一种基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法与流程

本发明涉及耐药性细菌检测领域，具体涉及一种基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是目前医院感染最常见的致病菌之一，能够引起皮肤和软组织感染、菌血症、心内膜炎、肺炎、骨和关节感染以及中枢神经系统感染等严重疾病。近年来抗生素的不合理使用导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的数量不断增加。由于mrsa传播速度快，流行范围广，除对甲氧西林耐药外，对其它β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平也产生不同程度的耐药，导致其所致感染治疗困难，已成为严重的临床及公共卫生问题。与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(mssa)相比，mrsa导致的菌血症死亡率更高。万古霉素是治疗mrsa感染的最后一道防线。然而，与β-内酰胺类药物相比，接受万古霉素治疗的mssa菌血症死亡率更高。因此，快速鉴定mrsa对于合理选择抗菌药物具有重要意义。甲氧西林耐药是由染色体定位的meca基因介导的，该基因编码一种新的青霉素结合蛋白pbp2a，pbp2a和细菌其他的青霉素结合蛋白一样具有合成细菌细胞壁的功能，但对β-内酰胺类药物的亲和力很低，因此即使在高浓度的β-内酰胺类抗生素中也能使葡萄球菌存活。

目前已经发展了多种包括表型敏感性试验(头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林肉汤稀释法)、检测meca基因的分子生物学方法(pcr为金标准)、检测pbp2a蛋白的酶联免疫吸附试验(elisa)和胶乳凝集试验等多种方法，用于检测mrsa。表型敏感性试验操作简单、成本低，但由于需要进行细菌的分离培养，往往需要较长的检测周期(24小时以上)。pcr技术灵敏度高，特异性强，但由于一部分meca基因是沉默基因，不表达meca基因产物pbp2a，因此存在假阳性的可能，而且当样本中存在混合感染时，检测的特异性也会降低。elisa法和胶乳凝集法虽然缩短了检测周期，但由于金黄色葡萄球菌a蛋白能够与哺乳动物igg抗体的fc片段结合，为了特异地检出pbp2a，必须将pbp2a蛋白从细菌抽提出来，而且试剂盒中所用的单克隆抗体制备过程繁琐，成本较高。目前胶乳凝集试剂盒还依赖于进口，价格昂贵。因此，亟需发展一种灵敏、快速、简便的mrsa检测方法。

适配体是一种能够与靶分子特异性结合的寡核苷酸片段，将适配体替代传统免疫学检测方法中使用的抗体，能够避免金黄色葡萄球菌a蛋白与哺乳动物igg抗体fc片段结合造成的抗体与金葡菌非特异性结合的问题，且适配体易于制备和标记，因此适配体能够弥补现有mrsa免疫学检测方法的不足。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法，包括以下检测步骤：

(1)将容器内依次加入igg抗体包被的磁纳米颗粒、待检样本，混匀后在25℃～40℃温度中反应15min～60min，使抗体包被的磁纳米颗粒与样本中的金黄色葡萄球菌充分结合；

(2)通过外加磁场收集磁纳米颗粒，洗涤后加入金黄色葡萄球菌裂解试剂，在25℃～40℃温度中反应15min-60min，在外加磁场作用下，收集细菌裂解物；

(3)将步骤(2)细菌裂解物加入到荧光标记的pbp2a蛋白适配体及淬灭基团标记的适配体互补dna链杂交产物中，在22℃～40℃温度中反应15min～60min；

(4)测定加入细菌裂解物前后适配体及其互补dna链杂交产物的荧光变化，根据荧光变化值判断pbp2a存在状态。

优选的，在步骤(1)中，所述抗体为其fc片段能与金黄色葡萄球菌a蛋白结合的所有igg类抗体。

优选的，在步骤(2)中，所述金黄色葡萄球菌裂解试剂为含有能使金黄色葡萄球菌细胞壁裂解的生物酶的溶液。

优选的，在步骤(3)中，所述适配体为能特异识别pbp2a蛋白的所有适配体。

优选的，在步骤(3)中，所述荧光标记的pbp2a蛋白适配体，用于标记的荧光基团可以是包括异硫氰酸荧光素(fitc)在内的所有可用于核酸标记的荧光基团。

优选的，在步骤(3)中，所述荧光标记的pbp2a蛋白适配体与淬灭基团标记的适配体互补dna链的浓度比为1:(1～3)。

优选的，在步骤(4)中，fitc荧光检测激发波长为485nm，发射波长为520nm，待测样本荧光变化值超过阴性对照三次测定荧光变化平均值加三倍标准偏差的为pbp2a阳性。

