专利名称：用于治疗和预防阿尔茨海默病的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的治疗和预防的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途。更具体地，本发明的重组腺相关病毒基因疫苗包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子含有编码一种霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白的核酸序列。本发明还涉及包含所述重组DNA分子或融合蛋白的药物组合物。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称早老性痴呆(Presenile dementia)，是一种常见的中枢神经系统进行性变性疾病，其主要临床表现为进行性记忆减退和认知障碍。AD的神经病理学特征为过度的细胞外β淀粉样蛋白沉淀、神经纤维缠结增多、突触密度减少、神经元细胞减少等。其中细胞外β淀粉样蛋白的沉积，形成分散的老年斑和淀粉样血管病，被认为是该病发病机制中的关键环节。β淀粉样蛋白(amyloidβ protein)是由β淀粉样前体蛋白(βamyloid precursor protein，APP)经过β-分泌酶(BACE)和γ-分泌酶裂解后产生的含39～43个氨基酸残基的酶解片段。正常情况下，APP大部分经过α-分泌酶和γ-分泌酶裂解，不形成Aβ肽，不能形成细胞外β淀粉样蛋白沉淀。AD的发生与APP蛋白的几种突变体有关。如APPV717I(Goate et al，Nature 349；704)、APPV717G(Harlan et al，Nature353；844)、APPV717F(Murrell，Science 254；97)、APP的赖氨酸595-甲硫氨酸596变为天冬氨酸595-亮氨酸596的双突变(Mullan et al，NatureGenet.，1；345)。这些突变改变了APP的酶切位点，使大部分APP经过β-分泌酶和γ-分泌酶裂解，产生39～43个氨基酸残基的Aβ肽，形成细胞外β淀粉样蛋白聚集沉淀。特别是这些突变增加了Aβ42肽和Aβ43肽的产生量，由于Aβ42肽和Aβ43肽羧基末端延伸部位的构象更难溶于水，易于聚集形成反向平行的β折叠片层优先沉淀(Joachim et al，Nature 325；733、Halverson et al，Biochemistry 29；2639、Barrow et al，J.Mol.Bio.225；1075)。然而，Aβ42肽的聚集可以促进Aβ40肽聚集，从而形成老年斑。
APP基因已被测序，并定位于第21号染色体上(Kang et al，Nature325；733)。APP基因的表达产生几种695，751和770个氨基酸的含有Aβ的异构体。(Kang et al，Nature 325；733、Kitaguchi et al，Nature331；530)。虽然有证据表明APP具有介导神经元的粘连与生长的作用(Schubert et al，Neuron 3；689)以及在G蛋白质连接的信号传导途径中起作用(Nishimoto et al，Nature 362；75)，但是APP在神经系统中的确切功能还尚不清楚。
目前普遍认为，β淀粉样蛋白的沉积在AD的发生发展过程中起关键性作用，所有与该疾病相关的因素要么促进β淀粉祥蛋白的沉积，要么强化由β淀粉样蛋白引发的病理变化。因此，目前研究人员开发用于治疗AD药物的主要靶位点是降低中枢神经系统(CNS)中β淀粉祥蛋白沉积的数量。此类研究主要分为两大领域，即降低β淀粉祥蛋白的产生和增加它的清除。
对于第一个领域，从药物学的角度来说，降低β淀粉祥蛋白的产生的最直接的方式是通过直接抑制β或γ分泌酶。但是，目前对β-分泌酶(BACE)和γ-分泌酶在人体内的其它功能尚未研究清楚，而且它们存在于细胞的内质网或内体系统的内膜上，现在还难以找到既能通过血脑屏障，又能通过细胞膜和内质网膜的药物来抑制它们的酶活性的特异性抑制物。
对于第二个领域，尤其对于已发展成为AD的病人来说，清除脑组织内β淀粉样蛋白的沉积更为重要。目前这一领域的研究比较热。其中，专利申请WO 98/44955公开了使用特异于β-淀粉样蛋白末端的重组抗体防止或预防阿尔茨海默病的方法，该专利申请保护的是特异于β-淀粉样蛋白末端的重组抗体和编码它们的DNA及其使用方法。WO 99/27944公开了使用Aβ42肽产生抗β淀粉样蛋白的抗体，该抗体能够通过血脑屏障进入脑组织与β淀粉样蛋白结合，并通过小神经胶质细胞的吞噬作用清除β淀粉样蛋白的沉积。该专利申请保护的是Aβ42肽疫苗的制备及其使用方法。虽然该专利申请中提及到有关Aβ42DNA片段作为基因疫苗的潜在的可能性，但没有公开基因疫苗是如何在治疗中使用的具体内容。
虽然上述肽疫苗或抗体被动免疫较以往AD的治疗方法有了较大的突破，但是仍不够完善。首先，Aβ42肽分子较小，免疫原性低，为得到能清除老年斑的抗β淀粉样蛋白抗体，需要反复注射Aβ42肽。采用长期的皮下免疫，操作繁琐，同时也给AD病人带来较大的痛苦。其次，采用被动免疫治疗方法给AD病人直接注射抗β淀粉样蛋白抗体，也存在着明显的缺点，即抗体在体内的半衰期非常短。不适用于象AD这类慢性疾病的治疗。再次，从目前所取得的实验结果来看，虽然疗效显著，但仍未达到最理想的程度，如特异性抗体的滴度仍不是很高，仍有部分老年斑形成等。因此，AD的免疫治疗需要进一步改进。目前国际上AD免疫治疗的发展趋势是(1)增强Aβ42肽疫苗的免疫原性，进一步提高特异性抗体的滴度；(2)改进免疫途径和方法；(3)减少操作的复杂性和成本，便于大量制备，广泛使用。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种新的基因重组疫苗，该疫苗含有编码霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的重组DNA序列或其衍生物，也含有与该重组DNA分子有效连接的并能够在真核细胞中表达融合蛋白(霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段)的启动子。同时，为了能够使融合蛋白顺利地从表达细胞中分泌出来，在重组DNA分子的5’端也提供了一个前导序列，编码N-末端信号肽。编码霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白核苷酸序列如图4所示。
