本发明涉及一种离心分离检测方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术：
免疫学检测技术是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。常用的有免疫浊度技术、固相酶免疫测定技术、化学发光检测技术、免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术等。
免疫浊度技术，也称免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位，用于定量检测，但检测灵敏度低，不适合于微量检测。固相酶免疫测定技术基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性，又保留酶的活性，在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，具有灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，但检测反应时间长限制了其使用。免疫化学发光检测技术是一种高灵敏的微量及痕量分析技术，具有操作方便、灵敏度高、线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点，广泛地应用于环境、临床、药物分析、食品和工业分析中，也是基于抗原或抗体的固相分离手段及抗原或抗体的发光试剂标记技术，但检测反应时间长及对检测设备的要求高也影响其使用。免疫荧光标记技术、流式细胞术、胶体金技术也是常用的检测技术被广泛使用，但均有其相应的不足，检测反应时间长或灵敏度、准确性欠缺是普遍存在的不足。
高灵敏度、快速、小型化、全定量、自动化是目前临床免疫检测技术产品的发展趋势，但现有的都无法同时实现上述功能。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种离心分离检测方法。本发明具有灵敏度高、检测时间短的特点。
本发明提供的离心分离检测方法，包括如下步骤：采用离心装置驱动液相流经固相膜，所述液相包括含有待检物的待检样品和检测相，所述检测相为含有能够与所述待检物直接或间接形成特异性结合的检测指示剂的物质；所述液相流经固相膜时，与所述固相膜上包被的待检物特异性结合物结合形成检测指示剂-待检物-待检物特异性结合物的复合物，所述复合物被捕获固定到所述固相膜上，检测器通过检测被间接固定到所述固相膜上的检测指示剂的量，即检测到所述待检物的含量。
上述的方法中，所述方法采用的装置中，所述离心装置的旋转部件采用平面型或由中心向外倾斜型。
上述的方法中，所述方法采用的装置中，所述离心装置的旋转部件平面的中部设有：所述待检样品和所述检测相各自的储存装置，所述待检样品和所述检测相的进样装置及驱动装置；
所述离心装置的旋转部件平面的外沿设有所述固相膜的放置装置。
本发明中，所述固相膜的进样近端与液体吸附分散装置连接，进样远端与液体吸附装置连接；；
所述液体吸附分散装置采用具有快速的液体分散特性的固相材料，所述固相材料为多聚酯纤维素膜和/或玻璃纤维素膜，具体可为胶体金标记吸附膜、荧光标记抗体吸附膜、化学发光标记吸附膜和/或分散膜；所述液体吸附装置采用吸水性材料，所述吸水性材料为吸水纸和/或吸水凝胶。
上述的方法中，所述方法采用的装置中，所述检测器设于所述固相膜的一侧或两侧。
上述的方法中，所述离心装置的转速和所述进样装置的进样速度均采用程序控制方式；
所述离心装置的转速为200～10000r/min，具体可为500～5000r/min、800～3000r/min或800～2000r/min。
上述的方法中，所述固相膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、deae纤维素膜，且所述固相膜的一面或两面带有背衬；
所述检测器包括吸光度、荧光、化学发光和图像颜色数字处理的检测器中的任一种。
本发明中，所述聚偏氟乙烯膜简称pvdf膜；
所述deae纤维素膜指的是将二乙氨乙基(deae)引入纤维素分子后制成的纸状薄膜，是一种弱碱型阴离子交换材料。
上述的方法中，所述待检物为具有免疫活性的蛋白质或与蛋白质偶联产生免疫活性的物质；
所述待检物特异性结合物为与所述待检物特异性结合的抗原或抗体；
所述检测指示剂为胶体金属、染料、荧光素和化学发光物质中的至少一种。
上述的方法中，所述胶体金属为胶体金、胶体硒和胶体金磁微粒中的至少一种；
所述荧光素为异硫氰酸荧光素(简称fitc)、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白(pe)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(percp)、碘化丙啶(pi)、别藻青蛋白(apc)和铕化合物中的至少一种，其中铕化合物具体可为氧化铕；
所述化学发光物质为鲁米诺和异鲁米诺及其衍生物类、吖啶酯及吖淀酰胺类、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物和三联吡啶钌中的至少一种。
上述的方法中，所述复合物形成有如下任一种：
1)所述待检物特异性结合物包含有同时与所述待检物和所述检测相形成特异性结合的一级中间相；
2)所述待检物特异性结合物包含有同时与所述一级中间相和所述检测相形成特异性结合的二级中间相；
