针对呕吐毒素的TiO2-B整合型免过氧化氢电致化学发光传感器的构建的制作方法

本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种针对呕吐毒素的tio2-b整合型免过氧化氢电致化学发光传感器的构建及应用。

背景技术：

免疫传感器，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点，已经被广泛地应用于临床诊断、药物分析和环境监测等领域。本发明以tio2-b为载体，其大的比表面积能够有效负载大量的反应加速剂和发光试剂，最终成功制备了一个高效的的整合型电致化学发光探针，其可以在无过氧化氢参与的条件下实现对呕吐毒素的高灵敏检测。

tio2-b纳米材料具有比表面积大、生物相容性好、光散射和光捕获能力强等优点，可被应用于电致化学发光免疫传感器的制备中。本发明以tio2-b纳米材料为载体制备了一种高质量的整合型电致化学发光探针，无需添加共反应试剂过氧化氢就可获得高强度的电致化学发光信号，再结合经典的夹心型免疫传感方法，最终实现了对呕吐毒素（don）的高灵敏、高稳定性检测。其优异性体现在tio2-b纳米材料大的比表面积，能够承载大量的增敏剂氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）和发光试剂鲁米诺（luminol），最终构建了一种针对呕吐毒素的tio2-b整合型免过氧化氢电致化学发光传感器。

呕吐毒素（don），真菌毒素家族成员之一，是由某些真菌产生的次生代谢产物，最初见于小麦、大麦和玉米中，don能够破坏神经功能，包括神经内分泌信号，生长激素信号传导和中枢神经元网络，它作为一种蛋白质合成抑制剂，会影响肠道上皮蛋白的合成和屏障的完整性。本发明以don为检测目标物，充分发挥所制备的整合型电致化学发光探针的优异性，利用抗原与抗体之间的特异性结合，实现对don的微量检测。更具有意义地是，所制得的免h202的整合型电致化学发光免疫传感平台，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测限低等优点，不仅可用于呕吐毒素（don）的检测，还在临床应用方面具有非常重要的应用价值及实际意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是以tio2-b纳米材料作为有效载体，制备一种整合型电致化学发光探针，从而构建一种简易、快速、稳定性好，灵敏度高的免过氧化氢电致化学发光免疫传感器。

本发明的目的之二是将该电致化学发光免疫传感器应用于呕吐毒素的高灵敏检测。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

1.一种针对呕吐毒素的tio2-b整合型免过氧化氢电致化学发光传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）玻碳电极（gce）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；

（2）取1ml3mg/ml的介孔纳米二氧化锰（mpmno2）与1ml5mg/ml的透明质酸（ha）在超声作用下混合均匀，将得到的均质溶液在室温下机械振荡4h，经离心、洗涤，再分散制得ha@mpmno2复合物溶液；滴加5μl浓度为3mg/mlha@mpmno2复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得ha@mpmno2修饰玻碳电极；

（3）以0.1mol/l的高氯酸锂（liclo4）为溶剂，在乙腈（acetonitrile）溶液中溶解0.01mol/l3,4-乙撑二氧噻吩(edot)单体，在-0.5至1.0v的电位窗口下，用循环伏安法在步骤（2）制备的电极上连续扫描6次，最终的到pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极；

（4）取5μl浓度比为2:1的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（edc）及n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）混合液滴加到步骤（3）制得的修饰的电极上并在室温下反应40min，红外灯下烘干，冷却至室温，再滴加5μl浓度为50ug/ml呕吐毒素抗体（ab1）溶液在室温下孵育50min，随后用去离子水洗去物理吸附的ab1，制得ab1@pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极；

（5）取体积比为2:1的5mg/mltio2-b溶液与1.0wt.%bsa在室温下混合震荡5h，洗涤、离心、再分散得到tio2-b@bsa复合物溶液；然后向上述混合溶液中加入100μl1.0×10^-6mol/l氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）并在室温下温和摇晃1h,经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs复合物溶液；再依次向上述溶液中加入100μl1.0×10^-2mol/l鲁米诺，50μl5wt.%戊二醛溶液，室温下混合震荡4h，经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol复合物溶液,最后再加入100μl50ug/ml呕吐毒素igg抗体（ab2）溶液在室温下震荡50min，经离心、洗涤、再分散制得整合型电致化学发光探针（tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2）复合物溶液，储存在4°c冰箱中备用；

