一种基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器及其制备和应用的制作方法

本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器及其制备和应用。

背景技术：

艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒（hiv）引起。艾滋病病毒在侵入人体后，部分人在一段时间内会一直呈现无明显的症状，也就是潜伏期在每个人身体上潜伏时间的长短都是不同的。因此hiv感染检测对hiv的防治非常重要。一般情况下，病毒感染人体后，可通过一系列检测被发现，而最早能被检测到的是病毒核酸。核酸检测可直接检查hiv核酸，可在发现血清学变化之前检测hiv感染，而且比p24抗原检测方法更灵敏，能更早地发现病毒感染。hiv核酸定量检测定量方法一般有：rt-pcr和信号放大扩增两种方法，通常需要用到昂贵的仪器，且操作较为繁琐。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器及其制备和应用。该传感器具有简便，快捷，准确等特点，用于测定hiv核酸小分子时，线性范围为50-2000nm，检出限(3s/n)为20nmol/l。

为实现本发明的目的，采用如下技术方案：

一种基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器的制备方法，以g-c3n4纳米片为化学发光试剂的增强剂，以待测生物分子dna的互补链为生物识别元件；将g-c3n4纳米片、化学发光试剂、待测生物分子dna的互补链以及tris-hci缓冲液混合，制得基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器。

g-c3n4纳米片在传感器中的浓度为132-330mg/ml。

待测生物分子dna的互补链在传感器中的浓度为1-20nm。

一种如上所述的制备方法制得的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器。

一种如上所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器的应用，用于hiv核酸小分子的检测。

更进一步的，用于hiv核酸小分子的检测时，是以所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器为基质，将待测体系加入到所述的基于氮化碳信号放大的光电化学传感器中，联合紫外灯进行光照和化学发光荧光成像系统成像，在有hiv存在的体系中，所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器会产生发光强度增强，通过绘制已知hiv核酸小分子的浓度和发光强度的标准曲线，由所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器检测到的发光强度即可确定待测体系中hiv核酸小分子的浓度。

更进一步的，用于hiv核酸小分子的检测时，所述的化学发光试剂为mcla。

更进一步的，用于hiv核酸小分子的检测时，对hiv核酸小分子的线性范围为50-2000nm，检出限3s/n为20nmol/l。

更进一步的，用于hiv核酸小分子的检测时，采用350-400nm波长的紫外灯进行光照60s。

将本发明的传感器用于测定hiv核酸小分子时，具体步骤如下：

（1）标准曲线的建立：

①分别将化学发光试剂mcla、g-c3n4、hiv-dna的互补链和等体积不同浓度的hiv-dna标准溶液混合，加入tris-hci缓冲液，制得一系列待测试剂；

②将待测试剂加入酶标板中，在365nm紫外灯下光照60s后，置于化学发光荧光成像系统的暗室中，每次曝光时间为90s；

③通过软件读取以及换算，获得不同浓度的hiv-dna标准溶液所对应的发光强度；

④将步骤③所获得的数值绘制成标准曲线，线性回归方程为：y=1.622e⁸+2.084e⁷lg[x/(10^-8mol/l)]，相关系数为0.985；其中y为发光强度，x为hiv-dna标准溶液的浓度；

（2）实际试样的测定：

将化学发光试剂mcla、g-c3n4、hiv-dna的互补链和待测样混合，加入tris-hci缓冲液，制得待测样；将待测样经步骤（1）中的第②、③步继续进行测定，得到待测样的发光强度，代入线性回归方程中，即得到待测样中的hiv-dna浓度。

优选的，步骤①中待测试剂的总体积量为100μl；mcla的用量为15μl，在待测试剂中的浓度为0.15mg/ml；g-c3n4在待测试剂中的浓度为198mg/ml；hiv-dna的互补链在待测试剂中的浓度为1nm；hiv-dna标准溶液的体积为10μl；hiv-dna标准溶液的浓度范围为0-2000nm。

mcla：[2-甲基-6（-4-甲氧基苯基）-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]哌嗪-3-1-盐酸盐]，化学发光试剂。

步骤①中所述的hiv-dna的互补链，其序列为：actgctagagattttccacat。

步骤①中所述的tris-hci缓冲液的ph值为7.4。

步骤③所述的读取及换算为：用imagej软件读取酶标板每个孔的化学发光强度，该软件用光密度值表示发光强度；先选定发光区域的面积，通过测定固定面积内的光密度值，再来定量每孔的发光强度。