本发明的另一个方面是提供一种重组DNA分子，它含有编码一种霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白的基因，该融合蛋白能够诱发机体产生抗β淀粉样蛋白抗体。
本发明的又一个方面是提供一种包含本发明的重组DNA分子的重组病毒载体，该重组病毒载体编码能够有效诱导对β淀粉样蛋白产生免疫应答的霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白，用于将所述重组DNA分子导入机体细胞。适合的病毒载体包括腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、新培斯病毒或鸡痘病毒。
本发明的另一方面是提供一种用于防止或抑制阿尔茨海默病的进一步发展的新的药物组合物。该药物组合物包含一种融合蛋白质，称为CB-Aβ。该蛋白质CB-Aβ由霍乱毒素B亚单位-接头-Aβ肽片段组成。在一些药物组合物中该蛋白质CB-Aβ可以是重组DNA分子在原核细胞中表达产物，也可以是真核细胞如酵母的表达产物。
应理解的是，本发明的融合蛋白不仅限于由霍乱毒素B亚单位与Aβ肽形成。在一些药物组合物中，融合蛋白也可以是免疫球蛋白-接头-Aβ肽；在一些药物组合物中，融合蛋白也可以是改造的细菌毒素-接头-Aβ肽；在一些药物组合物中，融合蛋白也可以是HBV的HBsAg-接头-Aβ肽；在一些药物组合物中，融合蛋白也可以是脂类或脂质体-Aβ肽。
本发明还提供了含编码融合蛋白(霍乱毒素B亚单位-接头-Aβ肽)的本发明的重组DNA分子及合适的基因转运载体的药物组合物。所述组合物适用于多种给药途径的，用于防止或抑制阿尔茨海默病的进一步发展。该药物组合物的给药途径包括口服、鼻饲、皮内、皮下、肌内、局部或静脉内给药。
附图简要说明
图1表示β淀粉样蛋白产生的机制和β淀粉样前体蛋白(APP)酶解的途径。β淀粉样蛋白是由β淀粉样前体蛋白(APP)经过β-分泌酶(BACE)和γ-分泌酶裂解后产生的肽片段。同时，图1也显示了APP经α-分泌酶和γ-分泌酶裂解后降解的过程。
图2表示在APP产生β淀粉样蛋白区域的氨基酸序列。箭头表示α-、β-、或γ-分泌酶的切割位点。β淀粉样蛋白是含39～43个氨基酸残基的肽片段。
图3表示基因重组疫苗的构建技术路线，主要包括CB和Aβ42DNA的克隆、连接、测序、质粒载体的构建、病毒的包装与收获等过程。具体内容参照实施例1。
图4表示基因重组DNA分子中编码融合蛋白的DNA序列，共含有510个核苷酸组成。
图5表示基因重组DNA分子表达产物一融合蛋白的氨基酸序列，由170个氨基酸残基组成。
图6表示基因重组免疫疫苗免疫PDAPP转基因小鼠和非转基因小鼠后外周血抗β淀粉样蛋白抗体的效价。(A)治疗组PDAPP转基因小鼠；(B)预防组PDAPP转基因小鼠；(C)治疗组非转基因小鼠；(D)预防组非转基因小鼠。
图7表示血清抗AβIgG抗体的中和作用，在rAAV/CB-Aβ42免疫血清1∶10稀释度时，能够部分中和Aβ42的神经毒性作用。
图8表示治疗组PDAPP转基因小鼠在水迷宫实验中1～6天搜索隐蔽平台的平均潜伏期(Mean±SEM)。A.非处理组和AAV/GFP组。B.rAAV/Aβ42组。C.rAAV/CB-Aβ42组。其中im表示肌肉注射，in表示鼻饲，oral表示灌胃(以下各图相同)。
图9表示预防组PDAPP转基因小鼠在水迷宫实验中1～6天搜索隐蔽平台的平均潜伏期(Mean±-SEM)。A.非处理组和AAV-GFP组。B.AAV-CB-Aβ42三种免疫途径。
图10表示治疗组(A)和预防组(B)中各组PDAPP转基因小鼠在探索实验中在TQ象限中搜索时间的所占百分比。*P＜0.05，**P＜0.01，与非治疗组或AAV-GFP组相比较。
图11表示治疗组(A)和预防组(B)各组小鼠在探索实验中在30秒内经过平台位置的次数。
图12表示治疗组PDAPP转基因小鼠在可见平台水迷宫试验中的平均潜伏期(Mean±SEM)。A.非处理组和AAV/GFP组。B.rAAV/CB-Aβ42组。C.rAAV/Aβ42组。
图13表示预防组PDAPP转基因小鼠在可见平台水迷宫试验中的平均潜伏期(Mean±SEM)。A.非处理组和AAV/GFP组。B.rAAV/CB-Aβ42组。
图14.治疗组PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ淀粉样蛋白免疫组织化学检测(大脑皮层)。A.Control.B.rAAV/ Aβ42肌注组C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图15.治疗组PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ淀粉样蛋白免疫组织化学检测(海马区域)。A.Control.B.rAAV/Aβ42肌注组C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图16.预防组PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ淀粉样蛋白免疫组织化学检测(大脑皮层)。A.Control.B.rAAV/GFP肌注组C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图17.预防组PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ淀粉样蛋白免疫组织化学检测(海马区域)。A.Control.B.rAAV/GFP肌注组C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图18.治疗组PDAPP转基因小鼠脑组织刚果红组织化学检测(大脑皮层)。A.Control.B.rAAV/Aβ42肌注组C.rAAV/ CB-Aβ42肌注组。
