专利名称：：用于治疗烈性肠道传染病的含霍乱毒素疫苗的制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药制剂领域，特别涉及用于肠道感染性疾病的疫苗，如霍乱、痢疾、幽门螺杆菌等疫苗的口服制剂，制备方法及其应用。
背景技术：
：霍乱是一种威胁人类生存的烈性肠道传染病，是我国甲类传染病之一。自有历史记载以来，全球共有七次霍乱大流行，每次大流行都导致数十万乃至上百万人感染，成千上万人死亡。时至今日，霍乱仍在全球多个国家肆虐。霍乱是由霍乱弧菌所致的烈性肠道传染病，临床上以剧烈无痛性泻吐、米泔水样大便、严重脱水、肌肉痛性痉挛及周围循环衰竭等为特征。20世纪60年代，国际上曾研制出多种肠道外霍乱疫苗，但由于不良反应重，保护力仅在50%以内，保护期短，WHO生物标准化专家委员会决定于1999年起停止使用。口服疫苗能诱导肠道产生抗体，而肠道又是抗击霍乱的前线。不仅如此，口服疫苗还能降低医疗成本，避免不必要的医疗伤害，因此，近年来口服霍乱疫苗取得了较大发展。目前可获得的口服霍乱疫苗主要有灭活全菌体霍乱疫苗(WC疫苗)、灭活全菌体加B亚单位霍乱疫苗(WC/rBs疫苗)和减毒霍乱活菌苗(CVD103-HgR减毒活疫苗)。灭活全细胞菌苗(WC)最初是针对Ol群霍乱的，在越南的现场试验中取得了不错的保护效果(TrachDD，ClemensJD，KeNT，etal.Fieldtialofalocallyproduced,killed,oralcholeravaccineinVietNam.Lancet,1997，349(9047):231—235.)，各年龄组8个月后的有效率为66%，但只在越南和印度尼西亚等少数国家生产。随后，根据WH0腹泻病疫苗筹划指导委员会的建议，研制成第2代灭活的全细胞二价菌苗，这种菌苗由01群和0139霍乱弧菌全细胞构成，其中包含了5X1010cfu福尔马林灭活的0139。在Hanoi的研究是口服2剂，每齐U1.5ml，间隔2周，但是免疫效果不理想(TrinkaSCoster，KevinPKillen，MatthewKWaldor，etal.Safety,immunogenicity，andefficacyofliveattenuatedvibriocholerae0139vaccineprototype丄ancet，1995，345(8955):949-952)。霍乱毒素B亚单位-灭活霍乱弧菌全菌体疫苗(BS-WC)在WC疫苗基础上增加了霍乱毒素B亚单位(BS)。BS是优于霍乱类毒素但稍次于霍乱毒素的良好免疫原。用BS和灭活霍乱弧菌全菌体疫苗(WC)构成的组合疫苗(BS-WC)于19851989年在孟加拉霍乱流行区进行了现场试验。63498人接种疫苗后最初6个月的免疫保护率为85%，3年后降至51%，证明BS-WC疫苗对霍乱有良好的保护作用。在预防01群霍乱方面，这种由重组的霍乱毒素B亚单位和灭活的01群霍乱全细胞组成的口服疫苗，已经取得了不错的效果，因此，世界卫生组织对这种疫苗给予推荐(WklyEpidemRec2001;76(16):117-124)。在上世纪90年代，该疫苗已在瑞典批准注册生产。但这种疫苗需要在口服时使用抗酸剂以中和胃酸，因此不良反应比较大。而且在霍乱爆发地，本身就缺乏干净的水源，还需要大量的水溶解抗酸剂，无形中提高了用药的成本。在BS-WC疫苗进入人体试验证明其具有良好的安全性、免疫原性和较高保护率的基础上，口服霍乱疫苗的研制工作又向更深层次推进一步，即采用重组BS(rBS)代替天然霍乱BS，构建了rBS-WC霍乱口服菌苗(陈清，俞守义，王雅贤，等.冻干口服霍乱rBS-WC菌苗安全性及免疫原性的人群试验.中华预防医学杂志，1996，30(6):330-333.)。中国军事医学科学院生物工程研究所马清钧等研究员，研制出了国家一类新药rBS-WC口服霍乱疫苗。这是我国科学家自主研制的口服霍乱疫苗，成为世界卫生组织正式推荐的口服霍乱疫苗之一。以上霍乱口服疫苗中，rBS-WC有信服的保护作用，然而它需要间隔1周接种2齐U，第2剂接种后1周才能产生效果。口服减毒霍乱活菌苗(CVD103-HgR减毒活菌苗)，即由活的基因修饰的01群霍乱弧菌减毒株(CVD103-HgR)组成。CVD103-HgR减毒口服活菌苗则在接种1剂后7天就可产生保护作用，适合急需迅速获得保护者，但由于活的霍乱疫苗涉及可能发生毒性基因水平的基因转移，具有较高的潜在毒副作用发生率，未得到世界卫生组织的推荐。
