.1％triton-x-100、1mmedta缓冲液、150mmnacl、100mmtrisph7.4中免疫沉淀的小脑裂解物或表达seqidno2或seq-id4或seq-id5或seq-id7的hek293细胞裂解物与含有25mmol/l二硫苏糖醇的nupagelds样品缓冲液(thermofisherscientific,schwerte,germany)在70℃孵育10分钟，然后进行sds-page(nupage,thermofisherscientific,schwerte,germany)。根据制造商的说明，通过用转移缓冲液(thermofisherscientific)进行槽印迹将分离的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。用universalblotbufferplus(euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag,lübeck)封闭膜15分钟，并与患者或对照血清(1:200稀释)或针对stx1b的单特异性小鼠抗体(r+dsystems,mab6848,1:10,000)在universalblotbufferplus中孵育3小时，然后用universalblotbuffer(euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag，lübeck)进行3次洗涤步骤，用抗人igg-ap(euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag，lübeck，1:10)或抗小鼠igg-ap(1:2,000)在universalblotbufferplus中进行30分钟的第二次孵育，3次洗涤步骤，并用nbt/bcip底物(euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag，lübeck)染色。如果没有另外指定，试剂从merck,darmstadt,germanyorsigma-aldrich,heidelberg,germany获得。

抗原的鉴定

解剖大鼠的小脑并在液氮中快速冷冻。用miccrad-8(roth,karlsruhe,germany)和手动匀浆器(sartorius,germany)在含有蛋白酶抑制剂(completemini,rochediagnostics,penzberg,germany)的增溶缓冲液(100mmol/ltris-hclph7.4、150mmol/l氯化钠、2.5mmol/l乙二胺四乙酸、0.5％(w/v)脱氧胆酸钠、1％(w/v)tritonx-100)中将组织在4℃下匀浆。将组织裂解物在4℃下以21,000×g离心15分钟，并将澄清上清液与患者血清(1:16.7稀释)在4℃一起孵育过夜。然后将样品与蛋白gdynabeads(thermofisherscientific,dreieich,germany)在4℃孵育3小时以捕获免疫复合物。珠粒用pbs洗涤3次，并用含有25mmol/l二硫苏糖醇的nupagelds样品缓冲液(thermofisherscientific,schwerte,germany)在70℃洗脱10分钟。用59mm碘乙酰胺(bio-rad,hamburg,germany)进行脲甲基化(carbamidomethylation)，然后进行sds-page(nupage,thermofisherscientific,schwerte,germany)。用考马斯亮蓝(g-250)(merck)使分离的蛋白质可视化，并通过质谱分析对其进行鉴定。

质谱

从考马斯亮蓝g-250染色凝胶中切下可见的蛋白条带。脱色和胰蛋白酶消化后，提取肽并用α-氰基-4-羟基肉桂酸点样到mtpanchorchip^tm384tf靶体上。

使用flexcontrol3.4软件，使用autoflexiiismartbeamtof/tof200系统进行maldi-tof/tof测量。以质量范围为600da-4,000da和以用4,000-10,000个轰击(shot)的正离子反射器模式记录肽质量指纹图谱(pmf)的质谱图。质谱用商购可得的peptidecalibrationstandardii进行外部校准，用flexanalysis3.4进行处理，峰值列表用biotools3.2进行分析。

mascot检索引擎mascotserver2.3(matrixscience，london，uk)用于通过对ncbi或swissprot数据库限于哺乳动物(mammalia)进行检索来进行蛋白质鉴定。检索参数如下：质量容忍度设定为80ppm，接受一个错过的切割位点，并且半胱氨酸残基的脲甲基化以及甲硫氨酸残基的氧化分别设定为固定和可变修饰。为了评估蛋白质命中，选择p<0.05的显著性阈值。

为了进一步确认pmf命中，使用biotools的warp反馈机制选择每个鉴定蛋白质的2至5个肽用于ms/ms测量。分别用400和1000个轰击记录母体和碎片质量。用0.7da的碎片质量容忍度如上所述处理和分析质谱。

在hek293中重组表达nsf、stx1b和vamp2

通过对脑总rna进行rt-pcr获得人nsf的编码dna(seqidno1)，引物为atacgtctcacatggcgggccggagcatgcaag([有义nsf]，seqidno8)和tatcgtctcctcgatcaatcaaaatcaagggggctag([反义nsf]seqidno9)。扩增产物用bsmbi和dpni消化。将消化的cdna与ptriex-1(merck,darmstadt,germany)连接。所得构建体(seqidno15)编码seqidno2。

通过对脑总rna进行rt-pcr获得人stx1b的编码dna(seqidno3)，引物为atacgtctcacatgaaggatcggactcaagagctgc([有义stx1b]，seqidno10)和atacgtctcctcgagctacaagcccagcgtccccccaatg([反义stx1b]，seqidno11)或atacgtctcctcgagtttcttcctccgggccttgctctg([反义stx1b(ic)-his]，seqidno12)。扩增产物用esp3i和dpni消化。将消化的cdna与ptriex-1(merck,darmstadt,germany)连接。所得构建体(seqidno16和seqidno17)编码seqidno4和seqidno5。