图19.治疗组PDAPP转基因小鼠脑组织刚果红组织化学检测(海马区域)。A.Control.B.rAAV/Aβ42肌注组C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图20.预防组PDAPP转基因小鼠脑组织刚果红组织化学检测(大脑皮层)。A.Control.B.rAAV/Aβ42肌注组.C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图21.预防组PDAPP转基因小鼠脑组织刚果红组织化学检测(海马区域)。A.Control.B.rAAV/Aβ42肌注组.C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图22.治疗组PDAPP转基因小鼠脑组织GFAP(Glial fibrillaryacidic protein神经胶质元纤维酸性蛋白)免疫组织化学检测。A.Control.B.rAAV/Aβ42肌注组C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
图23.预防组PDAPP转基因小鼠脑组织GFAP免疫组织化学检测。A.Control.B.rAAV/Aβ42肌注组C.rAAV/CB-Aβ42肌注组。
具体实施方案本发明的基因重组疫苗可以用于预防和治疗阿尔茨海默病(有Aβ淀粉样蛋白沉积特征疾病)。本发明的重组DNA分子可以表达一种多肽如霍乱毒素B亚单位-接头-Aβ肽，是指它含有转录和翻译调节信息的核苷酸序列，并且这种序列是有效地与编码这种多肽的核苷酸序列连接的。有效连接是指这样一种连接，即调节DNA序列和表达基因DNA序列的连接方式可以引起基因的表达。总之，基因表达所需要的调节区域包括一种启动子区域和一种DNA序列，该序列当被转录成RNA时，将成为蛋白质合成的起始信号。这种区域将通常包括那些参与转录和翻译的5’-非编码序列。在本发明的一个实施方案中，所用启动子例如是CMV启动子，该启动子适用于多种细胞，可以在多种细胞内促使目的基因的表达。
为了能够将带有编码霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的本发明的重组DNA分子导入患者体内，需要不同的用于基因转运的载体，与该重组DNA分子组合使用。用于基因转运的载体包括病毒载体(如腺相关病毒载体)，脂类/脂质体，细胞表面受体的配体等。该重组DNA分子需要与基因转运载体组合在一起，例如一些病毒载体中的基因转运载体与编码融合蛋白的重组DNA分子被整合到病毒载体的DNA中或包装到病毒颗粒中；一些脂类或脂质体基因转运载体可以将重组DNA分子包裹在其中；一些细胞表面受体的配体作为基因转运载体与重组DNA分子以偶联或其它方式结合。因此，术语“组合”包括整合或包装、复合、偶联等方式。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)最初是在组织培养的污染物中分离出来的，后来发现在儿童感染腺病毒发作期分离到一种非致病性共感染因子(Blacklow et al，1986)，称其为腺相关病毒或腺病毒伴随病毒。AAV是一种细小病毒属的单链DNA病毒，具有4.7kb基因组。AAV是一种复制缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒或疱疹病毒)共感染才能进行有效的复制，完成其生命周期。在缺乏辅助病毒感染的情况下，AAV变成潜伏的形式，并以高频率进行稳定的整合，通常是在第19号染色体的特定位点(Kotinet al，1992)。AAV基因组已被测序，发现对于AAV整合所必须的、唯一的序列是145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。AAV的克隆容量大约为4.7Kb(Muzyczka，1992)。由于该病毒具有自身的优越特点(非致病性、广泛的宿主细胞、高效的整合能力、耐热、耐酸、可以长期高效表达)使其特别适合用作基因转运载体。
利用AAV包装的重组DNA分子，一旦转运到患者体内，AAV即可感染细胞并整合到细胞染色体上，表达融合蛋白(霍乱毒素B亚单位-接头-Aβ肽)，并分泌到细胞外，被抗原呈递细胞所识别、吞噬、处理和抗原呈递作用，将抗原呈递给T和B淋巴细胞，诱发机体免疫应答，产生抗β淀粉样蛋白抗体。该抗体能够进入脑组织内的神经元细胞外环境，与可溶性或聚集的β淀粉样蛋白结合，形成β淀粉样蛋白-抗体复合物。在脑组织内抗体通过小神经胶质细胞表面Fc受体的调理作用促进其吞噬β淀粉样蛋白-抗体复合物，以清除β淀粉样蛋白的沉积，或者β淀粉样蛋白-抗体复合物通过上矢状窦蛛网膜绒毛的排泄作用被清除出中枢神经系统，从而避免了β淀粉样蛋白在脑组织内的沉积和由它诱发的神经毒性作用。
本发明的基因重组疫苗和药物组合物不仅适用于已经明显发展成具有阿尔茨海默病病理特征的患者，而且适用于普通人群预防阿尔茨海默病的发生，使普通人群获得对这种流行性而具有破坏力的疾病免疫力，特别是患有唐氏综合征(Down′s syndrome)的患者或具有家族性阿尔茨海默病相关基因突变易于发展成阿尔茨海默病的人群。最佳施药途径是皮下、皮内、肌内、口服、鼻饲或静脉。
与基因转运载体组合在一起的含有融合蛋白基因的重组DNA分子可被用于生产或制备药物组合物，这种药物组合物包含所需要的有效量的重组DNA分子。例如，基因转运载体是AAV载体时，用于治疗或预防阿尔茨海默病的药物组合物中病毒颗粒的适当剂量大约为5×104至1×1012个病毒颗粒。当以一种细胞表面受体的配体作为基因转运载体时，所使用的配体结合的DNA分子的量大约为0.5～100μg。如果以脂类或脂质体作为基因转运载体时，所使用的DNA分子的量大约为1～500μg。