优选的，所述的荧光标记适配体与淬灭基团标记的不同互补dna链用量均为100μl，浓度为100nmol/l，杂交条件为25℃反应1h，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的浓度为10⁸cfu/ml。

优选的，所述外加磁场为通过beyomag^tm磁分离架(12孔)实现，磁性纳米颗粒为羧基修饰的粒径800nm的磁性纳米粒子，金黄色葡萄球菌裂解试剂为50μg/ml。

优选的，所述检测方法采用基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法检测pbs(图4)和模拟咽拭子标本(图5)中不同浓度耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的荧光变化值；其中模拟咽拭子标本由金黄色葡萄球菌检测为阴性的健康志愿者咽拭子用无菌pbs稀释10倍后加入不同浓度的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315制成，pbs和模拟咽拭子标本中的金黄色葡萄球菌浓度均从10到10⁸cfu/ml。

本发明所采用pbp2a适配体，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，地址：上海市松江区香闵路698号，保藏编号：m23。

所述pbp2a适配体序列为：

5’-ccatccacactccgcaagggtgccccggggggctgttcagcgtggtggtgggatgccgttttggtccttagtctccgtcgtcggctgcctctacat-3’，5’末端标记荧光基团fitc；

优选的，所述适配体互补dna链序列分别为：

5’-gcggagtgtggatgg-dabcyl-3’(q-dna-1),5’-ccttgcggagtgtgg-dabcyl-3’(q-dna-2)和5’-cacccttgcggagtg-dabcyl-3’(q-dna-3)，3’末端均标记淬灭基团dabcyl。

优选的，所述外加磁场为通过beyomag^tm磁分离架(12孔)实现，金黄色葡萄球菌裂解试剂为50μg/ml。

另外，本发明还提供了一种基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法的应用。

本发明通过磁分离技术富集样本中的金黄色葡萄球菌，裂解细菌以释放pbp2a蛋白；荧光标记的pbp2a蛋白适配体及淬灭基团标记的适配体互补dna链杂交后，适配体上标记的荧光被淬灭，当加入金黄色葡萄球菌裂解产物后，mrsa释放的pbp2a能够与适配体特异地结合，使淬灭基团标记的适配体互补dna链从适配体上解离，适配体上标记的荧光得以恢复，因此无需抽提pbp2a即能实现样本中mrsa的快速检测。

本发明具有以下优点：

(1)本发明以pbp2a适配体替代传统免疫学检测方法中使用的抗体，解决了金黄色葡萄球菌a蛋白与哺乳动物igg抗体fc片段结合造成的抗体与金葡菌非特异性结合的问题，且适配体易于制备和标记，因此本发明简化了pbp2a免疫学检测中繁琐的pbp2a提取过程和单克隆抗体的制备，降低了pbp2a检测的成本。

(2)本发明通过免疫磁分离技术富集样本中的金黄色葡萄球菌，简化了传统细菌敏感性试验中细菌的分离培养步骤，缩短了检测周期，同时通过富集过程提高了检测的灵敏度。

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

附图说明

图1为荧光标记适配体与淬灭基团标记的不同互补dna链杂交后的荧光值及加入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解液后的荧光值，其中荧光标记适配体与淬灭基团标记的不同互补dna链用量均为100μl，浓度为100nmol/l，杂交条件为25℃反应1h，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的浓度为10⁸cfu/ml；