所述一级中间相和所述二级中间相均为具有特异性结合能力的抗原、抗体、亲和素、生物素及其类似物中的至少一种；
所述方法中还包括在所述结合反应之后用清洗相清洗所述固相膜的步骤，所述清洗相为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和tris缓冲液中的至少一种。
本发明离心分离检测方法应用于免疫产品的含量检测中。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
1、本发明采用离心装置驱动检测的液相在固相膜上流动以及清洗，提高了待检物的捕获结合能力，降低了固相膜的背景噪声干扰，提高方法检测灵敏度，实现了以现有检测试剂的高灵敏度检测。
2、本发明采用离心装置驱动检测的液相在固相膜上流动，改变了现有的膜检测技术依靠自然流动且液体随着在膜上流程的延长而降低的现状，能够保持液体在膜上匀速流动，保证了待检物在膜上结合的均一性，可提高检测准确性。
3、现有膜检测技术依靠自然流动，液体在膜上的流动速度随着时间而减慢，完成一项检测一般需要15分钟以上的时间。而本发明采用离心装置驱动检测液相在固相膜上流动，保持了液体在膜上匀速流动，缩短了检测时间快速。
4、现有的高灵敏度检测技术，均采用多步骤、多环节驱动控制，涉及检测样本、检测相以及反应载体的换位和移动。而本发明采用离心装置驱动液相流动和进样泵进样，操作步骤简单。
5、本发明操作步骤简单，易于实现自动化操作。本发明方法具有高灵敏度、全定量、自动化的特点，同时又具有检测快速、使用设备简单的检测技术；不仅使用方便、减少原料的浪费，同时也显著提高工作效率，应用于检测和分析、分离的诸多领域。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、本发明与现行检测技术的检测准确性的比较
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体(美国genagates公司，其产品目录号为gp301042)，抗人肌红蛋白单克隆抗体(美国genagates公司，货号gp300616)，分光光度计(上海箐华科技仪器有限公司，752紫外可见分光光度计)，人肌红蛋白(sigma-aldrich产品，产品目录号为f3879-1g)，bioflow印膜仪(美国imagene公司)，index切条机(美国a-point公司)，dbf-900封口机(温州江南包装厂)，acbo除湿机(江苏无锡奥波除湿机公司)，台式离心机(美国eppendoff公司)，牛血清白蛋白(简称bsa，sigma产品，货号：b8894)，硝酸纤维素膜片(ae99，由美国genagates公司提供)，多聚酯纤维素膜(reemay2033，美国alstrom公司产品)，吸水纸膜垫(grade470，美国s&s公司产品)，氯金酸(sigma产品，货号：b8894)，胶体金定量层析分析仪(挪威skannex产品)。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液(1％bsa，100mm甘氨酸，50mmpbs,150mmnacl，ph7.4)稀释配置3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml的系列人肌红蛋白溶液。
胶体金标记抗人肌红蛋白单克隆抗体的制备：取10ml纯净水，加热搅拌，待水沸腾时加入500μl10％氯金酸溶液，加热煮沸5分钟，加入500μl12％柠檬酸三钠溶液，保持此溶液搅拌沸腾10分钟，自然降温至室温，即胶体金溶液。取胶体金溶液体积10ml，用10％碳酸钾调ph至8.3，迅速加入抗人肌红蛋白单克隆抗体100μg，至10μg/ml终浓度，晃动烧杯混匀，室温放置30分钟，迅速加入10％牛血清白蛋白溶液100ul，使终浓度为1％，同时摇动烧杯，室温放置30分钟，12000rpm离心20分钟，小心吸出上清液；再加入5ml50mm磷酸盐(pbs)缓冲液，ph7.4，将沉淀悬浮，12000rpm离心20分钟，吸出上清液，将沉淀溶于1.0ml含有1％的牛血清白蛋白和3％蔗糖的磷酸缓冲液内，4℃避光保存。
胶体金标记吸附膜制备：配制含有0.5％pva(即聚乙烯醇)、50mmpbs液、0.5％bsa、0.88％nacl，ph7.4的多聚酯纤维素膜预处理液，置待处理的多聚酯纤维素膜于预处理液内，室温浸泡1小时，将膜取出，置37℃干燥后密封备用，也可直接作为分散膜使用。取胶体金标记抗体溶液，用胶体缓冲液(1％bsa，3％蔗糖，50mmpbs,ph7.4)稀释至od530为30，启动印膜仪，装载抗体，开启加压氮气，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度3.0μl/cm，将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥6小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。胶体金标记吸附膜和分散膜同时也是本发明所述的液体吸附分散装置。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的pvc片(即聚氯乙烯片)，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度0.5μl/cm。