专利名称：日本血吸虫核酸疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及人畜共患寄生虫病核酸疫苗，特别是针对血吸虫病的核酸疫苗。
背景技术：
血吸虫病是危害人类健康，影响国家经济发展的人畜共患寄生虫病，据1990年WHO资料，血吸虫病分布于76个国家和地区，估计5-6亿人口受威胁，患病人数达2亿多，我国仍有150万病人，耕牛感染也相当严重，是发展中国家包括中国的一个主要公共卫生问题。长期以来，人们将对血吸虫病的有效防治寄希望于有效疫苗的研制开发，现有血吸虫疫苗主要有减毒活疫苗和基因工程蛋白疫苗。血吸虫尾蚴减毒活疫苗需要特定设备携带不方便，数量来源有限，存在血吸虫尾蚴的毒力回复，即存在安全性问题；基因工程蛋白疫苗的制备繁琐，制备流程长，费时，费力，人力物力花费较大，推广应用受到限制。研制出安全、经济、有效、制备简单、性能稳定不需冷藏系统，利于存储运输和使用方便，一次免疫能产生较为持久的免疫保护效果的血吸虫疫苗，是人们的长久愿望。
发明内容
本发明的目的是提供一种血吸虫核酸疫苗，即血吸虫DNA疫苗，包括单价血吸虫核酸疫苗和多价血吸虫核酸疫苗，使其具有安全、经济、有效、制备简单、性能稳定不需冷藏系统，利于存储运输和使用方便，一次免疫能产生较为持久的免疫保护效果等优点，克服现有血吸虫疫苗的不足，从而有效控制人畜感染，减少传播来源和对人的威胁，根本改善血吸虫流行病学状况。
本发明提供的血吸虫核酸疫苗，由真核表达载体pCD或pBK和血吸虫抗原基因组成，其血吸虫抗原基因为日本血吸虫抗原基因Sj-23、Sj-26或Sj-32[Richer D et al.JImmunol，1993；151(1)256-265]。日本血吸虫抗原基因Sj-23、Sj-26和Sj-32的碱基序列[SmithDB，Davem KM，Board PG，et al.Mr 26000 antigen of Schistosoma japonicum recognized byresistant WEHI 129/J mice is a parasite glutathione S-transferase.Proc Natl Acad Sci USA1986；838703-8707]；[Merckelbach A，Hasse S，Dell R，et al.cDNA sequences of Schistosomajaponicum coding for two cathepsin B-like protein and Sj32.Trop Med Parasitol 1994；45193-198]；[Davem KM et al.Mol Biochem Parasitol，1991；48(1)]，分别列于序列表之序列1、序列2和序列3。上述基因的克隆方案均可采用反转录PCR的方法进行，即根据各基因两端序列设计PCR引物，然后以组织来源的RNA为摸板，行反转录PCR扩增相应基因的cDNA，再将扩增产物克隆测序即可。
图1 单价日本血吸虫核酸疫苗制备流程图；图2 多价日本血吸虫核酸疫苗(pBK-Sj26-Sj23)的制备流程图。
具体实施例方式
实施例1 单价DNA疫苗(pCD-Sj26、pCD-Sj32、pCD-Sj23和pBK-Sj26)的制备1.根据Sj23、Sj26和Sj32的碱基序列设计引物，三对引物的碱基序列分别列于序列表之序列4至9，由上海生工生物公司合成。
Sj23之5′端引物见序列4；Sj23之3′端引物见序列5。
Sj26之5′端引物见序列6；Sj26之3′端引物见序列7。
Sj32之5′端引物见序列8；Sj32之3′端引物见序列9。
2.提取血吸虫总RNA，分别以上述三对引物进行逆转录PCR，即RT-PCR，方法如下称取100mg成虫，加1mlTRI20L试剂(GIBCO)匀浆，置室温5min。加0.2ml氯仿，剧烈振摇15s后，置室温2min。在4′1300r/min离心15min，取上清加0.5ml异丙醇，静置10min沉淀RNA。13000r/min离心10min，RNA沉淀用75％乙醇洗涤一次，空气干燥后溶于100μlDEPC处理水中。紫外分光光度计测260nm及280nm的OD值，确定RNA纯度及其含量。1％琼脂糖变性凝胶电泳分离，并分析其完整性。
