本发明属于体外诊断试剂原材料技术领域，具体涉及一种组织因子酯化物试剂及其制备方法与应用。
背景技术：
组织因子是一种蛋白质。目前国内外已经采用基因工程手段在大肠杆菌、真菌或动物细胞中表达生产组织因子。公开号为101294163b的中国专利利用基因工程手段在酵母中成功表达人重组组织因子。这种方法比传统的从动物组织中提取组织因子更为高效且产品纯度更高。组织因子与一定比例的磷脂混合能够形成组织因子酯化物。在酯化物中组织因子嵌入到磷脂双分子层形成的脂质体表面。组织因子酯化物能有效激活外源性的凝血途径而常常用于凝血酶原时间(pt)检测试剂盒的制备。传统上组织因子酯化物常从动物组织中提取，如上海太阳公司的pt试剂从兔脑组织中提取组织因子酯化物，而西门子公司是从人胎盘中提取的。这种天然提取的组织因子中已经含有磷脂，因此不需要额外添加磷脂。天然提取的组织因子酯化物易受到多种因素影响，如动物或人的年龄、性别、饮食、个体差异等均对组织因子的含量和磷脂的成分和含量影响较大。不同磷脂组成和含量，不同组织因子含量对pt试剂的检测效果差异明显。这也是导致pt检测试剂盒批间差异大的主要原因之一。采用基因工程手段制备的组织因子与一定比例的磷脂混合制备出的组织因子酯化物由于成分明确，工艺可控能够有效的降低pt检测试剂盒的批间差。目前国内的组织因子酯化物生产厂家有太原博奥特、青岛康达等。然而市售产品价格偏高，限制其推广使用。
技术实现要素：
本发明针对现有技术不足，提供一种组织因子酯化物试剂及其制备方法与应用，该组织因子酯化物试剂均具备成本低、稳定性好、可长期保存的优点。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
本发明提供一种组织因子酯化物试剂，包括重组兔组织因子、合成磷脂和含有稳定剂的缓冲液；
所述重组兔组织因子在试剂中的浓度为1μg/ml；
所述合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇组成，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇的质量比为3:6:0:1、3:3:3:1、3:0:3:4或0:3:3:4，试剂中，合成磷脂在试剂中的浓度为250μg/ml；
所述稳定剂由甘油、葡萄糖和阿魏酸组成，甘油、葡萄糖和阿魏酸在缓冲液中的浓度依次为10％、5％、0.02％，或者为12％、5％、0.02％，或者为7％、3％、0.02％，或者为10％、5％、0.01％，或者为12％、5％、0.01％。
优选的是，试剂中还含有0.02％-0.1％防腐剂。
更优选的是，所述防腐剂的浓度为0.05％。
优选的是，所述防腐剂为叠氮钠和/或proclin300。
优选的是，所述缓冲液为pbs缓冲液、tris缓冲液或hepes缓冲液。
更优选的是，所述缓冲液的浓度为20mm。
本发明还提供上述组织因子酯化物试剂的制备方法，步骤如下：
步骤一、将磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇按配比混合，得到合成磷脂；
步骤二、将合成磷脂和表面活性剂混合，混匀后使合成磷脂完全溶解，得到第一混合溶液，第一混合溶液中合成磷脂的浓度为35mg/ml；
步骤三、向第一混合溶液中加入重组兔组织因子，混匀后，室温搅拌孵育4h，得到重组兔组织因子的浓度为80-120μg/ml的第二混合溶液，采用透析的方式去除第二混合溶液中的表面活性剂，得到重组兔组织因子酯化物；
步骤四、用含有稳定剂的缓冲液稀释步骤三得到的重组兔组织因子酯化物，得到组织因子酯化物试剂。
优选的是，步骤二中，所述表面活性剂为椰油酰基甘氨酸钾、椰油基葡糖苷、椰油酰胺丙基甜菜碱或正辛基吡喃葡萄糖苷。
优选的是，步骤三中，所述透析的方式为：将第二混合溶液转移至透析袋中，每隔4h透析一次，共透析五次，去除表面活性剂。