将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25％以下，在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及胶体金标记吸附膜，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以胶体金标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子(外向倾斜型)内，向胶体金标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置1-15分钟，2000转/分离心1分钟，再向胶体金标记吸附膜上滴加ph7.4的50mmpbs缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，放置于胶体金定量层析分析仪(即检测器)上读取多克隆抗体印迹条带的数字图像，进行图像处理获得相应的色度数值。对照试纸条不做离心处理，在设定的上述相同的静置时间后，再静置2.5分钟，然后读取相应的色度数值。
实验重复三次，结果取平均值。统计学计算不同预静置时间试纸条的检测值。
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂的检测技术测定结果显示本发明技术检测的相关系数r平均值为0.9884，现有技术检测(不做离心处理)的相关系数r为0.957，p＜0.05，显著优于现有技术的检测结果，说明本发明技术提高了现有技术检测的准确性。实验结果如表1所示。
表1本发明以胶体金为指示剂的检测结果准确性分析(单位：图像色度值)
实施例2、本发明与现行检测技术的最低检出量的比较
一、实验材料
同实施例1
二、实验方法
同实施例1
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂的测定结果，分析采用相关产品开发常用的相关系数r值大于0.98的要求对数据进行了统计处理，以r值大于0.98时的最小值定为最低检出量。结果同样的实验条件下，预静置时间1-15分钟，采用现有技术的最低检出量为25或＞25ng/ml，采用本发明的最低检出量均为3.125ng/ml，检测灵敏度显著高于现有技术，说明本发明技术提高了现有技术检测的检测灵敏度。实验结果如表2所示。
表2本发明以胶体金为指示剂的检测灵敏度分析(单位：图像色度值)
实施例3、本发明对检测特异性的影响
一、实验材料
同实施例1
二、实验方法
同实施例1
特异性检测所用样品为a：50ng/ml肌红蛋白、b：10ng/ml肌钙蛋白i、c：30ng/ml肌酸激酶同工酶、d：80mg/ml人血清白蛋白、e：20mg/ml胆固醇。
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂的检测上述特异性检测样品，实验结果如表3所示，现行技术和本发明技术对肌红蛋白样品重复检测平均值分别为50.3和51.0ng/ml，其它不含有肌红蛋白的样品的检测值在检测方法的检测灵敏度下限以下，均为阴性，且无明显的显色反应。
表3本发明与现行技术检测肌红蛋白特异性的结果比较(单位：ng/ml)
实施例4、本发明与现行化学发光检测技术的检测性能的比较
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体(genagates公司，其产品目录号为gp301042)、辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体(美国genagates公司，货号gp300616)、磁微粒(mp-cooh-20020，郑州英诺生物科技有限公司)、pico发光试剂(thermoscientific)、化学发光检测仪(promega,glomaxmultijrdetectionsystem)、人肌红蛋白(sigma-aldrich产品，产品目录号为f3879-1g)、bioflow印膜仪(美国imagene公司)，index切条机(美国a－point公司)，dbf－900封口机(温州江南包装厂)，acbo除湿机(江苏无锡奥波除湿机公司)，台式离心机(美国eppendoff公司)，牛血清白蛋白(sigma产品，货号：b8894)，硝酸纤维素膜片(ae99，由美国genagates公司提供),多聚酯纤维素膜(reemay2033，美国alstrom公司产品)，吸水纸膜垫(grade470，美国s&s公司产品)。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液(1％bsa，100mm甘氨酸，50mmpbs,150mmnacl，ph7.4)稀释配置3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液。
1、现行化学发光检测技术组