发明内容本发明所要解决的技术难题在于提供一种用于治疗烈性肠道传染病的含霍乱毒素疫苗的制剂。本发明的含霍乱毒素疫苗的制剂是种新的配方制剂，具有良好的生物活性和临床效果，减少了不良反应，更易携带和保存。本发明所要解决的又一技术难题在于提供所述的含霍乱毒素疫苗制剂的制备方法。本发明所要解决的技术难题可以通过以下方案来实现用于治疗烈性肠道传染病的含霍乱毒素疫苗的制剂，该制剂由灭活的霍乱弧菌全菌体、重组B亚单位CTB和药用辅料组成，其特征在于，所述的制剂为胶囊剂或片剂，优选为胶囊剂。所述的灭活霍乱弧菌全菌体和/或重组B亚单位CTB为冻干粉。本发明的含霍乱毒素疫苗的制剂由于采用了胶囊剂或片剂，大大减少了胃肠道的不良反应，降低了副作用。同时由于采用了固体的胶囊剂、片剂，延长了疫苗的保质期，而且便于运输、储存和使用。所述的灭活霍乱弧菌全菌体冻干粉中至少含有冻干保护剂和保持该灭活霍乱弧菌全菌体冻干粉pH值为6.09.0，优选为7.07.5的缓冲溶液。采用了上述技术方案的疫苗在使用时，无需服用抗酸剂，减少了不良反应，更易携带和保存。本发明的疫苗制剂在制备霍乱毒素抗原冻干粉工艺中使用了保护剂，没有影响活性物质的免疫特性，同时大大加强了制剂的稳定性，本发明的胶囊剂在储存30个月后，免疫活性仍达60%，片剂在储存30个月后，免疫活性仍达70%;远高于现有的水剂的霍乱毒素疫苗的储存的免疫活性。冻干保护剂为糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂以及白蛋白的一种或两种以上的组合，优选为糖、氨基酸。缓冲溶液为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、酒石酸盐缓冲体系，优选为磷酸盐缓冲体系。含霍乱毒素疫苗的制剂，包括灭活的霍乱弧菌全菌体5X1091011个，重组霍乱5毒素B亚单位CTB15mg。如上所述的含霍乱毒素疫苗的制剂中，灭活的霍乱弧菌全菌体为血清型0139及/或血清型01，灭活方式为甲醛灭活及/或加热灭活。含霍乱毒素疫苗制剂疫苗的药用辅料主要为润滑剂和填充剂，且所述润滑剂为总重量的0.5%1.5wt^，填充剂为总重量的80%96wt%。填充剂可选用乳糖、玉米淀粉之一或两种以上的组合。玉米淀粉可用作崩解剂，通过对其部分预胶化，可以大大改善流动性和润滑性，而仍保持其崩解性能和防潮性能，如Colorcon公司的Starch1500TM。尽管交联羟甲基纤维素钠或淀粉羟乙酸钠等超崩解剂在改善崩解和溶出性能方面比传统淀粉好，但其吸湿性仍是一个大问题。而部分预胶化淀粉则吸湿性小，能提高对潮湿敏感的药物的稳定性。润滑剂可选用羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、胶体二氧化硅和滑石。本发明的含霍乱毒素疫苗制剂选用的辅料，满足制剂成型、有效、稳定、方便要求的最低用量原则，即用量恰好。在满足上述要求的前提下，辅料用量最少不仅节约原料、降低成本，更主要的是可减少剂量，使应用方便。其次，本发明选择的辅料及用量，对本发明的疫苗制剂无不良影响，不降低药品疗效，不产生毒副作用，不干扰质量监控，同时加强了制剂的稳定性。所述的剂型为胶囊剂、片剂、和羟丙甲纤维素K4M组配的缓释片剂或胶囊剂；优选为胶囊剂。所述的羟丙甲纤维素K4M为常规用量。上述的肠溶胶囊剂、片剂、微胶囊型都是口服霍乱疫苗，具有局部免疫的优势，能诱导肠道产生抗体。微胶囊剂型制剂是一种缓释胶囊/控释胶囊，其缓释效果好，药物易被机体吸收，并可减少对胃肠粘膜的剌激和损伤，但生产成本大，工艺复杂。霍乱毒素(CT)由1个A亚单位和5个B亚单位组成，由ctxAB操纵子编码，与TCP和ACF等一些因子通过ToxR调节子共调节。A亚单位是毒力活性部分，具有ADP-核糖基化活性；B亚单位无毒性作用，但能识别所结合细胞表面的受体神经节苷脂GM，由此输送A亚单位至细胞内，导致水及电解质分泌入肠腔，产生水样腹泻。