在本发明中，所使用的术语定义如下
术语“PDAPP转基因小鼠”是指转染了APPV717I基因突变体的C57小鼠，该小鼠在3～5个月时就开始有行为学改变，在11～13个月时脑组织内出现类似阿尔茨海默病病人的病理改变，有明显的淀粉样蛋白的沉积，老年斑的沉积。
术语“非转基因小鼠”是指未转染APPV717I基因突变体的C57正常小鼠。
术语“APPV717I、APPV717G和APPV717F”分别指由人APP基因编码的APP蛋白的717位点由原来的缬氨酸突变为异亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸。
术语“Aβ肽”是指含氨基酸残基1-39、1-40、1-41、1-42和1-43的Aβ肽片段，主要包括Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。“Aβ肽”也包括Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43的衍生物。Aβ41、Aβ40和Aβ39与Aβ42的不同之处在于，它们分别缺失C-末端的Ala、Ala-Ile和Ala-Ile-Val。Aβ43与Aβ42的不同之处是它在C-末端加了一个Thr。
术语“β淀粉样蛋白(amyloid β protein)”在意思上等同于术语“Aβ肽”，包括Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43肽。
术语“免疫应答”是指在接受治疗的患者体内产生对抗β淀粉样蛋白抗体和/或Aβ特异性T细胞或其分泌产物的应答。
术语“佐剂”指当与抗原结合使用时能够增强机体对抗原的免疫应答，但是当单独使用时不产生对抗原的免疫应答的物质。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，包括聚集淋巴细胞、激活B细胞和/或T细胞、激活巨噬细胞。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性处理的人和其他哺乳动物受试者。
术语“融合蛋白”在本文中是指含一种新的融合蛋白质，称为CB-Aβ。该新的蛋白质(CB-Aβ)由霍乱毒素B亚单位-接头-Aβ肽片段组成。在一个优选的实施方案中，所述接头氨基酸序列为甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸。
术语“重组DNA分子”是指含有编码霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的核苷酸序列及其衍生物。
术语“衍生物”是指含有编码基本上保持人β淀粉样蛋白生物学功能或活性多肽的核苷酸序列。或者是指基本上保持人β淀粉样蛋白生物学功能或活性的多肽。
术语“启动子序列”是指DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
术语“基因转运载体”是指任何一种适用于将DNA分子的导入体内的技术和/或物质。
本发明的AAV基因重组疫苗在给予患者后，其在患者体内异位表达一种融合蛋白分子，诱发机体产生抗β淀粉样蛋白的抗体，该抗体能够进入脑组织内的神经元细胞外环境，与可溶性或聚集的β淀粉样蛋白结合，形成β淀粉样蛋白-抗体复合物。在脑组织内抗体通过小神经胶质细胞表面Fc受体的调理作用促进其吞噬β淀粉样蛋白-抗体复合物，以清除β淀粉样蛋白的沉积，或者β淀粉样蛋白-抗体复合物通过上矢状窦蛛网膜绒毛的排泄作用被清除出中枢神经系统，从而避免了β淀粉样蛋白在脑组织内的沉积和由它诱发的神经毒性作用。与阿尔茨海默病的病理过程中有关的淀粉样蛋白，即Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43是主要清除目标。由此，本发明的基因重组疫苗可用于预防或治疗阿尔茨海默病，或者用于抑制阿尔茨海默病进一步发展。
利用本发明的基因重组疫苗或药物组合物，可以防止或清除β淀粉样蛋白在神经元细胞外环境中的沉积，从而防止神经元的损害与丢失，并以此作为预防或治疗阿尔茨海默病的关键点。本发明也避免了长期重复使用需要穿越血脑屏障的药物制剂所带来的问题。另外，实验表明，本发明的融合蛋白的结构的设计，和接头的选择使得由接头连接的两个多肽在体内保持各自的活性，从而为本发明基因重组疫苗及融合蛋白预付或治疗阿尔茨海默病提供了保证。
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明，并不意味着限定本发明的范围。
实施例1基因重组疫苗的构建基因重组疫苗的构建技术路线如图3所示。首先，通过聚合酶链反应(PCR)将Aβ42 DNA片段从人脑组织cDNA文库，中克隆出来，扩增引物为5’-GGTCCTGGTCCTGATGCAGAATTCCGACATG AC-3’和5’-GGAAGATCTTTACTACGCTATGACAACACCGCCC-3’。通过RT-PCR技术将霍乱毒素B亚单位(CB)的基因克隆出来，扩增引物为5’-CCGGGGTACCCCACCATGATTAAATTAAAATTTGGTG -3’和5’-CTGCATCAGGACCAGGACCATTTGCCATACTAATTGCG-3’。然后利用重叠PCR技术将CB与Aβ42DNA连接起来，中间加一段接头DNA(序列为GGTCCTGGTCCT)。该接头DNA编码一段柔性的氨基酸短链，使表达出来的霍乱毒素B亚单位(CB)和Aβ42肽片段可以维持各自的生物学活性。将CB-Aβ42基因片段装入pGEM-T Easy质粒后测序。测序结果如图4所示。将带有CB-Aβ42DNA片段的pGEM-TEasy质粒以Kpn I和Bgl II双酶切后，回收含CB-Aβ42DNA片段；同时，将通用型AAV质粒载体pSNAV(由本元正阳基因有限公司构建)，以Kpn I和Bgl II双酶切后，回收大片段，得到含有粘性末端的pSNAV载体片段。将酶切后的pSNAV载体片段与含CB-Aβ42DNA片段连接成pSNAV-CB-Aβ42质粒。然后，进行连接产物的转化、小量提取纯化质粒DNA。