磁微粒的标记，采用常规标记方法，用1mg/ml抗人肌红蛋白多克隆抗体对磁微粒进行标记，抗人肌红蛋白多克隆抗体和磁微粒的用量比(w/w)为3:1。各浓度检测取三个平行管，每管加入用抗人肌红蛋白多克隆抗体标记的磁微粒100μl，再分别加入浓度为对应浓度的人肌红蛋白溶液各100μl，结合反应在37℃震摇温育60分钟，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入pbs200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体200μl，结合反应在37℃震摇温育60分钟，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，加入pbs200μl清洗三次，用磁分离器吸附分离磁微粒，弃上清，转移磁微粒至发光杯，置化学发光检测仪，加入100μl发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟。
2、本发明组
多聚酯纤维素膜预处理同实施例1，置37℃干燥后密封备用。
多克隆抗体印膜同实施例1，置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
化学发光标记吸附膜的制备：取预处理的多聚酯纤维素膜，用50mmpbs缓冲液(ph7.4)稀释辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体0.15mg/ml，启动印膜仪，装载抗体，开启加压氮气，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度3.0μl/cm，将印制后的膜冷冻干燥，置4℃密封保存备用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25％以下，在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及化学发光标记吸附膜，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以化学发光标记吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向化学发光标记吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置2分钟，2000转/分离心1分钟，再向化学发光标记吸附膜上滴加ph7.4的pbs缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，向化学发光标记吸附膜滴加100μl发光底物工作液，800转/分离心30秒，从pvc底片上剥取硝酸纤维素膜，置化学发光检测仪，记录发光量6秒钟。
三、实验结果
采用本发明以化学发光检测技术和现行化学发光检测技术对人肌红蛋白溶液进行检测，实验结果如表4所示，由表4可知，两者均呈现良好的浓度线性关系，相关系数r值分别为0.993和0.992。说明本发明具有与现行化学发光技术相似的检测效果，但显著缩短了检测时间。
表4本发明与现行化学发光检测技术的检测性能的比较(单位：mv)
实施例5、本发明与现行化学发光检测技术检测结果的比较
一、实验材料
同实施例4。
二、实验方法
制作标准曲线：取已知浓度的人肌红蛋白溶液3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液，分别采用本发明和现行化学发光检测技术检测并绘制标准曲线。以已知浓度的人肌红蛋白10ng/ml作为待检样本。其它方法同实施例4。
三、实验结果
三次重复实验的具体结果如表5所示。现行化学发光检测技术测定结果显示待检样本人肌红蛋白的含量为9.52ng/ml，本发明测定结果显示待检样本人肌红蛋白的含量为9.82ng/ml，两种实验方法所得结果基本一致，无统计学差异(p>0.05)，但本发明的完成实验时间明显短于现行技术。
表5本发明与现行化学发光检测技术检测结果的比较(单位：ng/ml)
实施例6、本发明与现行荧光免疫检测技术检测性能的比较
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体(genagates公司，其产品目录号为gp301042)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(美国genagates公司，货号gp300616)、荧光微球(所用荧光素为铕化合物，货号jy-sj126，上海杰一生物公司)、edc(pierce产品，货号22980)、nhs(pierce产品，货号24500)、人肌红蛋白(sigma-aldrich产品，产品目录号为f3879-1g)、荧光定量分析仪(上海巾帼生物公司，hg-98)、bioflow印膜仪(美国imagene公司)，index切条机(美国a－point公司)，dbf－900封口机(温州江南包装厂)，acbo除湿机(江苏无锡奥波除湿机公司)，台式离心机(美国eppendoff公司)，牛血清白蛋白(sigma产品，货号：b8894)，硝酸纤维素膜片(ae99，由美国genagates公司提供)，多聚酯纤维素膜(reemay2033，美国alstrom公司产品)，吸水纸膜垫(grade470，美国s&s公司产品)。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液(1％bsa，100mm甘氨酸，50mmpbs,150mmnacl，ph7.4)稀释配置3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液。