图2为荧光标记适配体与淬灭基团标记的不同浓度的最佳互补dna链杂交不同时间后的荧光值，其中荧光标记适配体用量为100μl，浓度为100nmol/l，淬灭基团标记的互补dna链用量为100μl，浓度分别为100、150、200和300nmol/l，反应时间为1h，每隔5min测定一次荧光值；

图3为荧光标记适配体与淬灭基团标记的互补dna链杂交后加入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解液后反应不同时间的荧光值，其中荧光标记适配体与淬灭基团标记的互补dna链用量均为100μl，浓度分别为100nmol/l和200nmol/l，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的浓度为10⁸cfu/ml，反应时间为1h，每隔5min测定一次荧光值。

图4为本发明实施例检测方法采用基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法检测pbs(图4)和模拟咽拭子标本(图5)中不同浓度耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的荧光变化值。其中模拟咽拭子标本由金黄色葡萄球菌检测为阴性的健康志愿者咽拭子用无菌pbs稀释10倍后加入不同浓度的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315制成，pbs和模拟咽拭子标本中的金黄色葡萄球菌浓度均从10到10⁸cfu/ml。内插图是实施例检测方法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的线性范围及拟合的曲线方程。

图5为本发明实施例方法测定模拟咽拭子标本中10到10⁸cfu/ml浓度范围内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的荧光强度变化值，同时以相同浓度的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌ab91118作为对照，荧光强度变化值随n315浓度的增加而增加，并且在10³到10⁵cfu/ml浓度范围内呈现良好的线性关系，阴性对照组荧光强度变化值无明显变化。以上结果充分说明了本发明设计的基于适配体的荧光检测方法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有良好的响应，且不受菌体中除pbp2a以外其他菌体成分的干扰，对pbp2a具有很好的选择性。

图6为本发明实施例检测方法采用基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法检测来源于不同临床标本金黄色葡萄球菌分离株的模拟咽拭子标本的荧光变化值。其中模拟咽拭子标本由金黄色葡萄球菌检测为阴性的健康志愿者咽拭子用无菌pbs稀释10倍后分别加入10⁴cfu/ml的金黄色葡萄球菌临床分离株制成。

图7为本发明适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法步骤流程图。

图8为荧光标记适配体(适配体m25)与淬灭基团标记的互补dna链杂交后的荧光值及加入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解液后的荧光值，其中荧光标记适配体与淬灭基团标记的互补dna链用量均为100μl，浓度为100nmol/l，杂交条件为25℃反应1h，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的浓度为10⁸cfu/ml。

具体实施方式

下面结合具体实施例及图对本发明做进一步解释说明，但应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，本发明的范围不限于此，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

在本实施方式中，荧光测定所用的酶标仪为tecan的多功能微孔板检测仪，型号为spark。

实施例1

(1)本发明实施例中所用的磁性纳米颗粒为羧基修饰的粒径800nm的磁性纳米粒子，购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。pbp2a适配体，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，地址：上海市松江区香闵路698号，保藏编号：m23

pbp2a适配体序列为：

5’-ccatccacactccgcaagggtgccccggggggctgttcagcgtggtggtgggatgccgttttggtccttagtctccgtcgtcggctgcctctacat-3’，5’末端标记荧光基团fitc；

适配体互补dna链序列分别为：5’-gcggagtgtggatgg-dabcyl-3’(q-dna-1),

5’-ccttgcggagtgtgg-dabcyl-3’(q-dna-2)和

5’-cacccttgcggagtg-dabcyl-3’(q-dna-3)，3’末端均标记淬灭基团dabcyl。

(2)本实施例基于上述合成的荧光标记pbp2a适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链，建立高灵敏、高选择性的荧光检测体系，用于mrsapbp2a的检测。