cDNA第一链合成1～5μg总RNA加0.5μg寡聚核苷酸(dT)12～18及12μl DEPC处理水，于70℃ 10min后置冰浴至少1min。加2μl 10×PCR缓冲液，2μl 25mM MgCl2，1μl 10mM dNTP混合物及2μl 0.1MDDT。置42℃ 5min后，加200u Superscript RT逆转录酶(GIBCO)，混匀，继续置42℃反应50min。置70℃ 15min终止反应。最后加2u RNase H，置37℃ 20min，反应结束后置-20℃备用。
PCR反应条件为10μl 10×PCR缓冲液，1μl 25mM MgCl2，2μl 10mM dNTP混合物，50mM的两种引物各1μl，2～5u Taq DNA聚合酶，加水至100μl体积。94℃变性2min后，按94℃变性、55℃退火、70℃延伸各1min进行30次循环。取5μl PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.将所得PCR产物Sj26、Sj32和Sj23碱基进行酶切后分别连接入真核表达载体pCD得到Sj26、Sj32和Sj23的DNA疫苗电泳回收双酶切后的PCR产物。同样双酶切pCD及pBK载体DNA，回收大片段。在T4DNA连接酶作用下，将回收的两种DNA片段连接重组成pCD-Sj26、pCD-Sj32、pCD-Sj23和pBK-Sj26。
PCD购自Invitrogen公司，为5.4kb，来源于PRC/CMV，具有高效表达。
PBK购自Stratagen公司，为4.5kb。
连接反应条件10×DNA连接缓冲液 2μlpCD DNA0.1μg目的基因DNA0.1-0.3μgT4DNA连接酶(5-10u/？？) 2μl加水至 20μl混匀后，置14℃反应24小时。
用CaCl2法转化大肠杆菌TG1，涂板培养，挑取单克隆扩增后，小规模制备上述重组质粒进行筛选。
感受态细胞的制备(1)接种环从贮存的大肠杆菌菌种取一环菌液，在不含抗菌素的LB琼脂平板上划线，于37℃培养过夜(2)平板上挑取一单菌落，接入2ml不含抗菌素的LB培养基(3)取100μl上述菌液转入含30ml LB培养基的三角烧瓶中，震荡培养2-3小时(4)转入50ml离心管中，置冰上10min，4℃5000rpm离心10min(5)弃上清，将细菌悬浮于25ml 100mM Cacl2中，冰浴20min，同上离心(6)弃上清，细菌重新悬浮于1ml 100mM Cacl2中，冰浴30min后用于转化转化(1)连接产物5μl与200μl感受态细菌混合，冰浴30-60min(2)42℃水浴90-120sec，冰浴2min(3)加800μlLB培养基，37℃震荡培养1h(4)每管取100-2005μl菌液，分别加入LB琼脂板
(5)干燥后，倒置于37℃培养过夜4.经酶切图谱分析法、PCR扩增和核苷酸序列测定转化子证明成功构建了血吸虫DNA疫苗，体内、体外的表达鉴定证实疫苗具有生物学功能(1)酶切分析鉴定小量提取质粒，将重组DNA质粒，用限制性酶消化(Sj26用BamHI和KpnI、Sj32用BamHI和HindIII、Sj23用BamHI和XbaI；限制性内切酶购自华美公司)酶切反应条件如下DNA(10μg) xμl酶1(10u/μl)2μl酶1(10u/μl)2μlBuffer E2μl加水至 20μl混匀，离心后置37℃反应4～6小时或过夜，然后电泳鉴定，结果可见紫外灯下有一条与目的基因片段大小一致的DNA片段。
(2)PCR扩增分析鉴定小量提取质粒，将重组DNA质粒进行PCR扩增(扩增用高保真试剂盒购自华美公司)，反应成分及条件如下10×PCR缓冲液 10μl25mM MgCl26μl10mM dNTP混合物 2μl引物1(50pmol/μl) 1μl引物2(50pmol/μl) 1μl质粒DNA 1μlTaqDNA聚合酶(2-5u/μl)1μlH2O 78μl混匀后加2滴矿物油。按94℃变性、55℃退火、72℃延伸各1min在PCR仪上(PERKIN ELMER公司DNA Thermal Cycler 480)进行30次循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下可见一条与目的基因大小一致的DNA片段。