（6）将步骤（4）获得的修饰电极浸入不同浓度的呕吐毒素（don）标准溶液中并室温下孵育40mim，用去离子水冲洗电极表面，制得don/ab1@pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极，然后取5μl步骤（5）制备的整合型电致化学发光探针（tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2）复合物溶液滴加到don/ab1@pedot@ha@mpmno2修饰的玻碳电极上，在室温下孵育50min，用去离子水冲洗电极表面，制得tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2/don/ab1@pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极。

1.上述的介孔纳米二氧化锰（mpmno2）由下述方法制备的：以阳离子表面活性剂软模板法为基础，将2g1-十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于200ml无水乙醇中，然后在强搅拌条件下依次向上述混合溶液中滴加kmno4和乙酸锰mn(ch3coo)2并在该搅拌条件下保持数小时，然后将得到的深棕色沉淀经离心、洗涤数次，最后在80℃下干燥8h，得到介孔纳米二氧化锰（mpmno2）。

2.上述tio2-b纳米材料由下述方法制备的：4g锐钛矿型tio2均匀分散在60m的koh水溶液中并在室温下搅拌10min，然后将得到的悬浮液移到100ml四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在170℃下保持72min，待冷却至室温后，用稀释的hac溶液洗涤所得到的沉淀直至ph值达到7.0，离心，在60°c下干燥12h，得到最终的产物；然后将600mg前驱体钛酸盐纳米线分散到100ml16mhac溶液中，再将该混合液转移到200ml四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在180℃下加热24h，经离心，分别用蒸馏水和乙醇彻底洗涤后，再在60℃下干燥一夜，得到最终的目标产物tio2–b。

3.上述的整合型电致化学发光探针（tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2）复合物溶液由下述方法制备的：1）体积比为2:1的5mg/mltio2-b溶液与1.0wt.%bsa在室温下混合震荡5h，洗涤、离心、再分散得到tio2-b@bsa复合物溶液；2)向上述混合溶液中加入100μl1.0×10^-6mol/l氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）并在室温下温和摇晃1h,经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs复合物溶液；3）依次向上述复合物溶液中加入100μl1.0×10^-2mol/l鲁米诺，50μl5wt.%戊二醛溶液，室温下混合震荡4h，经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol复合物溶液,最后再加入100μl50ug/ml呕吐毒素igg抗体（ab2）溶液在室温下震荡50min，经离心、洗涤、重新分散于去离子水中制得tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2复合物溶液，储存在4°c冰箱中备用。

上述的氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）由以下步骤合成的：1）将8g的1，4-二羟基苯分散在28ml浓硫酸中，在0℃下连续搅拌30min，然后依次向上述混合液中加入20g三氟乙酸乙酯和40ml浓硫酸，在室温下搅拌12h，为了沉淀出更多的产物，将粗品转移到冰水中，用超纯水多次过滤和洗涤，经60℃真空干燥后，得到淡黄色晶体6-羟基-4-三氟甲基-1，2-苯并吡喃(氟-香豆素)；2）向200ml圆形底烧瓶中分别加入0.46g上述制备的氟-香豆素、0.42g二氯化硅、100ml甲苯和3.0ml吡啶，然后将混合物回流并在110℃磁搅拌下保持48h，冷却至室温后，再用硅胶色谱进一步纯化，得到粗产物；3）经旋转蒸发器下干燥后，制得氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）。

4.呕吐毒素（don）的检测步骤：

（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以上述制备的夹心型免疫传感器为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1mol/mlph8.0的pbs缓冲溶液中进行测试；

（2）采用电位范围-0.5-1v，扫描速率0.05v/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管800v对不同浓度的呕吐毒素（don）标准溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集0.5v的ecl信号强度，通过ecl信号强度与呕吐毒素（don）标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（3）待测样品溶液代替呕吐毒素（don）标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。