荧光微球标记：取0.5ml荧光微球，使用ph7.2的0.1mpb离心清洗4次，13000rpm离心，用ph7.2的0.1mpb复溶至1ml，加入150ug抗人肌红蛋白单克隆抗体，混匀，加入ph7.2的0.1mpb至1.5ml，加入250ul的40mg/ml的edc水溶液，加入250ul40mg/ml的nhs水溶液，混匀，室温反应60分钟。加入20mg的bsa，混匀，室温反应60分钟。离心吸弃上清，使用0.05mtrisph7.6离心清洗4次后，用1％bsa、0.05mtrisph7.6复溶至10ml待用，4℃保存。
荧光标记抗体吸附膜的制备：配制含有0.5％pva、50mmpbs液、0.5％bsa、0.88％nacl，ph7.4的多聚酯纤维素膜预处理液，置待处理的多聚酯纤维素膜于预处理液内，室温浸泡1小时，将膜取出，置37℃干燥后密封备用。取荧光微球标记抗体溶液，用1％bsa、0.05mtrisph7.6缓冲液稀释3倍，启动印膜仪，装载抗体，开启加压氮气，取多聚酯纤维素膜，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度5.0μl/cm，将印制后的膜，放入干燥箱内，37℃干燥6小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的pvc片，开始印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度0.5μl/cm，将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25％以下，在多克隆抗体印膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及荧光标记抗体吸附膜，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以荧光标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液80ul，静置2分钟，2000转/分离心1分钟，再向荧光标记抗体吸附膜上滴加ph7.4的pbs缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印迹条带的荧光值。
现行技术对照试纸条不做离心处理，在设定的2分钟静置时间后，再静置2.5分钟，然后读取荧光值。
实验重复三次，结果取平均值。
三、实验结果
具体结果如表6所示。本发明技术经如上操作，线性反应良好，相关系数r值为0.995。采用现有技术测定，点样后静置2分，再静置2.5分，线性不佳，12.5ng/ml以下的样品，其发光量接近本底水平，相关系数r值为0.937。本试纸条的现行检测反应时间应该为15分钟，本实验点样后静置4.5分钟，检测反应尚未完成，因此，线性不佳。与现有技术比较，本发明显著缩短了检测时间。
表6本发明与现行免疫荧光检测技术的检测性能的比较(单位：mv)
实施例7、本发明与现行免疫荧光检测技术检测结果的比较
一、实验材料
羊抗鼠igg多克隆抗体(美国genagates公司提供，货号gp301231)，其它同实施例6。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液(1％bsa，100mm甘氨酸，50mmpbs,150mmnacl，ph7.4)稀释配置3.13、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液。配制10ng/ml已知浓度的人肌红蛋白待检样品。
荧光微球标记：同实施例6。
荧光微球膜的印制：同实施例6。
荧光标记抗体吸附膜的制备：同实施例6。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。取羊抗鼠igg多克隆抗体溶液，用50mm磷酸缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的pvc片，开始印膜，同一硝酸纤维素膜上印制抗人肌红蛋白多克隆抗体作为检测线t、羊抗鼠igg多克隆抗体作为质控线c，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度0.5μl/cm，将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25％以下，在多克隆抗体印膜检测线端粘贴荧光标记抗体吸附膜，质控线端粘贴吸水纸膜垫，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以荧光标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液及待测样品各80ul，静置2分钟，2000转/分离心1分钟，再向荧光标记抗体吸附膜上滴加ph7.4的pbs缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印制膜上检测线t和质控线c的荧光值，并计算t/c比值，绘制标准曲线，计算待检样品肌红蛋白浓度。
现行技术对照试纸条不做离心处理，在设定的静置时间后，再静置2.5分钟，然后读取荧光值，并计算t/c比值，绘制标准曲线，计算待检样品肌红蛋白浓度。
实验重复三次，结果取平均值。
三、实验结果