检测步骤包括：

①将容器内依次加入igg抗体包被的磁纳米颗粒、待检样本，混匀后在37℃反应30min，使抗体包被的磁纳米颗粒与样本中的金黄色葡萄球菌充分结合；

②通过外加磁场收集磁纳米颗粒，洗涤后加入金黄色葡萄球菌裂解试剂，37℃反应30min，在外加磁场作用下，收集细菌裂解物；

③将细菌裂解物加入到荧光标记的pbp2a蛋白适配体及淬灭基团标记的适配体互补dna链杂交产物中，37℃反应30min；

④测定加入细菌裂解物前后适配体及其互补dna链杂交产物的荧光变化，根据荧光变化值判断pbp2a存在与否。

在步骤①中，igg抗体包被的磁纳米颗粒用量为10μl(10mg/ml)，待检样本为100μl浓度为10⁵cfu/ml的金黄色葡萄球菌n315菌株。

在步骤②中，外加磁场为上海碧云天生物技术有限公司的beyomag^tm磁分离架(12孔)，金黄色葡萄球菌裂解试剂为50μg/ml武汉赛思锐微生物技术有限公司生产的staphylococcilysine。

在步骤③中，荧光标记的pbp2a蛋白适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链用量分别为100nmol/l和200nmol/l，杂交条件为25℃反应30min。

在步骤④中，荧光检测激发波长为485nm，发射波长为520nm，待测样本荧光变化值超过阴性对照三次测定荧光变化平均值加三倍标准偏差的为pbp2a阳性。

(3)应用基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法，通过本实施例条件检测金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感性，具体流程图如图7所示，结果如图1-6所示：

结果表明，本发明设计能够有效地实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌高灵敏、高选择性检测。

1)如图1、图2、图3所示，为了能够更好的实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的有效检测，本发明研究了淬灭基团标记的不同适配体互补dna链、荧光标记的pbp2a适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链用量及杂交条件、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解液与适配体及其互补dna链杂交产物作用时间对检测结果的影响。优化结果表明，检测体系最佳适配体互补dna链为q-dna-2，荧光标记的pbp2a适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链最佳浓度分别为100nm和200nm，杂交条件为25℃反应30min，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解液与适配体及其互补dna链杂交产物反应时间为25min。

2)pbs和模拟咽拭子标本中不同浓度耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的检测。在优化的最佳反应条件下，采用本发明实施例方法分别测定pbs和模拟咽拭子标本中一系列不同浓度的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315，结果如图4、图5所示。图4显示了本发明实施例方法测定pbs中10到10⁸cfu/ml浓度范围内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的荧光强度变化值，同时以相同浓度的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌ab91118作为对照，荧光强度变化值随n315浓度的增加而增加，并且在10³到10⁵cfu/ml浓度范围内呈现良好的线性关系，阴性对照组荧光强度变化值无明显变化；图5显示了本发明实施例方法测定模拟咽拭子标本中10到10⁸cfu/ml浓度范围内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315的荧光强度变化值，同时以相同浓度的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌ab91118作为对照，荧光强度变化值随n315浓度的增加而增加，并且在10³到10⁵cfu/ml浓度范围内呈现良好的线性关系，阴性对照组荧光强度变化值无明显变化。以上结果充分说明了本发明设计的基于适配体的荧光检测方法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有良好的响应，且不受菌体中除pbp2a以外其他菌体成分的干扰，对pbp2a具有很好的选择性。

3)临床样本分析。采用本发明实施例方法测定来源于不同临床标本金黄色葡萄球菌分离株的模拟咽拭子标本的荧光变化值，测定结果与梅里埃vitek2compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统分析结果一致性为100％。上述结果说明，本发明设计的于适配体的荧光检测新方法能够有效地实现人咽拭子标本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高灵敏、高选择性检测，并且无需单克隆抗体的制备与pbp2a蛋白的抽提，为高效检测临床样本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌提供了有效途径，具有潜在的应用价值。

表1临床样本信息及梅里埃vitek2compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统分析结果

^a本实施例采用vitek2compact全自动药敏分析系统配合gp-ast卡片测定临床样本中的金黄色葡萄球菌对包括苯唑西林在内的多种抗菌药物的敏感性，其中苯唑西林的浓度范围为0.25-4μg/ml，当金黄色葡萄球菌mic≤2μg/ml时，为mssa，当mic≥4μg/ml时，为mrsa。