本发明的显著优点为：

(1)双抗夹心法，一种常用的分析方法，由于反应系统中固相抗体和标记抗体的量相对于待检抗原是过量的，因此复合物的形成量与待检抗原的含量成正比，已经逐步被应用在荧光、电化学发光、光电和电化学等领域。相比其他分析技术，电化学发光具有灵敏度高、简单、快速反应等优点，其与夹心型分析技术的结合为生物传感器的发展提供了更广阔的应用前景。

（2）具有大比表面积及较高孔隙率的tio2-b纳米材料作为生物传感器探针平台可以承载大量的增敏剂和发光试剂，成功制备了一个高效的整合型电致化学发光探针，极大地提高了电化学发光效率。

（3）透明质酸（ha）具有大量的亲水性基团，一方面提高了生物传感器的稳定性，另一方面又可以通过共价作用结合呕吐毒素抗体(ab1)，另外，电聚合形成的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)（pedot）具有良好的导电性，进一步增加电化学发光信号。

（4）本发明结合整合型探针与传感基底的优点，在无过氧化氢溶液的条件下，实现了对目标物高灵敏检测，避免了使用过氧化氢可能会对操作者身体造成的危害和由过氧化氢引起的抗原、抗体及目标物等的变性。

附图说明

图1为介孔纳米二氧化锰的5种比较视图，图1中的a为介孔纳米二氧化锰（mpmno2）的透射电镜图(tem)，图1中的b为介孔纳米二氧化锰（mpmno2）高倍扫面电镜图(hrrem)，图1中的c、d、e分别为tio2-b的透射电镜图(tem)、选区电子衍射图（saed）、x射线衍射（xrd）图。

图2为免疫传感电极的电致化学发光响应信号与呕吐毒素（don）标准溶液浓度的线性关系图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

一种针对呕吐毒素的tio2-b整合型免过氧化氢电致化学发光传感器的构建过程：

（1）玻碳电极（gce）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；

（2）取1ml3mg/ml的介孔纳米二氧化锰（mpmno2）与1ml5mg/ml的透明质酸（ha）在超声作用下混合均匀，将得到的均质溶液在室温下机械振荡4h，经离心、洗涤，再分散制得ha@mpmno2复合物溶液；滴加5μl浓度为3mg/mlha@mpmno2复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得ha@mpmno2修饰玻碳电极；

（3）以0.1mol/l的高氯酸锂（liclo4）为溶剂，在乙腈（acetonitrile）溶液中溶解0.01mol/l3,4-乙撑二氧噻吩(edot)单体，在-0.5至1.0v的电位窗口下，用循环伏安法在步骤（2）制备的电极上连续扫描6次，最终的到pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极；

（4）取5μl浓度比为2:1的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（edc）及n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）混合液滴加到步骤（3）制得的修饰的电极上并在室温下反应40min，红外灯下烘干，冷却至室温，再滴加5μl浓度为50ug/ml呕吐毒素抗体（ab1）溶液在室温下孵育50min，随后用去离子水洗去物理吸附的ab1，制得ab1@pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极；

（5）取体积比为2:1的5mg/mltio2-b溶液与1.0wt.%bsa在室温下混合震荡5h，洗涤、离心、再分散得到tio2-b@bsa复合物溶液；然后向上述混合溶液中加入100μl1.0×10^-6mol/l氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）并在室温下温和摇晃1h,经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs复合物溶液；再依次向上述溶液中加入100μl1.0×10^-2mol/l鲁米诺，50μl5wt.%戊二醛溶液，室温下混合震荡4h，经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol复合物溶液,最后再加入100μl50ug/ml呕吐毒素igg抗体（ab2）溶液在室温下震荡50min，经离心、洗涤、再分散制得整合型电致化学发光探针（tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2）复合物溶液，储存在4°c冰箱中备用；

（6）将步骤（4）获得的修饰电极浸入不同浓度的呕吐毒素（don）标准溶液中并室温下孵育40mim，用去离子水冲洗电极表面，制得don/ab1@pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极，然后取5μl步骤（5）制备的整合型电致化学发光探针（tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2）复合物溶液滴加到don/ab1@pedot@ha@mpmno2修饰的玻碳电极上，在室温下孵育50min，用去离子水冲洗电极表面，制得tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2/don/ab1@pedot@ha@mpmno2修饰玻碳电极。