本发明荧光检测的机理在于：

g-c3n4纳米片能增强mcla的光致化学发光，且为固定hiv-dna互补链提供了一个很好的平台，dna分子在糖链（磷酸骨架）上带有负电荷的磷酸基团，g-c3n4纳米片带正电荷，g-c3n4可通过π-π相互作用和静电作用力与该ssdna探针结合，吸附在g-c3n4表面的ssdna占据了g-c3n4的催化活性位点，从而降低了光致化学发光信号。在存在目标hiv-dna的情况下，ssdna探针识别并结合目标hiv-dna以形成双螺旋链dna（dsdna）。形成的dsdna和g-c3n4之间的相互作用很弱，导致结合物脱离g-c3n4纳米片的表面，从而导致光化学发光信号恢复。

本发明与现有技术比较具有以下优点：

本发明的传感器具有简便，快捷，准确等特点，用于hiv核酸小分子的检测时，线性范围为50-2000nm，检出限(3s/n)为20nmol/l，灵敏度高。

附图说明

图1为本发明的原理示意图；probe-dna是指hiv-dna互补链；

图2为不同光照时间下光致化学发光强度的增加图；(a)0，(b)20，(c)40，(d)60，(e)80，(f)120，(g)140和(h)160s；tris-hcl缓冲液(ph=7.4)，mcla：0.15mg/ml，15μl；g-c3n4：264mg/ml；曝光时间=90s；试剂总量：100μl；

图3为g-c3n4浓度对pcl的影响图；(a)0，(b)66，(c)132，(d)198，(e)264，(f)330，(g)396and(h)462mg/ml；tris-hclbuffer(ph=7.4)；mcla：0.15mg/ml，15μl；曝光时间=90s；试剂总量：100μl；

图4为hiv-dna互补链探针浓度对pcl的影响图；探针dna：0，1，2，5，7，10，20，30*10^-7mol/l；g-c3n4:198mg/ml；tris-hclbuffer(ph=7.4)；mcla：0.15mg/ml，15μl；曝光时间=90s；试剂总量：100μl；

图5为添加目标hiv-dna后mcla的光化学发光恢复情况图；目标dna：0，2，5，20，50，100，200*10^-8mol/l；探针dna：7e^-7；mcla0.15mg/ml；c3n4：198mg/ml；tris-hclbuffer(ph=7.4)；37℃孵育1h；

图6为发光强度和目标dna浓度的线性图；

图7为混合物毛细管电泳图谱；a.探针和g-c3n4；b.探针/g-c3n4/目标dna(数量不足)；c.探测器/g-c3n4/目标dna(足够数量)。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。

一种基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器的制备方法，以g-c3n4纳米片为化学发光试剂的增强剂，以待测生物分子dna的互补链为生物识别元件；将g-c3n4纳米片、化学发光试剂、待测生物分子dna的互补链以及tris-hci缓冲液混合，制得基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器。

g-c3n4纳米片在传感器中的浓度为132-330mg/ml。

待测生物分子dna的互补链在传感器中的浓度为1-20nm。

一种如上所述的制备方法制得的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器。

一种如上所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器的应用，用于hiv核酸小分子的检测。

更进一步的，用于hiv核酸小分子的检测时，是以所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器为基质，将待测体系加入到所述的基于氮化碳信号放大的光电化学传感器中，联合紫外灯进行光照和化学发光荧光成像系统成像，在有hiv存在的体系中，所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器会产生发光强度增强，通过绘制已知hiv核酸小分子的浓度和发光强度的标准曲线，由所述的基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器检测到的发光强度即可确定待测体系中hiv核酸小分子的浓度。

更进一步的，用于hiv核酸小分子的检测时，所述的化学发光试剂为mcla。

更进一步的，用于hiv核酸小分子的检测时，对hiv核酸小分子的线性范围为50-2000nm，检出限3s/n为20nmol/l。

本发明以hiv核酸小分子的检测为例，进行详细说明。其他待测物质参照hiv核酸小分子的检测进行即可。

为了获得最佳的检测性能，研究了光照时间、g-c3n4浓度和hiv探针浓度对检测hivdna响应的影响。

1、光照时间对hiv-dna检测的影响

图2研究了光照时间对hiv-dna检测的的影响。可见pcl反应随光照时间从20s延长到160s而增加，图中发现光照60s发光最强烈。选取光照时间60s做后续实验。

2、g-c3n4浓度对hiv-dna检测的影响

图3研究了g-c3n4浓度对hiv-dna检测的影响，增加g-c3n4浓度后，由于g-c3n4催化mcla化学发光明显增加；当g-c3n4的浓度超过198mg/ml时，催化效果减弱，所以选择g-c3n4浓度为198mg/ml做后续实验。

3、探针浓度对hiv-dna检测的影响

在其他条件不变的情况下，从图4可以看出，随着探针浓度的增加，化学发光成像强度增加。当探针浓度达到1nm时，发光值抑制最明显。因此，选择探针的最适浓度1nm进行下一步实验。

4、在目标hiv-dna存在下，随着g-c3n4中dsdna的形成和释放，cl强度明显增强。结果表明，dsdna与g-c3n4的相互作用弱于ssdna与g-c3n4的相互作用。因此，目标分析物的存在可以恢复g-c3n4对mcla光致化学发光的增强作用。