实施例2

(1)本发明实施例中所用的磁性纳米颗粒为羧基修饰的粒径800nm的磁性纳米粒子，购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。pbp2a适配体，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，地址：上海市松江区香闵路698号，保藏编号：m25。

pbp2a适配体序列为：

5’-ccatccacactccgcaagggtcggtcttccccttcagcttgatggggtcctgggtgccgggatttggttgctggtcttcgtcggctgcctctacat-3’，5’末端标记荧光基团fitc；适配体互补dna链序列为：5-ccttgcggagtgtgg-dabcyl-3’(q-dna-2)，3’末端标记淬灭基团dabcyl。

(2)本实施例基于上述合成的荧光标记pbp2a适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链，建立高灵敏、高选择性的荧光检测体系，用于mrsapbp2a的检测。

检测步骤包括：

①将容器内依次加入igg抗体包被的磁纳米颗粒、待检样本，混匀后在25℃反应60min，使抗体包被的磁纳米颗粒与样本中的金黄色葡萄球菌充分结合；

②通过外加磁场收集磁纳米颗粒，洗涤后加入金黄色葡萄球菌裂解试剂，25℃反应60min，在外加磁场作用下，收集细菌裂解物；

③将细菌裂解物加入到荧光标记的pbp2a蛋白适配体(适配体m25)及淬灭基团标记的适配体互补dna链杂交产物中，25℃反应60min；

④测定加入细菌裂解物前后适配体及其互补dna链杂交产物的荧光变化，根据荧光变化值判断pbp2a存在与否。

在步骤①中，igg抗体包被的磁纳米颗粒用量为10μl(10mg/ml)，待检样本为100μl浓度为10⁸cfu/ml的金黄色葡萄球菌n315菌株。

在步骤②中，外加磁场为上海碧云天生物技术有限公司的beyomag^tm磁分离架(12孔)，金黄色葡萄球菌裂解试剂为50μg/ml武汉赛思锐微生物技术有限公司生产的staphylococcilysine。

在步骤③中，荧光标记的pbp2a蛋白适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链用量分别为100nmol/l和200nmol/l，杂交条件为25℃反应30min。

在步骤④中，荧光检测激发波长为485nm，发射波长为520nm，待测样本荧光变化值超过阴性对照三次测定荧光变化平均值加三倍标准偏差的为pbp2a阳性。

(3)应用基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法，通过本实施例条件检测金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感性，具体流程图如图7所示，测定荧光值，结果与图1-6类似，其中荧光标记适配体m25与淬灭基团标记的互补dna链杂交后的荧光值及加入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解液后的荧光值结果如图8所示：

结果表明，本发明设计能够有效地实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌高灵敏、高选择性检测。

实施例3

(1)本发明实施例中所用的磁性纳米颗粒为羧基修饰的粒径800nm的磁性纳米粒子，购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。pbp2a适配体，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，地址：上海市松江区香闵路698号，保藏编号：m23

pbp2a适配体序列为：

5’-ccatccacactccgcaagggtgccccggggggctgttcagcgtggtggtgggatgccgttttggtccttagtctccgtcgtcggctgcctctacat-3’，5’末端标记荧光基团fitc；

适配体互补dna链序列分别为：5’-gcggagtgtggatgg-dabcyl-3’(q-dna-1),

5’-ccttgcggagtgtgg-dabcyl-3’(q-dna-2)和

5’-cacccttgcggagtg-dabcyl-3’(q-dna-3)，3’末端均标记淬灭基团dabcyl。

(2)本实施例基于上述合成的荧光标记pbp2a适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链，建立高灵敏、高选择性的荧光检测体系，用于mrsapbp2a的检测。