(3)核苷酸序列测定用WizardTMMinipreps DNA纯化系统(Promega)制备pSj26，用Version 2.0 DNA测序酶测序试剂盒(USB)，分别从插入的eDNA片段两端进行序列测定。将测序结果与菲律宾株日本血吸虫eDNA核苷酸序列进行比较，其核苷酸序列与菲律宾株日本血吸虫cDNA核苷酸序列一致。
(4)表达鉴定a.体内表达鉴定定位免疫小鼠5周龄雄性昆明小鼠，清去大腿外侧毛，苦味酸定点标记，于第一、第十天定点注射100μg/只的质粒DNA，注射前一天同一位置用0.5％盐酸布比卡因50μl预处理，注射用质粒DNA需用生理盐水调至浓度1μg/μl。
荧光标记抗体检测抗原表达免疫小鼠于第14天拉颈处死，取定点处肌肉，冰冻切片6～7μm，丙酮固定5min，PBS洗涤3次，加1∶10小鼠阳性血清37℃，孵育1h后4℃过夜，PBS洗后，加入1∶10羊抗鼠荧光抗体，37℃1h后，PBS洗涤，蒸馏水浸泡2分钟，冷风吹干后，荧光显微镜下观察。
b.体外表达鉴定制备贴壁细胞NIH3T3成纤维细胞培养于含10％小牛血清的DMEM培养基(GIB-CO)，37℃，5％CO2，每3d传代1次。转导前1d，按常规方法将细胞传代，用0.25％胰蛋白酶松散贴壁细胞，计数细胞，1.0～3×105个细胞转至35mm培养皿，培养24h。
制备DOTAP/DNA混合物在灭菌试管中，用20mmol/L Hepes缓冲液(pH7.4)分别稀释25μl pCD-Sj26和pBK-Sj26至0.5μg/μl(终体积为25μl)。另一试管用Hepes缓冲液与15μl DOTAP(宝灵曼公司)混合，终体积为50μl。将上述两种溶液混匀，室温下孵育10～15min。
转导将上述DOTAP/DNA混合物与1ml培养液混匀，加入培养皿，培养3～6h。用新鲜培养液进一步培养48h。胰酶消化后，转移至另一放置了盖玻片的平皿，待细胞贴壁伸展。取出盖玻片，2％多聚甲醛固定10min，吹干，备用。
将1∶100rSj26免疫鼠血清加至细胞片上，37℃湿盒孵育1h，0.2mol/L PBS(pH7.4)洗3次，吹干；再加1∶12羊抗鼠IgG荧光标记抗体(武汉生物制研究所产品)，37℃湿盒孵育45min，PBS洗3次，每次5min干燥后加甘油封片，镜检。
2.进行保护实验，经动物肌肉，皮肤等途径分别接种三种疫苗，观察它们诱导动物抗血吸虫攻击感染的能力，并研究疫苗抗感染的免疫机制观察指标减虫率免疫方案5wk龄雄性BALB/c小鼠(购自中国医学科学院动物研究所)，经股四头肌注射0.5％盐酸布比卡因，50μl/只。1d后在相同部位注射重组DNA pCD-Sj26/Sj32/Sj23和pBK-Sj26，并设空载体pBK-CMV对照，100μg/只，0、3、5wk免疫3次。每组共设10只小鼠。
小鼠免疫后攻击感染末次免疫后4wk，每鼠按常规方法，经腹部皮肤人工感染40条日本血吸虫尾蚴。
减虫率和肝组织减卵率计算 攻击感染后6wk，自小鼠眼眶取血收集血清后，肝门静脉灌注收集成虫并计数。按下述公式计算减虫率 减卵率称取鼠肝总重量后，按常规方法，用5％KOH消化1g肝组织，计算每g肝组织虫卵数(EPG)，然后按下述公式计算肝组织减卵率及每对成虫减卵率，成虫对数即为雌雄合抱成虫数。
中和抗体测定免疫鼠血清中和抗体测定1∶100 1％可溶性成虫抗原(AWA)，1∶2000可溶性虫卵抗原(SEA)包被PVC板，置4℃过夜；加免疫鼠血清1∶50稀释，37℃ 1h；加辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 1∶500稀释，37℃ 1h；加底物邻苯二胺(OPD)和过氧化氢显色30min；2mol/L硫酸终止显色，∑960nm ELISA读数仪(Sigma)测定OD值。