B亚单位具有良好的免疫原性，能产生重要的抗毒免疫力，经人体场地试验证明是疫苗的有效成分。将CT的B亚单位加到口服疫苗中，可剌激肠道粘膜IgA抗毒素形成，并提供保护长达疫苗接种后9个月之久。此外，B亚单位的加入，可对产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的腹泻产生短期(3个月)的交叉防御作用，ETEC可产生抗原性和药理性与CT类似的不耐热肠毒素。本发明的含霍乱毒素疫苗制剂安全有效，毒副作用小，可产生抗霍乱菌和抗毒的协同免疫作用，口服后可以产生肠道局部与全身的免疫作用。—种制备在治疗烈性肠道传染病的应用的含霍乱毒素疫苗制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)分别制备冻干的灭活的霍乱弧菌全菌体和冻干的重组B亚单位，(2)在混合间，分别将上述的冻干的灭活的霍乱弧菌全菌体，冻干的重组B亚单位、润滑剂和填充剂组分按照一定比例进行混合，(3)将充分混合的上述组分进行胶囊填充，(4)将填充好的胶囊铝铝包装，冷藏保存。在上述的步骤(1)中，用冻干保护剂制备，浓度在425mg/ml，最佳816mg/ml冻干的灭活的霍乱弧菌全菌体，并用缓冲溶液保持pH是7.07.5。在上述的步骤(1)中，其中，缓冲溶液包括磷酸盐、拧檬酸盐、乙酸盐、酒石酸盐等缓冲体系，优选为磷酸盐缓冲体系。在上述的步骤(1)中，其中，保护剂包括糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂以及白蛋白的一种或两种以上的组合，优选为糖、氨基酸。上述的步骤(2)中，将称好的组分采用等量混合的方式进行混合，首先将WC01和/或0139冻干粉、润滑剂和与两者等量的填充剂混合510分钟；然后将CTB冻干粉倒入，再倒入与桶内粉剂等量的填充剂混合510分钟，最后将剩下的填充剂倒入混合1530分钟。上述的步骤(2)中，各组分的投料比例是每粒胶囊①重组B亚单位量1.5X(1±10%)mg，②霍乱弧菌量505000亿菌，③润滑剂量为总重量的0.5%1.5wt^，④余量为填充剂。上述的制备过程中都是在室温或4t:进行。本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂在制备治疗和预防烈性肠道传染病的药物中的应用。本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂在制备治疗霍乱疾病的药物中的应用；特别是在制备治疗霍乱疾病的药物和抗病毒药物的中联合用药的应用。图1为本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂的制备方法的工艺流程图。具体实施例方式下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。实施例1本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂(胶囊剂配方)成分剂量(万粒量)活性成分CTB冻干粉50gWC冻干粉134g药用辅料乳糖2，192g硬脂酸镁24g将上述成分混合后装入肠溶胶囊，即得。实施例2本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂(片剂配方)成分剂量(万粒量)活性成分CTB冻干粉50gWC冻干粉134g药用辅料乳糖2，100g硬脂酸镁40g羟丙甲基纤维素80g按片剂标准制备工艺操作即得。实施例3本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂的(冻干工艺中保护剂配方)成分剂量(万支)活性成分重组B亚单位(CTB)10g药用辅料酸水解酪蛋白80g磷酸盐13g按普通冻干工艺干燥实施例4本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂(冻干工艺中保护剂配方)成分剂量(万支)活性成分霍乱灭活全菌体(WC)83g药用辅料酸水解酪蛋白16gNaCl25g按普通冻干工艺干燥实施例5将实施例1和实施例2中的制剂在28t:放置2年半，每隔半年进行一次检测，考察活性成分的含量5.1.