本发明技术经如上操作，标准曲线线性良好，相关系数r值为0.995，随即进行了样品测定，三次实验平均10.84ng/ml，检测误差在10％以内，符合要求。采用现有技术测定，点样后静置2分，再静置2.5分，检测标准曲线线性不佳，相关系数r值为0.937。随后将总的点样后静置时间延长至现行产品检测的15分钟，标准曲线线性良好，相关系数r值为0.989，随即按照15分钟的条件进行了样品测定，三次平均值为9.49ng/ml，检测误差在10％以内，符合要求。三次重复实验的具体结果如表7所示。与现有技术比较，本发明显著缩短了检测时间。
表7本发明以免疫荧光检测技术的检测结果分析(单位：ng/ml)
实施例8、本发明荧光检测与现行酶联免疫检测技术检测结果的比较
一、实验材料
抗人肌红蛋白多克隆抗体(genagates公司，其产品目录号为gp301042)、抗人肌红蛋白单克隆抗体(美国genagates公司，货号gp300616)、荧光微球(所有荧光素为铕化合物，货号jy-sj126，上海杰一生物公司)、edc(pierce产品，货号22980)、nhs(pierce产品，货号24500)、人肌红蛋白(sigma-aldrich产品，产品目录号为f3879-1g)、荧光定量分析仪(上海巾帼生物公司，hg-98)、bioflow印膜仪(美国imagene公司)，index切条机(美国a－point公司)，dbf－900封口机(温州江南包装厂)，acbo除湿机(江苏无锡奥波除湿机公司)，台式离心机(美国eppendoff公司)，牛血清白蛋白(sigma产品，货号：b8894)，硝酸纤维素膜片(ae99，由美国genagates公司提供)，多聚酯纤维素膜(reemay2033，美国alstrom公司产品)，吸水纸膜垫(grade470，美国s&s公司产品)、辣根过氧化物酶标记抗人肌红蛋白单克隆抗体(美国genagates公司，货号gp300616)、邻苯二胺、酶联免疫检测仪(bio-rad,model550)、健康人血清(健康自愿者捐赠)、羊抗鼠igg多克隆抗体(美国genagates公司提供，货号gp301231)。
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用pbs溶液配置3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml的系列人肌红蛋白溶液，用于制作标准曲线。以已知浓度的8.2ng/ml人肌红蛋白健康人血清作为待检样品。
实验采用本发明荧光检测与现行酶联免疫检测技术检测人肌红蛋白溶液并绘制标准曲线，然后取待检样品测定，用标准曲线计算待检样品中肌红蛋白的浓度。每个样品做3个平行管。
1、现行酶联免疫检测技术组
采用96孔酶联板，每管加入抗人肌红蛋白多克隆抗体100μl，4℃过夜包被，清洗三次，再分别加入人肌红蛋白溶液或待检样品100μl，结合反应在37℃温育120分钟，清洗三次，加入抗人肌红蛋白单克隆抗体100μl，结合反应在37℃温育60分钟，清洗三次，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg多克隆抗体100μl，结合反应在37℃温育60分钟，清洗三次，弃上清，加入100μl显色液(配方：0.1m柠檬酸2.43ml，0.2m磷酸氢二钠2.57ml，邻苯二胺5mg，过氧化氢5μl)，避光5分钟，加入2m硫酸终止反应。置酶联免疫检测仪上读取od490吸光值，3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml浓度对应od值分别为0.182、0.215、0.256、0.398、0.791、1.212，绘制标准曲线，r＝0.993，计算待检样品中人肌红蛋白含量。
2、本发明组
荧光微球标记：同实施例6。
荧光微球膜的印制：同实施例6。
荧光标记抗体吸附膜的制备：同实施例6。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。取羊抗鼠igg多克隆抗体溶液，用50mm磷酸缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的pvc片，开始印膜，同一硝酸纤维素膜上印制抗人肌红蛋白多克隆抗体作为检测线t、羊抗鼠igg多克隆抗体作为质控线c，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度0.5μl/cm，将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25％以下，在多克隆抗体印膜检测线端粘贴荧光标记抗体吸附膜，质控线端粘贴吸水纸膜垫，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以荧光标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液及待测样品各80ul，静置2分钟，2000转/分离心1分钟，再向荧光标记抗体吸附膜上滴加ph7.4的pbs缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印印制膜上检测线t和质控线c的荧光值，并计算t/c比值，0.001、0.005、0.024、0.138、0.373、0.683，r＝0.991，绘制标准曲线，计算待检样品肌红蛋白浓度。
三、实验结果