免疫血清介导的细胞毒性实验免疫组和对照组小鼠每4周采血1次，持续至28周，分离血清，冻存备用。采用ELISA方法测定特异性抗体IgG。按常规方法从免疫小鼠腹腔收集巨噬细胞，制备血吸虫童虫，体外进行抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验。
小鼠脾脏T细胞亚群及细胞因子检测以pCD-Sj32 100μg或200μg直接注射BALB/C小鼠肌肉。B组、C组为试验组。A组为对照组，注射等体积PBS或空载体。6周后剖杀小鼠，分离脾脏制备脾细胞，应用FACSort流式细胞仪(BD公司)测定CD4+/CD8+细胞。同时，用血吸虫抗原31/32kD(30.8/31.7ku)和非特异的丝裂原(ConA或PHA)刺激脾细胞，诱生IL-2、TNF和INF-γ细胞因子，然后采用依赖细胞株方法测定上述细胞因子的活性和含量。
实施例2 多价DNA疫苗(pBK-Sj26-Sj23)的制备为了提高日本血吸虫DNA疫苗诱导机体抗血吸虫感染的保护力，本发明提供了混合DNA疫苗(Cocktail疫苗，即鸡尾酒疫苗)和多价DNA疫苗，即使用特异多肽的碱基接头连接两个候选疫苗分子。
1.多肽的碱基接头序列根据日本血吸虫26KDa(Sj26)，23KDa(Sj32)序列及真核表达载体pBK多克隆位点，分别设计2对引物，在Sj26的3’端，即在Sj26的引物2中设计一个与Sj23 5’端相同的酶切位点XbaI及活动度较好的多肽接头G-G-S的碱基序列，引物序列如下Sj26引物15’-TAAGGATCCCATGTCCCCCTATACTAGG-3’ (序列10)引物25’-AGCTCTAGATCCTCCTTTTGGAGGATGGTCGCC-3’(序列11)Sj23引物15’-CGTCTAGAATGGCGACTTTGGGTACT-3’(序列12)引物25’-CGGGTACCTTAAACATTCTGATAATC-3’(序列13)引物均由上海生工生物公司合成。
2.制备过程在已构建的日本血吸虫26kDa(Sj26)和23kDa(Sj32)真核表达载体pCD-Sj26，pCD-Sj23的基础上，根据Sj26kDa，Sj23kDa序列分别设计一对引物，且在引物中引入一个多肽接头的核苷酸序列G-G-S，PCR扩增出26kDa，32kDa基因，将载体pBK与目的基因双酶切，酶切回收后将Sj23连接入载体pBK中，然后再将Sj26连接入pBK-Sj23中，构建成多价DNA疫苗pBK-Sj26-Sj23，(见附图2)。
同样进行保护实验，经动物肌肉分别接种三种疫苗，观察多抗原分子DNA疫苗诱导动物抗血吸虫攻击感染能力，观察指标及方法同前述单价血吸虫DNA疫苗。多价血吸虫DNA疫苗可以激活机体更多的特异性淋巴细胞抵抗血吸虫的侵袭。
实施例3 本发明效果评价实验经实验证明本发明血吸虫DNA疫苗能诱导较好的保护力，由于血吸虫在体内不繁殖，消灭一个，减少一个，因而，血吸虫病疫苗不同于其他传染病疫苗，WHO指出疫苗诱导宿主抗血吸虫的保护力能达到50％，即可认为诱导的保护程度较高。本实验的观察指标有1.减虫率
组别 攻击尾蚴数 攻击感染后 减虫率(％) p值检获成虫数空白对照组 40 30.60±5.32 -- --DNA疫苗pCD-Sj26组 40 19.22±4.12 37.19 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj32组 40 18.80±5.45 38.56 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj23组 40 20.50±7.96 33.01 ＜0.01DNA疫苗pBK-Sj26组 40 17.00±3.89 44.44 ＜0.012.减卵率组别 攻击感染后 减卵率(％) p值每g肝组织虫卵数空白对照组20110.00±6421.29-- --DNA疫苗pCD-Sj26组 5268.75±2759.65 73.80 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj32组 8905.24±6727.72 55.71 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj23组 10137.50±6314.4849.59 ＜0.01DNA疫苗pBK-Sj26组 10610.66±3107.9547.20 ＜0.013.