同时构建了pSNAV-Aβ42质粒，并将pSNAV-Aβ42质粒和pSNAV-GFP质粒作为pSNAV-CB-Aβ42质粒的对照。pSNAV-GFP质粒为吴小兵等先前构建(中国专利申请号99119038.6，发明名称系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途)。pSNAV-Aβ42质粒中仅含有Aβ42DNA片段，并在其前面加了一个AAP的前导序列，但不含CB基因DNA片段。pSNAV-GFP质粒中插入了绿色荧光蛋白(GFP)基因。
实施例2rAAV/CB-Aβ42病毒的包装及其滴度的测定将上述实施例1获得的pSNAV-CB-Aβ42质粒包装成含有CB-Aβ42表达盒的重组AAV病毒(rAAV/CB-Aβ42病毒)，即本发明的基因重组疫苗，采用的是吴小兵等所申请的专利的方法(中国专利申请号98120033.8，发明名称用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的产生及其用途；中国专利申请号99119039.4，发明名称可用于大规模生产的重组腺病毒伴随病毒生产方法及用途；中国专利申请号99123723.4，发明名称一种快速高效分离和纯化重组腺病毒相关病毒的方法和用途)。具体步骤如下步骤1.rAAV/CB-Aβ42病毒载体细胞株的建立用pSNAV-CB-Aβ42质粒转染BHK细胞(由本元正阳基因有限公司提供)经选择培养得到rAAV/CB-Aβ42病毒载体细胞株BHK/pSNAV-CB-Aβ42。
BHK细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液37℃培养。将pSNAV-CB-Aβ42质粒用脂质体lipofectamine(GIBCO BRL)转染BHK细胞，24hr后消化，1∶2～5传代。加G418 800μg/ml选择培养。10天后可形成明显抗性细胞克隆。将细胞克隆挑出继续培养并进行冻存保种。用全功能辅助病毒HSV1-rc(由本元正阳基因有限公司提供)感染所获得的克隆化培养的病毒载体细胞，待细胞出毒后收获细胞及其培养液，SDS-PAGE电泳检测结果显示AAV病毒的三条特征性电泳带，Southern杂交结果显示该rAAV病毒包含有CB-A β42核酸序列，该rAAV病毒是rAAV/CB-Aβ42病毒。测定rAAV/CB-Aβ42病毒的滴度。挑选出rAAV病毒滴度高的细胞株作为AAV-GFP病毒载体细胞株。
步骤2.制备重组rAAV/CB-Aβ42病毒将上述获得的克隆化培养的病毒载体细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液继续于37℃培养至大量滚瓶培养规模，在细胞达到一定数量后，用全功能辅助病毒HSV1-rc感染扩大培养的细胞。待细胞出毒后收获细胞及其培养液，采用下述步骤进行重组rAAV/CB-Aβ42病毒的分离和纯化1)氯仿破碎细胞、灭活HSV辅助病毒及使大量细胞蛋白变性沉淀；2)用DNaseI和RNase处理细胞裂解液以降解核酸；3)加NaCl促使rAAV与细胞碎片分离，离心去除细胞碎片；4)用PEG/NaCl沉淀rAAV；5)用氯仿抽提去除杂蛋白和残余的PEG；6)透析除盐；7)用密度梯度离心法或亲和层析法进一步纯化rAAV。
rAAV/ CB-Aβ42病毒的滴度测定以Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)的方法进行，以系列稀释的质粒pSNAV-CB-Aβ42质粒为标准对照，进行southern杂交，将样品的杂交信号与标准对照进行比较、定量。结果显示该rAAV病毒包含有CB-Aβ42核酸序列。rAAV病毒的滴度为2×1012-13病毒颗粒/ml。
rAAV/CB-A β42病毒的电泳纯度测定采用SDS-PAGE法，加样量为5μg，电泳后凝胶进行考马斯亮蓝染色，见AAV-2外壳蛋白VP1、VP2、VP3三条主带，用扫描仪扫描后计算VP1、VP2、VP3蛋白总量占总蛋白量的百分比。结果显示AAV病毒的三条特征性电泳带。
rAAV/Aβ42病毒的包装及其滴度的测定方法与rAAV/CB-Aβ42病毒相同。
实施例3外周血Aβ特异性IgG抗体滴度检测将包装好的病毒分别通过口服、鼻饲和肌内注射，免疫1月龄和11月龄PDAPP转基因小鼠(PDAPPV717I转基因小鼠，参见文献秦川，常洋等。阿尔茨海默病转基因动物模型的建立。解剖学报；2000；31(2)144-147)和C57非转基因小鼠。在免疫后1、2、5、12个月，采集小鼠外周血，分离血清。采用ELISA方法检测血清中抗Aβ抗体的滴度。如图6所示，rAAV/CB-Aβ42免疫小鼠无论在治疗组还是预防组，无论是在转基因小鼠还是在非转基因小鼠，均能够产生高滴度的抗AβIgG抗体，在免疫2个月时，血清中抗AβIgG抗体的滴度最高(抗体的滴度在5,000-15,000之间，相当于10倍rAAV/Aβ42免疫相应小鼠产生的抗体滴度)。在治疗组免疫5个月和预防组免疫12个月后，仍然能够检测到高滴度的抗AβIgG抗体；rAAV-Aβ42免疫转基因小鼠后仅仅产生非常低的抗AβIgG抗体(抗体的滴度在200-500之间)；rAAV/CB-Aβ42在免疫转基因小鼠与非转基因小鼠之间没有明显的差异，而rAAV-Aβ42免疫非转基因小鼠后产生抗AβIgG抗体的滴度明显高于转基因小鼠组(P＜0.05)；rAAV-GFP免疫组和非处理组外周血清中无论在转基因小鼠还是在非转基因小鼠均未检测到抗AβIgG抗体(抗体滴度低于1∶64)。另外还发现，rAAV/CB-Aβ42免疫小鼠的三种途径之间抗体产生的滴度有所不同，肌肉注射组在第一、二个月时，抗体的滴度明显高于灌胃组和鼻饲组，而灌胃组与鼻饲组之间无明显差异。rAAV/CB-Aβ42免疫小鼠，治疗组外周血中抗AβIgG抗体的滴度低于预防组(P＜0.05)。