重组霍乱毒素B亚单位(CTB)含量测定方法用单向免疫扩散法。将霍乱毒素B亚单位对照品系列稀释溶液与用生理氯化钠溶液稀释至1040g/ml的供试品溶液各101分别加入含有0.05%兔抗CTB血清的0.9%琼脂糖凝胶板中，然后置水平湿盒中，371:扩散过夜。用压胶溶胀的方法除去凝胶中未结合的蛋白质，再用考马斯亮蓝R-250染色，脱色后拍照，以对照品浓度的对数对沉淀圈直径做直线回归，将供试品沉淀圈的直径带入回归方程中计算供试品中CTB的含量。5.2.灭活霍乱弧菌全菌体采用免疫力试验将胶囊内容物或片剂稀释成每1ml含菌1.0X109个，免疫体重1012g小鼠至少10只，每只腹腔注射2次，每次0.5ml，间隔7天(免疫剂量为5.OX108个菌)。对照组注射稀释液。末次免疫后37天眼窝取血，用间接酶标法检测两组小鼠混合血清效价。胶囊剂结果见表18<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>%现有的水剂的霍乱毒素疫苗只能保存2年，免疫活性未知。实施例6图1为本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂的制备方法的成品生产工艺流程图。实施例7选择霍乱历史高发疫区浙江省上虞市进行随机、双盲、对照试验，参加试验人数3041人，其中服疫苗2027人，对照组1014人(只服用药用辅料安慰剂)。试验组每次服苗后三天内不良反应发生21人，总反应率1.16%，远低于现有霍乱疫苗的不良反应率。美国Dukoral公司的水剂的霍乱毒素疫苗的不良反应发生率为腹泻12%，发烧45，纳差4%，腹痛16%。对照组不良反应发生16人，总反应率1.76%，两组无差异(X2=1.584，P=0.208)。试验组和对照组的主要不良反应主要为腹痛、腹泻，也出现部分过敏反应，无须治疗，全部自愈。其他反应主要是头晕、疲劳、乏力等主观不适，各类不良反应实验组和对照组均无统计学差异。服苗前试验组和对照组抗体阳性率无差异，服苗后1月，试验组明显高于对照组。表5抗CT抗体阳性率(％)比较月份试验组对照组015.45%14.04%183.64%21.05%9抗-Vab抗体在服苗后1个月上升，明显高于对照组，有统计学差异。表6抗-Vab抗体变化情况<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例8本发明的一种含霍乱毒素疫苗的制剂在临床上的使用。本发明的疫苗的接种对象为2岁或2岁以上的儿童，青少年和有接触或传播危险的成人。接种后可预防霍乱和产毒性大肠杆菌旅行者腹泻。参考使用方法a.口服；b.初次免疫者可服本制剂三次，分别于0、7、28天口服，每次一粒；c.接受过本品免疫的人员，可视疫情于流行季节前加强一次，方法、剂量同上。口服本发明的疫苗后一般无反应，偶有轻度腹痛、荨麻疹、恶心、腹泻等，一般不需处理，可自愈。以上内容显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。权利要求用于治疗烈性肠道传染病的含霍乱毒素疫苗的制剂，该制剂由灭活的霍乱弧菌全菌体、重组B亚单位CTB和药用辅料组成，其特征在于，所述的剂型为胶囊剂或片剂。2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的灭活霍乱弧菌全菌体和/或重组B亚单位CTB为冻干粉。3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述的灭活霍乱弧菌全菌体采用冻干保护剂处理，并用缓冲溶液保持P朋.09.0。4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述的冻干保护剂为糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂以及白蛋白的一种或两种以上的组合；所述的缓冲溶液为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、酒石酸盐缓冲体系。