一种自闭症谱系障碍诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及医药诊断技术领域，具体涉及一种自闭症谱系障碍诊断试剂盒。

背景技术：

自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorder，asd)，是根据典型自闭症的核心症状进行扩展定义的广泛意义上的自闭症，既包括了典型自闭症，也包括了不典型自闭症，是一种较为严重的广泛性发展障碍疾病。典型自闭症患者主要特征体现为在社会性和交流能力、语言能力、仪式化的刻板行为三个方面同时都具有本质的缺损。其主要症状包括：1、社会交往障碍：一般表现为与他人交往困难或不愿意交往，严重者甚至与父母缺乏情感依恋；2、语言交流障碍：完全无语言、语言发育落后、语言能力倒退，或者鹦鹉学舌式重复语言；3、重复刻板行为：兴趣狭窄、异常动作频繁、性格固执不愿意接受改变。不典型自闭症则在前述三个方面不全具有缺陷，只具有其中之一或之二。

目前，自闭症的病因仍是世界医学的未解难题，且近几年患病率呈现出大幅提升的趋势。美国疾病预防控制中心发布2018年关于自闭症谱系障碍患病率的最新统计数据为1:59；患病率比2016年发布的数据1:68上升了15个百分点。自闭症在2岁时就能被确诊，但大多数儿童仍是在4岁以后才被诊断。早期诊断是至关重要的，因为早期干预提供了支持健康发展的最佳机会，并能在孩子们的整个生命周期内带来益处。现有技术中，还没有可以用于临床检测的分子诊断试剂盒来帮助早期诊断。因此，目前迫切需要一种具有高准确度的自闭症谱系障碍早期诊断技术。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够快速且准确诊断出自闭症谱系障碍的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种自闭症谱系障碍诊断试剂盒，包括抗体酶标板、生物素-抗体、标准蛋白、血清稀释液、链霉亲和素-辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)、hrp显色底物、hrp显色反应终止剂、阴性对照液和阳性对照液；

所述抗体酶标板上至少包被有特定抗体，所述特定抗体包括10种单克隆抗体，具体为白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-1receptorantagonist，il-1ra)、白细胞介素-6(interleukin-6，il-6)、il-8、il-12p70、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,bdnf)、单核细胞趋化蛋白(monocytechemoattractantprotein1,mcp-1)、骨桥蛋白(osteopontin，opn)、人干扰素(interferon-γ，ifn-γ)和转化生长因子(transforminggrowthfactor-β1，tgf-β1)。

进一步地，所述特定抗体还可以包括乳酸(lactate)、丙酮酸盐(pyruvate)、肉碱(carnitine)、谷氨酸盐(glutamate)、谷氨酰胺(glutamine)、二酪氨酸(dityrosine，dt)、nε-羧甲基-l-赖氨酸(nε-carboxymethyl-lysine，cml)、nω-羧甲基精氨酸(nω-carboxymethylarginine，cma)、3-脱氧葡糖醛酮(3-deoxyglucosone-derivedhydroimidazolone，3dg-h)、镉(cadmium，cd)、铅(lead，pb)、铁(iron，fe)和维生素d(vitamind)、高半胱氨酸(homocystein)、睫状节神经细胞营养因子(ciliaryneurotrophicfactor，cntf)和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)中的一种或多种。

进一步地，所述抗体酶标板由以下方法制备得到：用ph为8.2的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs缓冲液)将所述特定抗体中的各种抗体的浓度分别稀释至20-100μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为2-8℃的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗涤，所述洗涤液为含有0.05％吐温(tween-20)，ph为7.4的磷酸盐缓冲液，干燥后即得所述抗体酶标板。

进一步地，所述生物素-抗体的制备方法为：将所述10种单克隆抗体分别与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素后即得所述生物素-抗体。

进一步地，所述血清稀释液由以下组分组成：人胰岛素6u/ml、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钠3g/l、硫酸钠5g/l、氯化钠22g/l、脱氧胆酸钠12g/l、乙二胺四乙酸二钾(dipotassiumethylenediaminetetraacetate，edta-2k)0.5g/l，溶剂为水。

进一步地，所述血清稀释液的ph值为6.4。

优选地，所述显色底物为四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，tmb)。

进一步地，所述tmb的浓度为0.4mg/ml。

进一步地，所述hrp显色反应终止剂为硫酸或盐酸。

进一步地，所述硫酸的浓度为2mol/l，所述盐酸的浓度为1mol/l。

进一步地，所述阴性对照液为不含所述特定抗体的正常人血清；所述阳性对照液为含有特定抗体的正常人血清。

进一步地，所述标准蛋白为任意可用于定量的蛋白质，如牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)等。