通过对脑总rna进行rt-pcr获得人vamp2的编码dna(seqidno6)，引物为atacgtctctcatgtctgctaccgctgccacggccc([有义vamp2]，seqidno13)和atacgtctcctcgagttaagtgctgaagtaaactatgatg([反义vamp2]，seqidno14)。扩增产物用esp3i和dpni消化。将消化的cdna与ptriex-1(merck,darmstadt,germany)连接。所得构建体(seqidno18)编码seqidno7。

根据制造商的说明，在exgen500介导的转染(thermofisherscientific)后，将nsf、stx1b和vamp2分别在人细胞系hek293中表达。在标准细胞培养瓶(t-flask)中转染细胞并在5天后收获细胞。细胞沉淀用增溶缓冲液提取。将提取物以等分试样储存在-80℃直至进一步使用。

患者自身抗体的表征

使用小脑经通透的冰冻切片进行的血清p1至p2的间接免疫荧光测定(ifa)显示分子层和颗粒层的平滑染色(图1)。使用表达30种神经自身抗原的重组hek293细胞进行进一步的单特异性分析，所述30种神经自身抗原为hu、yo、ri、cv2、pnma2、sox1、itpr1、homer3、carpviii、arhgap26、zic4、dner/tr、gad65、gad67、双载蛋白、恢复蛋白、gabab受体、甘氨酸受体、dppx、iglon5、谷氨酸受体(类型nmda、ampa、mglur1、mglur5、glurd2)、lgi1、caspr2、aqp4(m1和m23)、mog、atp1a3和ncdn。没有观察到特异反应性。

鉴定stx1b为靶神经元自身抗原

用p1和p2获得的来自匀浆的大鼠小脑的免疫沉淀物在考马斯染色的sds-page中呈现约33kda的蛋白质，如果匀浆物与对照血清一起孵育则不存在(图2a)。使用maldi-tofms，该蛋白质被鉴定为stx1b(uniprotacc.#p61265)。作为正确的抗原鉴定的证据，免疫沉淀物通过使用针对stx1b的抗体的蛋白质印迹来测试。如33kda带所示(图2b)，患者血清的免疫沉淀物含有stx1b。此外，使用表达stx1b(seqidno4)的转染的hek293细胞通过ifa测试患者的样品(图3a)。患者血清和csf与表达stx1b的细胞发生反应。相反，模拟转染的细胞没有表现出任何特异性抗体结合。在使用stx1b(ic)-his(seqidno5)的免疫印迹中，两种样品也与重组his-stx1b反应(图3b)。

通过用含有stx1b(seqidno4)的hek293裂解物预孵育可消除患者自身抗体对组织的反应(图3c)。当使用来自模拟转染的hek293细胞的可比部分时，抗体结合不受影响。

抗stx1b自身抗体的特异性

平行于患者样品的用hek293-stx1b-his通过ifa分析来自33个患有各种神经自身抗体相关的神经系统综合征的患者的血清(3x抗caspr2、3x抗nmdar、3x抗lgi1、3x抗hu、3x抗ri、2x抗yo/抗ri、3x抗yo、3x抗aqp4、10x抗gad65)、10个具有与患者1和2相似的染色模式而没有已知的抗神经自身抗体反应性的血清和45个健康对照。没有一种健康对照血清产生与患者血清在大鼠脑组织上相似的免疫荧光模式，当对表达stx1b的hek293细胞测试时，所有均为阴性。预先诊断为具有僵人综合征的10个抗-gad65阳性血清中的两个(p6、p7)和就小脑而言具有与患者1和2相似的染色模式的10个血清中的两个(p3、p4)在用重组stx1b进行的ifa和蛋白质印迹中呈阳性(图4)。

对其他snare复合蛋白的反应性

通过使用重组表达nsf(seqidno2)和vamp2(seqidno7)的转染的hek293细胞的ifa或蛋白质印迹筛查疑似患有自身免疫性脑炎的患者的抗stx1b阳性和额外血清揭示了三个抗nsf(p3、p6、p7)阳性(图5)和一个抗vamp2(p5)阳性样品(图6b)，所述患者特征在于产生具有与指标血清或具有神经系统症状和确定的抗神经自身抗体的患者的血清相似的ifa模式。模拟转染的细胞不显示任何特异性抗体结合。p3和p5产生了就大鼠脑组织而言与指标患者血清(p1、p2)相似的免疫荧光模式(图4a和图6a)。p6和p7为抗gad65阳性并诊断为僵人综合征。三个抗nsf阳性血清(p3、p6、p7)也是抗stx1b阳性的(图4)。45个健康对照中没有一个显示出分别针对nsf和vamp2的阳性反应。

序列表

<110>欧蒙医学诊断技术有限公司

<120>神经自身免疫疾病的诊断

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