5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述的缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲体系；所述的冻干保护剂优选为糖、氨基酸。6.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的灭活的霍乱弧菌全菌体包括血清型0139及/或血清型Ol，灭活方式包括甲醛灭活及/或加热灭活。7.根据权利要求l-6任一项所述的制剂，其特征在于，含霍乱毒素疫苗制剂疫苗的药用辅料主要为润滑剂和填充剂，且所述润滑剂为总重量的0.5%1.5wt^，填充剂为总重量的80X96wtX;所述的润滑剂为羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、胶体二氧化硅和滑石一种或两种以上的组合；所述的填充剂包括但不限于乳糖、玉米淀粉之一或两种以上的组合。8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述的含霍乱毒素疫苗制剂每剂疫苗为灭活的霍乱弧菌全菌体5X1091011个，重组霍乱毒素B亚单位CTB为15mg。9.制备根据权利要求1所述的含霍乱毒素疫苗制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)分别制备冻干的灭活的霍乱弧菌全菌体和冻干的重组B亚单位CTB，用冻干保护剂制备冻干的灭活的霍乱弧菌全菌体，并用缓冲溶液保持PH;(2)在混合间，分别将上述的冻干的灭活的霍乱弧菌全菌体，冻干的重组B亚单位CTB、润滑剂和填充剂组分按照一定比例进行混合，(3)将充分混合的上述组分进行胶囊填充，(4)将填充好的胶囊铝铝包装，冷藏保存。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)的缓冲溶液为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、酒石酸盐缓冲体系；保护剂为糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂以及白蛋白的一种或两种以上的组合。11.根据权利要求9述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)的缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲体系；保护剂优选为糖、氨基酸。12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，上述的步骤(2)中，称好的组分采用等量混合的方式进行混合，首先将灭活的霍乱弧菌全菌体冻干粉、润滑剂和与两者等量的填充剂混合510分钟；然后将CTB冻干粉倒入，再倒入与桶内粉剂等量的填充剂混合510分钟，最后将剩下的填充剂倒入混合1530分钟。13.根据权利要求9或12所述的制备方法，其特征在于，上述的步骤(2)中，各组分的投料比例是每粒胶囊①重组B亚单位量CTB为1.5X(1±10%)mg，②霍乱弧菌量505000亿菌，③润滑剂量0.5%1.5wt^，④余量为填充剂。14.含霍乱毒素疫苗的制剂在制备治疗和预防烈性肠道传染病的药物中的应用。15.含霍乱毒素疫苗的制剂在制备治疗霍乱疾病的药物中的应用。16.含霍乱毒素疫苗的制剂在制备治疗霍乱疾病的药物中的和抗病毒药物的联合用药的应用。全文摘要本发明公开了用于治疗烈性肠道传染病的含霍乱毒素疫苗的制剂，该制剂由灭活的霍乱弧菌全菌体、重组B亚单位CTB和药用辅料组成，所述的剂型为胶囊剂或片剂，灭活霍乱弧菌全菌体和/或重组B亚单位CTB为冻干粉；且重组B亚单位CTB采用冻干保护剂处理，并用缓冲溶液保持pH。本发明的含霍乱毒素疫苗的制剂具有良好的生物活性和临床效果，减少了不良反应，更易携带和保存。文档编号A61K39/106GK101732705SQ20091024759公开日2010年6月16日申请日期2009年12月30日优先权日2009年12月30日发明者孙航,林海,郭鸿,马清钧申请人:上海联合赛尔生物工程有限公司