本发明的有益效果在于：本发明方案诊断试剂盒，通过对10种与自闭症谱系障碍相关的炎症免疫因子的定量分析，作为该综合症的辅助诊断手段，显著提高了临床确诊率；本发明方法还可以通过与线粒体功能障碍和/或氧化应激等相关因子检测结果结合以进一步提升临床确诊率；解决了现有技术中自闭症谱系障碍诊断手段匮乏问题；本发明试剂盒的诊断结果可为自闭症谱系障碍的临床诊断提供客观的实验室依据；本发明方案在常规的酶联免疫吸附试验的基础上，通过生物素与链霉亲和素-hrp之间的作用，建立了一种高灵敏度的生物素-酶联免疫检测试剂盒，以测定待测样本中的il-1ra、il-6、il-8、il-12p70、egf、bdnf、mcp-1、opn、ifn-γ和tgf-β1共10种相关免疫因子的表达水平；由于生物素极易与抗体等蛋白质以共价键结合，因此，有生物素标记的单克隆抗体中的生物素易与链霉亲和素-hrp产生反应，既起到了多级放大的作用，同时，由于酶在遇到相应的显色底物时会发生催化作用而显色，从而达到检测目标抗原或抗体分子的目的；本发明方案诊断试剂盒能够有效、稳定地测定患者血清中10种相关免疫细胞因子的含量，其灵敏度高，测试重复性好；此外，本发明方案试剂盒由于可以检测自闭症谱系障碍患者体内的10种相关免疫细胞因子的表达水平，对提高自闭症谱系障碍的临床诊断率具有重要意义，同时还有利于患者的早期诊断和预后处理，本发明方案试剂盒在自闭症谱系障碍的预防及治疗过程中都具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中血清各检测内容浓度与参考浓度的比值图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明实施例为：一种自闭症谱系障碍诊断试剂盒，包括抗体酶标板、生物素-抗体、血清稀释液、bsa、硫酸、链霉亲和素-hrp、四甲基联苯胺、阴性对照液和阳性对照液；所述抗体酶标板上包被有特定抗体，所述特定抗体包括10种单克隆抗体，具体为il-1ra、il-6、il-8、il-12p70、egf、bdnf、mcp-1、opn、ifn-γ和tgf-β1。

上述自闭症谱系障碍诊断试剂盒的制备过程如下：

抗体酶标板的制备：如上所述10种单克隆抗体从生物公司定制(任一生物公司定制均可)，用ph为8.2的pbs缓冲液将各单克隆抗体稀释至60μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗涤，所述洗涤液为含有0.05％tween20，ph为7.4的磷酸盐缓冲液，甩干，得包被有抗单克隆抗体的96孔酶标板。

上述自闭症谱系障碍诊断试剂盒的使用步骤如下：

1、加样：

(1)包被有单克隆抗体的96孔酶标板处理：在包被有单克隆抗体的96孔酶标板上划分阳性对照孔区、阴性对照孔区、待测样品孔区和空白孔区，共四组检测孔区，阳性对照孔区中加入阳性对照液，100μl/孔，阴性对照孔区中加入阴性对照液，100μl/孔，待测样品孔区中加入待测血清样本，100μl/孔，样本加完后，然后每孔加入50μl量的浓度为0.5％的牛血清白蛋白和50μl量的血清稀释液，所述的血清稀释液为：人胰岛素6u/ml、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钠3g/l、硫酸钠5g/l、氯化钠22g/l、脱氧胆酸钠12g/l、edta-2k0.5g/l，加水调节ph值为6.4；在酶标板上加盖或者覆膜，在37℃条件下放置2h后弃去液体，用洗涤液洗涤后甩干；

(2)加入生物素-单克隆抗体：每个检测孔中加入100μl生物素-单克隆抗体，在37℃条件下放置1h后弃去液体，每个检测孔中加入350μl洗涤液浸泡2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干的动作重复3次；

(3)加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶：

每个检测孔中加入100μl的链霉亲和素-辣根过氧化物酶，在37℃条件下放置1h后弃去液体，每个检测孔中加入350μl洗涤液浸泡2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干的动作重复5次；

(4)加入显色底物：

在每个检测孔中依次加入一滴浓度为0.4mg/ml四甲基联苯胺，在37℃条件下避光，显色；

(5)加入终止液：

按照上述显色底物的加入顺序依次在每个检测孔中加入50μl终止液(2mol/l硫酸)，终止反应，终止反应的表现为检测孔中的液体由蓝色快速转变成黄色。

2、结果检测：

在加入终止液后15min内，用酶联仪在450nm的波长条件下检测每个检测孔的光密度od值，检测试剂盒的检测标准为：以标准品的浓度为纵坐标(也可以采用对数坐标)，od值为横坐标(也可以采用对数坐标)，使用curveexpert1.30软件绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算得到的r2值来定，以r2值越趋近于1为好)，计算样品的实际浓度。

自闭症谱系障碍诊断试剂盒多细胞因子参考值的确定是采用该试剂盒对200例正常人群的检测结果统计，以95％的正常人群的血清抗体浓度值来界定平均值，由于存在人群差异，只作为参考。通过对正常人群检测获得生物参考浓度如表1所示：

表1参考浓度

将上述自闭症谱系障碍诊断试剂盒用于临床测试实验，具体如下：

运用该自闭症谱系障碍诊断试剂盒对已确诊的一例自闭症谱系障碍患儿的血清进行炎症相关细胞因子的检测。该患儿血清各细胞因子浓度与参考浓度的比值图如图1所示，由图1可以看出，该比值基本在1左右，由此表明本发明方案可准确实现自闭症谱系障碍的诊断。

将上述自闭症谱系障碍诊断试剂盒进行临床测试统计分析和临床评估实验，具体如下：

通过对5例已确诊为自闭症谱系障碍的患儿进行血清学检测后得到的相应细胞因子浓度，进行统计分析后建立临床诊断评估体系，测得的5例自闭症谱系障碍患儿的细胞因子浓度对正常参考值的比值具体如表2所示，低于1者改为倒数统计。鉴于10种相关免疫细胞因子在自闭症谱系障碍中的作用机制各不相同，根据其重要性采用加权法对5例实验数据进行统计分析，得到5例加权平均值，再取其平均值为病例平均值1.58(p<0.05)。

表2asd血清浓度/参考浓度比值及加权平均值

本发明试剂盒的临床诊断方法为：高于加权平均值(例如1.58)的患者，结合临床症状，支持自闭症谱系障碍的诊断。鉴于患者的个体差异，将根据性别、年龄、病程长短、病情轻重等情况逐步细化并完善诊断标准。将本发明方案试剂盒用于临床检测，操作简便，结果准确可靠。

综上所述，本发明提供的一种自闭症谱系障碍诊断试剂盒，该试剂盒具有诊断效果准确可靠且操作简便等优点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。