中和抗体测定组别 平均OD值免疫前 免疫后空白对照组 0.1018±0.0050.222±0.037DNA疫苗pCD-Sj26组 0.0948±0.0380.531±0.174DNA疫苗pCD-Sj32组 0.105±0.021 0.447±0.061DNA疫苗pCD-Sj23组 0.1018±0.0270.0429±0.081DNA疫苗pBK-Sj26组 0.1015±0.0110.509±0.1224.免疫血清介导的细胞毒性实验
100μg pCD-Sj32一次免疫后4周血清IgG抗体滴度即可达1∶320，8周以后持续稳定在1∶640以上并持续到免疫后24周，其中最高滴度可达1∶1280。证实pCD-Sj32质粒免疫小鼠后血清可介导小鼠腹腔巨噬细胞产生很强体外杀伤血吸虫童虫作用，而正常小鼠血清组未见明显的童虫表皮损伤。
5.小鼠脾脏T细胞亚群及细胞因子检测从下表可见，B、C两免疫组CD8+百分率明显高于对照组(P＜0.01)，而CD4+无显著性差异(P＞0.05)。细胞因子检测结果表明，免疫组脾细胞诱生的IL-2生物学活性，TNF细胞毒效应和IFN-γ水平，在ConA和31/32kD蛋白刺激下较对照组明显增高，免疫组IL-2分别为321.7和150.6U/ml；TNF分别为72.7％和36.8％；INF-γ分别为1435.6和371.3pg/ml。对照组IL-2分别为117.3和87.4U/ml；TNF分别为24.7％和13.6％；INF-γ分别为666.1和50.0pg/ml。经统计学比较有显著性差异(P＜0.01)。pCD-Sj32 100μg组与200μg注射组无显著性差异。
各组小鼠脾脏T细胞亚群CD4+、CD8+测定结果T细胞亚群(％)(x±s) CD4+/CD8+组别 小鼠数CD4+CD8+比值A7 32.12±9.85 22.57±7.561.42B8 36.38±11.5241.77±19.12*0.87C8 35.64±9.24 38.41±12.23*0.93与A组(对照组)比较*P＜0.01本发明核酸疫苗的减虫率为35.4～44.4％，肝脏减卵率为39.6～69.0％，按照WHO制定的血吸虫疫苗评价标准，本发明结果较好。使用本发明血吸虫DNA疫苗针剂，进行肌肉免疫或皮下免疫小鼠，先后6批共计400多只小鼠观察，证实疫苗能有效诱导抗血吸虫的免疫保护力。本发明血吸虫DNA疫苗对环境无污染和不良影响；对动物反复多次的实验观察未发现不良反应。
序列表.txt<110>华中科技大学同济医学院<120>日本血吸虫核酸疫苗<130>1<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1158<212>DNA<213>血吸虫<400>1tggtaatggt agcgaccggc gctcagctgg aattccctcg gagtctattt attcttgaaa 60aatggcgact ttgggtactg ggatgaggtg tctgaagagt tgtgtgttca tattgaacat120tatctgtctg ttatgttccc ttgtattaat aggcgctggt gcatatgtag aagttaaatt180cagccagtat gaggctaatt tacataaagt ctggcaggcg gctcccatcg caattattgt240ggttggagtg gtaattctca tagtaagctt cttgggctgt tgtggagcta taaaggaaaa300cgtctgcatg ctttacatgt atgcattttt ccttattgtc cttctgattg ctgagttggt360cgccgccatt gttgcggtgg tgtacaagga taaaatcgat gacgaaatta