实施例4血清抗AβIgG抗体对Aβ介导的神经细胞毒性作用的中和作用将SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞(购买于中国协和医科大学细胞中心)按每孔100μl含104个细胞接种于96孔板中，培养基为无血清培养基DMEM/F12(购于美国Gibicol公司)。将Aβ42肽(美国Sigma公司)稀释成0.12μM，37℃孵育1周，使其产生纤维丝。然后，按10∶1和50∶1与免疫血清混匀，7℃孵育24h。同时，以非免疫血清做对照。每一样本做双复孔。将这种反应混合物加到含SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的培养孔中，37℃，孵育2天。细胞的存活率采用MTT实验检测。每孔加入15μl的5mg/ml的MTT，37℃孵育4小时。小心吸出培养上清，每孔加入DMSO 200ul，用移液枪充分吹打。在全自动酶标仪(美国宝生物公司生产)上，使用检测波长570nm测定光密度(OD.)值。
检测结果显示，rAAV/CB-Aβ42免疫小鼠的血清能够部分中和Aβ42介导的对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的神经毒性作用。如图7所示，在rAAV/CB-Aβ42免疫血清1∶10稀释度时，能够部分中和Aβ42的神经毒性作用(70％的细胞存活率)，在1∶50稀释度时，则无明显中和Aβ42神经毒性的作用。而非免疫血清则无明显作用。
实施例5免疫小鼠的行为学检测(水迷宫实验)(1)隐蔽平台实验(Hidden water maze)为了研究rAAV/CB-Aβ42基因重组疫苗对PDAPP转基因小鼠认知和记忆力的改善作用，首先采用Morris水迷宫隐蔽平台实验评价各组小鼠的学习和记忆能力(Morris RGM.1981)。在实验过程中，记录了小鼠搜索隐蔽平台的潜伏期、搜索距离和速度。经分析各组小鼠之间的搜索速度无显著性差异，潜伏期与搜索距离之间具有非常明显的相关性，所以，以小鼠搜索平台的潜伏期作为评价小鼠空间学习和记忆能力的指标。如图8所示，治疗组在6天的训练过程中，尽管各组小鼠搜索平台的潜伏期之间的存在差异，但是潜伏期均有明显的缩短。采用post hoc分析各组的平均潜伏期发现rAAV/CB-Aβ42免疫PDAPP转基因小鼠的三种免疫途径之间没有明显的差异(p＞0.05)，同样rAAV/Aβ42在三种免疫途径之间也没有明显的差异(p＞0.05)。因此，我们以rAAV/CB-Aβ42肌肉注射免疫组与rAAV/Aβ42肌肉注射免疫组、rAAV-GFP肌肉注射组和非处理组进行统计学分析，结果显示rAAV/CB-Aβ42肌肉注射免疫PDAPP转基因小鼠组的平均潜伏期在第5～6天时明显短于rAAV/GFP组(p＜0.01)和非处理组(p＜0.01)。而rAAV/Aβ42免疫转基因小鼠组的潜伏期在6天内与AAV-GFP组(p＞0.05)和非处理组(p＞0.05)均无明显的差异。同样在第5～6天时，rAAV/CB-Aβ42免疫PDAPP转基因小鼠组的平均潜伏期(24.2s)与rAAV/Aβ42组(30.5s)也有明显的差异(p＜0.05)。各组非转基因小鼠之间在实验1～6天均无明显的差异。
为了进一步研究rAAV/CB-Aβ42基因重组疫苗是否能够对PDAPP转基因小鼠的认知和记忆损伤有预防作用，将rAAV/CB-Aβ42基因重组疫苗用于1月龄小鼠，在第12个月后观察小鼠行为学指标。由于rAAV/Aβ42基因重组疫苗在预实验中发现在PDAPP转基因小鼠体内产生抗Aβ抗体的滴度非常低，而且该疫苗在治疗组对转基因小鼠的行为学无明显的改善，所以我们在预防组没有加入rAAV/Aβ42组。
在预防组，如图9所示，我们发现在第6天时rAAV/CB-Aβ42免疫PDAPP转基因小鼠的平均潜伏期明显比rAAV/GFP组(p＜0.05)和非处理组(p＜0.05)缩短。各组非转基因小鼠之间在实验1～6天均无明显的差异(p＞0.05)。
(2)探索实验(Probe test)由于小鼠在搜索隐蔽平台过程中，可能有小鼠偶尔、无意识或随机的碰到平台后上台的，为了消除这种随机性，我们将平台从水池中拿走，让小鼠在水池内搜索平台60秒，观察小鼠在原来含有平台的象限(Target quadrant，TQ)中的搜索时间和经过平台位置次数，通过比较在TQ象限中搜索时间的百分比和经过平台的次数，评价小鼠空间学习和记忆能力。同时，考虑到小鼠可能由于在平台位置搜索不到平台而影响小鼠后面的行为，所以，我们统计前30秒小鼠在TQ象限中的搜索时间和经过平台位置次数作为评价小鼠空间学习和记忆能力的指标。
探索实验结果显示，在治疗组，rAAV/CB-Aβ42免疫小鼠的学习和记忆努力得到明显的改善，而rAAV/Aβ42免疫小鼠的空间学习和记忆能力与rAAV/GFP组和非处理组之间没有明显的差异。如图10.A所示，rAAV/CB-Aβ42免疫小鼠30秒内在TQ象限中搜索时间的百分比明显高于AAV-GFP组、非处理组和rAAV/Aβ42组。rAAV/CB-Aβ42肌注免疫小鼠在TQ象限中搜索时间的百分比为37.5％，而rAAV/GFP组为27.2％，非处理组25.9％。AAV-GFP组和非处理组与rAAV/CB-Aβ42肌注免疫组之间均有明显的差异(p＜0.05)。rAAV-Aβ4242肌注免疫小鼠在TQ象限中搜索时间的百分比为和平均经过平台的次数分别为28.9％，与rAAV/CB-Aβ42肌注免疫组之间也有明显的差异(p＜0.05)。而与rAAV/GFP组和非处理组之间均没有明显的差异(p＞0.05)。同样，在预防组中，如图10.B所示，rAAV/CB-Aβ42免疫的小鼠在TQ象限中搜索时间的百分比也均明显高于rAAV/GFP组和非处理组(p＜0.05)。
如图11.A所示，rAAV/CB-Aβ42肌注免疫组在30秒搜索时间内平均经过平台位置的次数为(1.70±0.35)，明显高于rAAV/GFP组(0.49±0.30)(P＜0.01)和非处理组(0.55±0.21)(P＜0.01)。rAAV/Aβ42肌注免疫组在30秒搜索时间内平均经过平台位置的次数为0.66±0.25，与rAAV/GFP组和非处理组之间没有明显的差异(均P＞0.05)，也明显地少于rAAV/CB-Aβ42肌注免疫组(P＜0.01)。各组非转基因小鼠之间30秒内在TQ象限中搜索时间的百分比和经过平台位置的次数没有明显的差异。