实施例2

上述实施例1所用的介孔纳米二氧化锰（mpmno2）的制备：以阳离子表面活性剂软模板法为基础，将2g1-十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于200ml无水乙醇中，然后在强搅拌条件下依次向上述混合溶液中滴加kmno4和乙酸锰mn(ch3coo)2并在该搅拌条件下保持数小时，随后得到的深棕色沉淀经离心、洗涤数次，最后在80℃下干燥8h，得到介孔纳米二氧化锰（mpmno2），见图1中的a为介孔纳米二氧化锰（mpmno2）的透射电镜图(tem)，b为介孔纳米二氧化锰（mpmno2）高倍扫面电镜图(hrrem)，c、d、e分别为tio2-b的透射电镜图(tem)、选区电子衍射图（saed）、x射线衍射（xrd）图。

实施例3

上述实施例1所用tio2-b纳米材料的制备：4g锐钛矿型tio2均匀分散在60m的koh水溶液中并在室温下搅拌10min，然后将得到的悬浮液移到100ml四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在170℃下保持72min，待冷却至室温后，用稀释的hac溶液洗涤所得到的沉淀直至ph值达到7.0，离心，在60°c下干燥12h，得到最终的产物；然后将600mg前驱体钛酸盐纳米线分散到100ml16mhac溶液中，再将该混合液转移到200ml四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在180℃下加热24h，经离心，分别用蒸馏水和乙醇彻底洗涤后，再在60℃下干燥一夜，得到最终的目标产物tio2–b。

实施例4

上述实施例1所用的整合型电致化学发光探针（tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2）复合物的制备：1）体积比为2:1的5mg/mltio2-b溶液与1.0wt.%bsa在室温下混合震荡5h，洗涤、离心、再分散得到tio2-b@bsa复合物溶液；2)向上述混合溶液中加入100μl1.0×10^-6mol/l氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）并在室温下温和摇晃1h,经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs复合物溶液；3）依次向上述复合物溶液中加入100μl1.0×10^-2mol/l鲁米诺，50μl5wt.%戊二醛溶液，室温下混合震荡4h，经离心、洗涤、再分散得到tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol复合物溶液,最后再加入100μl50ug/ml呕吐毒素igg抗体（ab2）溶液在室温下震荡50min，经离心、洗涤、重新分散于去离子水中制得tio2-b@bsa@f-cousipcs@luminol@ab2复合物溶液，储存在4°c冰箱中备用。

实施例5

本发明所述的呕吐毒素抗体（ab1）和呕吐毒素igg抗体（ab2）购买自中国江苏的无锡生物传感技术公司，而作为实施例1所用的增敏剂的氟代香豆素硅酞菁（f-cousipcs）则是经过以下步骤合成的：首先，将8g的1，4-二羟基苯分散在28ml浓硫酸中，在0℃下连续搅拌30min，然后依次向上述混合液中加入20g三氟乙酸乙酯和40ml浓硫酸，在室温下搅拌12h，为了沉淀出更多的产物，将粗品转移到冰水中，用超纯水多次过滤和洗涤，经60℃真空干燥后，得到淡黄色晶体6-羟基-4-三氟甲基-1，2-苯并吡喃(氟-香豆素)。接着，向200ml圆形底烧瓶中分别加入0.46g上述制备的氟-香豆素、0.42g二氯化硅、100ml甲苯和3.0ml吡啶，然后将混合物回流并在110℃磁搅拌下保持48h，冷却至室温后，再用硅胶色谱进一步纯化，得到粗产物。最后，经旋转蒸发器下干燥后，成功地制备出暗蓝产品f-cousipc。

实施例6

呕吐毒素（don）的检测步骤：

（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的夹心型免疫传感器为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1mol/mlph8.0的pbs缓冲溶液中进行测试；

（2）采用电位范围-0.5-1v，扫描速率0.05v/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管800v对不同浓度的呕吐毒素（don）标准溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集0.5v的ecl信号强度，通过ecl信号强度与呕吐毒素（don）标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线见图2；

（3）待测样品溶液代替呕吐毒素（don）标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。