随着目标hiv-dna浓度的增加，光化学发光强度逐渐增加，光化学发光强度相对于目标浓度的曲线在50-2000nm范围内对于靶具有良好的线性关系。线性回归方程表示为y=1.622e⁸+2.084e⁷lg[x/(10^-8mol/l)]，相关系数为0.985，根据3δ计算的hiv-dna的检测限（lod）为20nm。

5、毛细管电泳分离分析验证探针和目标hiv-dna的结合

毛细管电泳法被用于证明g-c3n4存在下探针和目标hiv-dna的特异性识别。互补链探针标有荧光标记。从图7中可以看出，曲线a中出现的峰，表示探针；曲线b中出现两个峰，1min处的新峰表示探针和g-c3n4的复合产物，4min处的仍然表示未参加反应的游离dna探针。将上述试样和目标hivdna孵育20小时。分析温育混合物。如图7曲线c只有一个强峰出现，这表明在g-c3n4存在下，探针和目标hivdna的特异性识别非常成功。

本发明基于g-c3n4的独特光催化性能，研制了一种新型的光致化学发光（pcl)成像法。采用在水中高分散的石墨相碳氮化物(g-c3n4)为催化剂，紫外光激发诱导产生活性氧增强氧化mcla的化学发光，以hiv-dna互补链为生物识别元件，用于hivdna序列的检测。实验结果表明，mcla在中性缓冲介质中显示出很强的光诱导化学发光响应；当使用适量的g-c3n4时，其光致化学发光响应增强。g-c3n4拥有大的比表面积和π共轭结构，可与hiv-dna互补链通过π-π堆砌作用紧密结合，封闭了g-c3n4的催化活性位点，导致mcla光致化学发光被抑制；当加入待测的hiv-dna链时，由于形成的dsdna(双螺旋链dna)和g-c3n4之间的作用减弱，dna双链倾向于远离g-c3n4纳米片的表面，因此发光信号恢复。uv光照射时间，试剂浓度等因素对光化学发光强度有影响，通过实验优化，得到最优条件为：光照60秒发光，g-c3n4的浓度198mg/ml，探针浓度1nm。该光致化学发光恢复的强度与hiv-dna序列的浓度成线性相关，线性范围为50-2000nm，检出限(3s/n)为20nmol/l，实验结果表明g-c3n4成功运用在光致发光成像传感器中，具有突出简便，快捷，准确等特点。

实施例1

一种基于氮化碳解吸附作用测定hiv核酸小分子的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）标准曲线的建立：

①分别将化学发光试剂mcla、g-c3n4、hiv-dna的互补链和等体积不同浓度的hiv-dna标准溶液混合，加入tris-hci缓冲液，制得一系列待测试剂；

②将待测试剂加入酶标板中，在365nm紫外灯下光照60s后，置于化学发光荧光成像系统的暗室中，每次曝光时间为90s；

③通过软件读取以及换算，获得不同浓度的hiv-dna标准溶液所对应的发光强度；

④将步骤③所获得的数值绘制成标准曲线，线性回归方程为：y=1.622e⁸+2.084e⁷lg[x/(10^-8mol/l)]，相关系数为0.985；其中y为发光强度，x为hiv-dna标准溶液的浓度；

（2）实际试样的测定：

将化学发光试剂mcla、g-c3n4、hiv-dna的互补链和待测样混合，加入tris-hci缓冲液，制得待测样；将待测样经步骤（1）中的第②、③步继续进行测定，得到待测样的发光强度，代入线性回归方程中，即得到待测样中的hiv-dna浓度。

步骤①中待测试剂的总体积量为100μl；mcla的用量为15μl，在待测试剂中的浓度为0.15mg/ml；g-c3n4在待测试剂中的浓度为198mg/ml；hiv-dna的互补链在待测试剂中的浓度为1μm；hiv-dna标准溶液的体积为10μl；hiv-dna标准溶液的浓度范围为50-2000nm。

步骤③所述的读取及换算为：用imagej软件读取酶标板每个孔的化学发光强度，该软件用光密度值表示发光强度；先选定发光区域的面积，通过测定固定面积内的光密度值，再来定量每孔的发光强度。

步骤（2）中待测样的总体积量为100μl；mcla的用量为15μl，在待测样中的浓度为0.15mg/ml；g-c3n4在待测样中的浓度为198mg/ml；hiv-dna的互补链在待测样中的浓度为1nm；待测样的体积为10μl。

鉴于安全性考虑，本发明只测试了模拟样，结果如表1所示。

表1：测定hiv-dna的回收率实验结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110>福州大学

<120>一种基于氮化碳解吸附作用的荧光传感器及其制备和应用

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>abedusherberti

<400>1

actgctagagattttccacat21