在预防组中，如图11.B所示，rAAV/CB-Aβ4242免疫的小鼠在探索实验中经过平台位置的次数也均明显高于rAAV/GFP组和非处理组(p＜0.05)。
(3)可见平台水迷宫实验(Visible water maze)在做完“probe test”后，我们在平台的上方插一个标志杆，黑白相间，非常醒目，小鼠很容发现。同时在标志杆的上方放一个白色小球，防止影像示踪系统对标志杆的识别而引起实验终止。可见平台水迷宫实验结果显示，在治疗组中，在第四天时rAAV/CB-Aβ42免疫的各组小鼠的平均潜伏期明显的短于其它各组，但是rAAV/CB-Aβ42基因重组疫苗的三种免疫途径之间没有明显的差异。如图12所示，rAAV/CB-Aβ42肌肉注射免疫组在第四天的平均潜伏期为15.1±1.1s，而rAAV/GFP组、非处理组和rAAV/Aβ42肌注组分别为19.4±3.1s、21±3.6s和19.9±3.3s，经可重复方差分析发现，rAAV/CB-Aβ42肌肉注射免疫组与AAV-GFP组、非处理组和rAAV/Aβ42肌注组之间具有显著性差异(P值均小于0.05)。
在预防组中，如图13所示，在第四天时rAAV/CB-Aβ42免疫的各组小鼠的平均潜伏期与rAAV/GFP组和非处理组之间均没有明显的差异，而且rAAV/CB-Aβ42基因重组疫苗的三种免疫途径之间没有明显的差异。我们进一步研究发现PPDAPP转基因小鼠与非转基因小鼠之间在第4天实验中搜索可见平台的平均潜伏期没有明显的差异(P＞0.05)。
通过这几种水迷宫实验检测发现rAAV/CB-Aβ42基因重组疫苗免疫PDAPP转基因小鼠与其它各组小鼠相比较，其学习和记忆能力明显地得到改善。
实施例6ELISA检测脑组织中Aβ淀粉样蛋白的含量为了进一步证实rAAV/CB-Aβ42基因重组疫苗在降低PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ蛋白的作用，我们采用了非常敏感的ELISA方法定量检测小鼠脑组织内人Aβ40和Aβ42的含量。此方法可以检测脑组织内总的人Aβ40和Aβ42的含量，包括可溶性和沉淀的。但这种方法不能检测小鼠Aβ40或Aβ42，因此，在检测非转基因小鼠脑组织提取液时，无检测信号。检测结果显示，在治疗组中，rAAV/CB-Aβ42免疫PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ40or Aβ42的含量均明显低于其它各组。rAAV/CB-Aβ42三种免疫途径之间没有明显的差异，我们以rAAV/CB-Aβ42肌肉注射组与其它各组进行统计学分析。结果显示，rAAV/CB-Aβ42肌肉注射组脑组织内Aβ42的平均含量(253.6±32.7ng/g脑组织湿重)明显低于非处理组(432.8±51.3ng/g)、rAAV/GFP组(415.9±61.3ng/g)和rAAV/Aβ42肌肉注射组(413.5±56.1ng/g)(p值均小于0.05)。同样，rAAV/CB-Aβ42肌肉注射组脑组织内Aβ40的平均含量(756.4±112.5ng/g)也明显低于低于非处理组(954.6±156.3ng/g)、rAAV/GFP组(960.4±154.9ng/g)和rAAV/Aβ42肌肉注射组(925.3±147.8ng/g)(p值均小于0.05)。
同样，在预防组中，我们发现PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ40和Aβ42的含量明显低于治疗组。虽然rAAV/CB-Aβ42三种免疫途径之间没有明显的差异，但是rAAV/CB-Aβ42免疫PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ40和Aβ42的含量均明显低于其它各组。其中，rAAV/CB-Aβ42肌肉注射免疫组PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ40的含量为90.1±13.2ng/g，Aβ42的含量为40.2±10.3ng/g，均明显低于非处理组(Aβ40为130.6±17.9ng/g，Aβ42为51.9±10.2ng/g)和rAAV/GFP组(127.8±18.6ng/g，Aβ42为55.3±13.5ng/g)(p值均小于0.05)。
实施例7PDAPP小鼠脑组织内β淀粉样蛋白免疫组织化学染色为了进一步研究PDAPP转基因小鼠脑组织内β淀粉样蛋白的沉积情况，我们利用Aβ特异性单克隆抗体3D6(购于美国Chemicon公司)做免疫组织化学染色。如图14和图15所示，在治疗组中，在非处理组PDAPP小鼠脑组织的大脑皮质和海马区域均可以看到有明显的β淀粉样蛋白沉积区域，大量成熟的老年斑。rAAV/CB-Aβ42免疫组小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积区域明显减少，虽然也可以看到老年斑，但是老年斑的直径明显比非处理组小，看不到大的老年斑。而rAAV/GFP组和rAAV/Aβ42组小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积情况与非处理组之间没有发现明显的差异。我们利用NIHimage J图像灰度扫描定量分析软件(httprsb.info.nih.gov/nih-image)分析各组PDAPP小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积区域的百分比。结果显示，rAAV/CB-Aβ42免疫组小鼠脑组织大脑皮质和海马区域β淀粉样蛋白的平均值明显低于非处理组、rAAV/GFP组和rAAV/Aβ42组。如图16和图17所示，在预防组中，在非处理组和rAAV/GFP组PDAPP小鼠脑组织内也可以看到有明显的β淀粉样蛋白沉积区域，少量成熟的老年斑，两组之间没有发现明显的差异，而rAAV/CB-Aβ42免疫组小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积区域明显减少，看不到成熟的老年斑。利用图像灰度扫描定量分析各组PDAPP小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积区域的百分比。结果显示，rAAV/CB-Aβ42免疫组小鼠大脑皮质和海马区域β淀粉样蛋白的平均值明显低于非处理组和rAAV/GFP组。