atacactaat420gactggtgct ctggaaaatc caaacgagga aataacggca accatggata agatacaaac480atcattccat tgttgtggag tcaaaggtcc agacgattat aaagggaatg tgccagcatc540atgtaaagaa gggcaagaag tttatgttca gggttgtcta tctgtcttta gtgcattctt600aaaacgcaac ttaataattg ttgcctgtgt ggcattcggt gtatgcttct tccaactgct660aagcatcgtt atagcttgtt gtttgggtca acgaatacac gattatcaga atgtttaaat720tcaaagagtg tagtgtgtgt ggactactca tttctgtttc cttgtttttc ctttttggtt780tttattcaat gatggctttt tattgcctag ataattgtgc cttggttact attatttatg840tattcgattt catcgatgat actctgttgg ataccataat ctcatcgttt cacaatttac900cattattaca aaataaaccg cattgattta cttgatatat attctcacaa atgtgatgaa960tcatcctcat taatcttgtg gtgtatatct cattaataac tttgaatgtt cacaattgcc 1020gtttacatat aattttaagc ctttgatacg ccttttatct aacactatgc ttattttgca 1080gctacaacat cgttagacac gtgtataaat caatgttgtt cggaattccg ccgatactga 1140cgggctccag gagtcgtc 1158
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序列表.txt<210>13<211>26<212>DNA<213>人工<400>13cgggtacctt aaacattctg ataatc 2权利要求
1.一种日本血吸虫核酸疫苗，其特征在于由真核表达载体pCD或pBK和日本血吸虫抗原基因组成。
2.根据权利要求1所述的日本血吸虫核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸虫抗原基因为日本血吸虫抗原基因Sj-23。
3.根据权利要求1所述的日本血吸虫核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸虫抗原基因为日本血吸虫抗原基因Sj-26。
4.根据权利要求1所述的日本血吸虫核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸虫抗原基因为血吸虫抗原基因Sj-32。
5.根据权利要求1所述的日本血吸虫核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸虫抗原基因为日本血吸虫抗原基因Sj-26和日本血吸虫抗原基因Sj-23。
全文摘要
一种血吸虫核酸疫苗，由真核表达载体pCD或pBK和血吸虫抗原基因组成，血吸虫抗原基因包括日本血吸虫抗原基因Sj－23、Sj－26和Sj－32，构成单价核酸疫苗pCD－Sj26、pCD－Sj32、pCD－Sj23和pBK－Sj26，以及多价核酸疫苗pBK－Sj26－Sj23，其减虫率为35.4～44.4％，肝脏减卵率为39.6～69.0％，能有效诱导抗血吸虫的免疫保护力，一次免疫能产生较为持久的免疫保护效果，对环境无污染和不良影响，无不良反应。
文档编号A61P33/12GK1511588SQ0215419
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者石佑恩, 李柳哲 申请人:华中科技大学同济医学院