本发明还提供上述组织因子酯化物试剂在制备凝血酶原时间检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的组织因子酯化物试剂通过调整合成磷脂、稳定剂和缓冲液的种类、配比，具备成本低、稳定性高、可长期保存的优点，具体的：
本发明的组织因子酯化物试剂，组分清晰，克服了现有技术中天然提取的组织因子酯化物种类和含量不明，批间差异大的技术问题；
本发明的组织因子酯化物试剂采用磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇作为合成磷脂，采用甘油、葡萄糖和阿魏酸作为稳定剂，能够有效提高组织因子酯化物的稳定性。
2、本发明的组织因子酯化物试剂能够直接用于pt检测试剂使用，为组织因子酯化物的推广应用提供依据。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明提供一种组织因子酯化物试剂，包括重组兔组织因子、合成磷脂、稳定剂及缓冲液；其中，
重组兔组织因子在试剂中的浓度为1μg/ml；
合成磷脂由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇组成，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇的质量比为3:6:0:1、3:3:3:1、3:0:3:4或0:3:3:4，优选合成磷脂由质量比为3:6:1的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇组成，合成磷脂在试剂中的浓度为250μg/ml；
稳定剂由甘油、葡萄糖和阿魏酸组成，甘油、葡萄糖和阿魏酸在缓冲液中的浓度依次为10％、5％、0.02％，或者为12％、5％、0.02％，或者为7％、3％、0.02％，或者为10％、5％、0.01％，或者为12％、5％、0.01％。
上述技术方案中，为进一步增强试剂的稳定性，组织因子酯化物试剂还可以包括防腐剂，防腐剂的浓度为0.02％-0.1％，优选为0.05％；防腐剂优选为叠氮钠和/或proclin300。
上述技术方案中，缓冲液为本领域常用缓冲液，如pbs缓冲液、tris缓冲液或hepes缓冲液，浓度优选为20mm。
本发明还提供上述组织因子酯化物试剂的制备方法，步骤如下：
步骤一、将磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇按质量比为3:6:3:1、3:3:3:1、3:0:3:4或0:3:3:4混合，得到合成磷脂；
步骤二、将合成磷脂和表面活性剂混合，混匀后使合成磷脂完全溶解，得到第一混合溶液，第一混合溶液中合成磷脂的浓度为35mg/ml；
其中，表面活性剂优选为椰油酰基甘氨酸钾、椰油基葡糖苷、椰油酰胺丙基甜菜碱或正辛基吡喃葡萄糖苷，尤其优选为椰油基葡糖苷；
步骤三、向第一混合溶液中加入重组兔组织因子，混匀后，室温搅拌孵育4h，得到重组兔组织因子的浓度为80-120μg/ml的第二混合溶液，采用透析的方式去除第二混合溶液中的表面活性剂，得到重组兔组织因子酯化物；
其中，透析的方式为：将第二混合溶液转移至透析袋中，每隔4h透析一次，共透析五次，去除表面活性剂；
步骤四、用含稳定剂的缓冲液将合成的重组兔组织因子酯化物稀释，至含1μg/ml的重组兔组织因子和250μg/ml合成磷脂，即为组织因子酯化物试剂；
其中，稳定剂由甘油、葡萄糖和阿魏酸组成，甘油、葡萄糖和阿魏酸在缓冲液中的浓度依次为10％、5％、0.02％，或者为12％、5％、0.02％，或者为7％、3％、0.02％，或者为10％、5％、0.01％，或者为12％、5％、0.01％；
当组织因子酯化物试剂含有防腐剂时，将防腐剂按照配比，在步骤四中随含稳定剂的缓冲液一并添加。
本发明还提供上述组织因子酯化物试剂在制备凝血酶原时间检测试剂盒中的应用。
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
组织因子酯化物试剂的制备，步骤如下；