实施例8PDAPP小鼠脑组织刚果红组织学染色如图18和图19所示，在治疗组中，在非处理组和rAAV/Aβ42免疫组PDAPP小鼠脑组织的大脑皮质和海马区域均可以看到有大量明显的嗜刚果红神经细胞。rAAV/CB-Aβ42免疫组小鼠脑组织的大脑皮质和海马区域嗜刚果红神经细胞数目明显减少。表明神经细胞受Aβ蛋白的损伤明显减少。同样，在预防组，如图20和图21所示，rAAV/CB-Aβ42免疫组小鼠脑组织的大脑皮质和海马区域嗜刚果红神经细胞数目比非处理组和rAAV/GFP组明显减少。
实施例9PDAPP小鼠脑组织内星形胶质细胞增生状况的免疫组织化学染色如图22所示，在治疗组中，非处理组和rAAV/Aβ42免疫组组PDAPP小鼠脑组织大脑皮质均可见到大量明显的GFAP阳性星形胶质细胞增生，而rAAV/CB-Aβ42免疫组PDAPP小鼠脑组织内仅有非常弱GFAP阳性星形胶质细胞增生。表明脑组织内活化的反应性星形细胞数目减少，脑组织内炎症反应程度降低。同样，在预防组，如图23所示，rAAV/CB-Aβ42免疫组小鼠脑组织的大脑皮质GFAP阳性星形胶质细胞数目比非处理组和rAAV/GFP组明显减少。
实施例10
CB-Aβ42和Aβ42蛋白在原核细胞中的表达与纯化首先，通过聚合酶链反应(PCR)扩增CB-Aβ42和Aβ42DNA片段(具体步骤同实施例1)，并将它们分别装入pET30a和pET42a原核表达载体中。然后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，通过IPTG诱导，可以得到融合蛋白。将融合蛋白通过His Trap纯化柱加以纯化，然后，用凝血酶X a因子分别将CB-Aβ42蛋白和Aβ42肽片段切割下来，并加以纯化，冻干后，-20℃保存。
实施例11.CB-Aβ42蛋白和Aβ42肽免疫原性的检测将实施例10获得的冻干的CB-Aβ42蛋白和Aβ42肽分别溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，在无佐剂的情况下，皮下免疫Balb/c小鼠，结果显示，在免疫一个月后，CB-Aβ42蛋白免疫组可以产生高滴度的抗β淀粉样蛋白抗体(抗体滴度为1∶10,000～20,000)，而Aβ42肽免疫组仅产生非常低的抗β淀粉样蛋白抗体(抗体滴度为1∶200～500)。由此表明CB-Aβ42蛋白也能够作为预防和治疗阿尔茨海默病的药物。
权利要求
1.一种用于治疗和预防阿尔茨海默病的基因重组疫苗，该疫苗含有编码霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白的重组DNA分子，与该重组DNA分子有效连接的并能够在真核细胞中表达融合蛋白的启动子，以及位于所述重组DNA分子的5’端编码N-末端信号肽的前导序列，其中所述Aβ肽片段选自Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。
2.如权利要求1所述的基因重组疫苗，其中编码霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白的核苷酸序列如图4所示，所述启动子为CMV启动子，所述前导序列为霍乱毒素B亚单位的前导序列。
3.一种重组DNA分子，其编码霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白，所述Aβ肽片段选自Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。
4.如权利要求3所述的重组DNA分子，其具有如图4所示的核苷酸序列。
5.一种融合蛋白，其从N端至C端由霍乱毒素B亚单位、接头Aβ肽片段和Aβ肽片段组成，所述Aβ肽片段选自Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43，所述接头的氨基酸序列为甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其具有图5所示序列。
7.一种重组病毒载体，其包含权利要求3或4的重组DNA分子，所述病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、新培斯病毒或鸡痘病毒。
8.如权利要求7所述的重组病毒载体，其为包含权利要求3或4的重组DNA分子的腺相关病毒。
9.一种药物组合物，其包含权利要求3或4的重组DNA分子及合适的基因转运载体。
10.一种药物组合物，其包含权利要求5或6的融合蛋白及药物学可接受的载体。
11.权利要求3或4的重组DNA分子或者权利要求5或6的融合蛋白在制备治疗和预防阿尔茨海默病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)的治疗和预防的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途。更具体地，本发明的重组腺相关病毒基因疫苗包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子含有编码一种霍乱毒素B亚单位和Aβ肽片段的融合蛋白的核酸序列。本发明还涉及包含所述重组DNA分子或融合蛋白的药物组合物。
文档编号A61P25/00GK1504240SQ0215470
公开日2004年6月16日 申请日期2002年11月29日 优先权日2002年11月29日
发明者何维, 张建民, 吴小兵, 秦川, 董小岩, 维 何 申请人:中国医学科学院基础医学研究所, 本元正阳基因技术股份有限公司, 中国医学科学院实验动物研究所