检测步骤包括：

①将容器内依次加入igg抗体包被的磁纳米颗粒、待检样本，混匀后在40℃反应15min，使抗体包被的磁纳米颗粒与样本中的金黄色葡萄球菌充分结合；

②通过外加磁场收集磁纳米颗粒，洗涤后加入金黄色葡萄球菌裂解试剂，40℃反应15min，在外加磁场作用下，收集细菌裂解物；

③将细菌裂解物加入到荧光标记的pbp2a蛋白适配体(适配体m23)及淬灭基团标记的适配体互补dna链杂交产物中，40℃反应15min；

④测定加入细菌裂解物前后适配体及其互补dna链杂交产物的荧光变化，根据荧光变化值判断pbp2a存在与否。

在步骤①中，igg抗体包被的磁纳米颗粒用量为10μl(10mg/ml)，待检样本为100μl浓度为10⁸cfu/ml的金黄色葡萄球菌n315菌株。

在步骤②中，外加磁场为上海碧云天生物技术有限公司的beyomag^tm磁分离架(12孔)，金黄色葡萄球菌裂解试剂为50μg/ml武汉赛思锐微生物技术有限公司生产的staphylococcilysine。

在步骤③中，荧光标记的pbp2a蛋白适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链用量分别为100nmol/l和300nmol/l，杂交条件为25℃反应60min。

在步骤④中，荧光检测激发波长为485nm，发射波长为520nm，待测样本荧光变化值超过阴性对照三次测定荧光变化平均值加三倍标准偏差的为pbp2a阳性。

(3)应用基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法，通过本实施例条件检测金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感性，具体流程图如图7所示，测定荧光值，结果与图8相似。

结果表明，本发明设计能够有效地实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌高灵敏、高选择性检测。

实施例4

(1)本发明实施例中所用的磁性纳米颗粒为羧基修饰的粒径800nm的磁性纳米粒子，购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。pbp2a适配体，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，地址：上海市松江区香闵路698号，保藏编号：m23

pbp2a适配体序列为：

5’-ccatccacactccgcaagggtgccccggggggctgttcagcgtggtggtgggatgccgttttggtccttagtctccgtcgtcggctgcctctacat-3’，5’末端标记荧光基团fitc；

适配体互补dna链序列分别为：5’-gcggagtgtggatgg-dabcyl-3’(q-dna-1),

5’-ccttgcggagtgtgg-dabcyl-3’(q-dna-2)和

5’-cacccttgcggagtg-dabcyl-3’(q-dna-3)，3’末端均标记淬灭基团dabcyl。

(2)本实施例基于上述合成的荧光标记pbp2a适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链，建立高灵敏、高选择性的荧光检测体系，用于mrsapbp2a的检测。

检测步骤包括：

①将容器内依次加入igg抗体包被的磁纳米颗粒、待检样本，混匀后在37℃反应45min，使抗体包被的磁纳米颗粒与样本中的金黄色葡萄球菌充分结合；

②通过外加磁场收集磁纳米颗粒，洗涤后加入金黄色葡萄球菌裂解试剂，37℃反应30min，在外加磁场作用下，收集细菌裂解物；

③将细菌裂解物加入到荧光标记的pbp2a蛋白适配体及淬灭基团标记的适配体互补dna链杂交产物中，22℃反应60min；

④测定加入细菌裂解物前后适配体及其互补dna链杂交产物的荧光变化，根据荧光变化值判断pbp2a存在与否。

在步骤①中，igg抗体包被的磁纳米颗粒用量为10μl(10mg/ml)，待检样本为100μl浓度为10⁵cfu/ml的金黄色葡萄球菌n315菌株。

在步骤②中，外加磁场为上海碧云天生物技术有限公司的beyomag^tm磁分离架(12孔)，金黄色葡萄球菌裂解试剂为50μg/ml武汉赛思锐微生物技术有限公司生产的staphylococcilysine。

在步骤③中，荧光标记的pbp2a蛋白适配体和淬灭基团标记的适配体互补dna链用量分别为100nmol/l和100nmol/l，杂交条件为25℃反应30min。

在步骤④中，荧光检测激发波长为485nm，发射波长为520nm，待测样本荧光变化值超过阴性对照三次测定荧光变化平均值加三倍标准偏差的为pbp2a阳性。

(3)应用基于适配体的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌荧光检测方法，通过本实施例条件检测金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感性，具体流程图如图7所示，结果如图1-6类似：

虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。