步骤一、按表1的配比，分别称取各配方的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇，混合均匀后，得到合成磷脂；
步骤二、将合成磷脂与表面活性剂混合，混匀后使合成磷脂完全溶解，得到混合溶液，其中，合成磷脂的终浓度为35mg/ml；
步骤三、按表1的配比，分别向各配方的混合溶液中加入重组兔组织因子，重组兔组织因子的终浓度为120μg/ml，混匀后，室温搅拌孵育4h，得到的溶液转移至透析袋中，每隔4h透析一次，共透析五次，去除表面活性剂，得到重组兔组织因子酯化物；
步骤四、用含10％的甘油、5％的葡萄糖和0.02％的阿魏酸的tris缓冲液稀释步骤三得到的重组兔组织因子酯化物，得到含1μg/ml的重组兔组织因子和250μg/ml合成磷脂的组织因子酯化物试剂。
表1实施例1的组织因子酯化物试剂采用的配方的组成和配比
表1中，百分号表示物质在合成磷脂中所占质量百分比。
采用实施例1的组织因子酯化物试剂测定正常血浆的凝血时间，所得结果见表2所示。
表2实施例1的组织因子酯化物试剂测定正常血浆的凝血时间
从表2看出，由表1中的方1-4制备的组织因子酯化物试剂测定的结果均在正常范围，其中方1接近参考区间中间值，说明合成磷脂优选由质量比为3:6:1的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇组成。
实施例2
将实施例1中的方1中的表面活性剂分别更换为椰油酰基甘氨酸钾、椰油基葡糖苷和椰油酰胺丙基甜菜碱，制备合成组织因子酯化物试剂(具体配方的组成和配比见表3)，其他与实施例1相同。
表3实施例2的组织因子酯化物试剂采用的配方的组成和配比
表2中，百分号表示物质在合成磷脂中所占质量百分比。
采用实施例2的组织因子酯化物试剂测定正常血浆的凝血时间，所得结果见表4所示。
表4实施例2的组织因子酯化物试剂测定正常血浆的凝血时间
从表4看出，由表3中的方1、方5、方6和方7制备的组织因子酯化物试剂测定的结果在正常范围，其中方1接近参考区间中间值。说明本发明试剂优选采用椰油基葡糖苷作为表面活性剂。
实施例3
组织因子酯化物试剂的制备，步骤如下：
步骤一、将磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇按质量比3:6:1混合，得到的合成磷脂；
步骤二、将合成磷脂和椰油基葡糖苷溶液混合，混匀后使合成磷脂完全溶解后，得到混合溶液，合成磷脂的终浓度为35mg/ml；
步骤三、向混合溶液中加入重组兔组织因子，重组兔组织因子的终浓度为120μg/ml，混匀后，室温搅拌孵育4h，采用透析的方式去除椰油基葡糖苷，得到重组兔组织因子酯化物；
步骤四、按照表5的配比，分别用含不同稳定剂的tris缓冲液将步骤三得到的重组兔组织因子酯化物稀释，至含1μg/ml的重组兔组织因子和250μg/ml合成磷脂，即为组织因子酯化物试剂。
表5实施例3中不同的含稳定剂的tris缓冲液中稳定剂的组成
表5中，百分号表示物质在tris缓冲液中所占质量百分比。
采用实施例3的组织因子酯化物试剂测定正常血浆的凝血时间，所得结果见表6所示。
表6实施例3的组织因子酯化物试剂测定正常血浆的凝血时间
从表6看出，由表5中的方1、方9、方11、方15和方16制备组织因子酯化物配制的组织因子酯化物试剂测定结果在正常范围。
实施例4
按照表7的配比，分别将不同种类不同用量的防腐剂加入实施例1的组织因子酯化物试剂中。
表7实施例4的组织因子酯化物试剂的防腐剂组成和配比
表7中，百分号表示防腐剂在组织因子酯化物试剂中所占质量百分比。
将实施例4的试剂在37℃放置7天后，测定质控品的凝血时间，所得结果见表8所示。
表8实施例4的组织因子酯化物试剂测定质控品的凝血时间
从表8可以看出，方17-22制备的组织因子酯化物试剂测定结果均在参考范围。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。