具体结果如表8所示。现行酶联免疫检测技术测定结果显示待检样本人肌红蛋白的含量为7.89ng/ml，本发明测定结果显示待检样本人肌红蛋白的含量为8.19ng/ml，两种实验方法所得结果基本一致，无统计学差异(p>0.05)，但本发明的完成实验时间明显短于现行技术。
表8本发明荧光检测与现行酶联免疫检测技术检测结果的比较(单位：ng/ml)
实施例9、本发明离心速度对检测结果的影响
一、实验材料
同实施例1
二、实验方法
同实施例1
三、实验结果
本发明以胶体金为指示剂，采用不同离心速度，检测了不同浓度的人肌红蛋白样品，实验结果如表9所示。由表9可知，检测准确性与离心速度有关，500、1000、2000转/分的离心速度获得符合要求的检测结果，相关系数r值均大于0.98。3000、4000、5000转/分的离心速度获得的检测结果，其相关系数r值均低于0.98，没有达到相关检测要求。说明本发明进行肌红蛋白检测的最佳离心速度应在2000转/分以下。
表9离心速度对检测结果的影响
实施例10、本发明进样方式对检测结果的影响
一、实验材料
小型行星减速电机(输出转速1000转/分，功率100w)，不锈钢板，蠕动泵(保定创锐泵业，型号bt100lc)，其它同实施例1。
二、实验方法
将小型行星减速电机直立安装，转轴向上。用不锈钢板制作直径30mm圆形板，中央打孔。将不锈钢圆板水平固定到小型直流电机轴上，将蠕动泵安装到不锈钢圆板的中央。将直流电机和蠕动泵与电池连接。将待测样本和清洗液容器固定在蠕动泵的上方。将制备的试纸条以吸水膜垫向外，胶体金标记吸附膜向内的方向粘贴至不锈钢圆板上。蠕动泵吸液管一端放置于待测样本和清洗液容器内，另一端固定至胶体金标记吸附膜上。蠕动泵吸液管进液侧安装有可以改变吸液流方向的三通开关。实验时先置三通开关于待测样本一侧，向胶体金标记吸附膜滴加待测样本40ul，开启离心机，开启蠕动泵，以20ul/min速度向胶体金标记吸附膜加样，2分钟后，旋转三通开关至清洗液一侧，蠕动泵速度调至160ul/min，30秒时关闭蠕动泵，继续离心30秒，关闭离心机，取试纸条用胶体金定量层析分析仪测定肌红蛋白条带部位的图像色度值。其它同实施例1。
本发明对照试纸条采用加样枪滴加并在离心机上离心的进样方式，第一次加样80ul后静置1分钟，然后1000转/分离心1分钟，加清洗液80ul，1000转/分离心1分钟，然后读取图像色度值。
三、实验结果
实验结果如表10所示。两实验组结果比较，自动进样方式的检测结果优于手动点样，相关系数r值分别为0.996含0.983。说明自动进样优于手动进样。
表10本发明进样方式对检测结果的影响(单位：图像色度值)
实施例11、本发明检测方式对检测结果的影响
一、实验材料
同实施例6
二、实验方法
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液(1％bsa，100mm甘氨酸，50mmpbs,150mmnacl，ph7.4)稀释配置3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml人肌红蛋白溶液。
荧光微球标记：同实施例6。
荧光微球膜的印制：同实施例6。
荧光标记抗体吸附膜的制备：同实施例6。
多克隆抗体印膜制备：取抗人肌红蛋白多克隆抗体溶液，用50mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。取羊抗鼠igg多克隆抗体溶液，用50mm磷酸缓冲液(ph7.4)稀释至1mg/ml浓度。启动印膜仪，装载抗体，取贴有硝酸纤维素膜的pvc片，开始印膜，同一硝酸纤维素膜上印制抗人肌红蛋白多克隆抗体作为检测线t、羊抗鼠igg多克隆抗体作为质控线c，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm/秒，液体推进速度0.5μl/cm，将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
半成品组装方法：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25％以下，在多克隆抗体印膜检测线端粘贴荧光标记抗体吸附膜，质控线端粘贴吸水纸膜垫，然后用不干胶带封贴表面。置粘贴好的检测片于切条机上，切成3.5mm试纸条。将纸条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。
取上述制备的试纸条，以荧光标记抗体吸附膜的一侧朝上，置于离心机转子内，向荧光标记抗体吸附膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液及待测样品各80ul，静置2分钟，2000转/分离心1分钟，再向荧光标记抗体吸附膜上滴加ph7.4的pbs缓冲液80ul，2000转/分离心1分钟清洗，取出试纸条，在荧光定量分析仪上读取多克隆抗体印制膜上检测线的荧光值。
双侧检测是在荧光定量分析内，在现有的荧光检测探头相对一侧安装另一个荧光检测探头，检测时撕掉pvc底片，其它条件不变，读取多克隆抗体印制膜上检测线的荧光值。
三、实验结果
具体结果如表11所示。与常规单侧检测比较，本发明采用双侧检测可以明显提高读取的荧光量，可以提高检测灵敏度。
表11本发明检测方式对检测结果的影响(单位：mv)
实施例12、本发明清洗步骤对检测结果的影响
一、实验材料
同实施例1
二、实验方法
对照实验清洗步骤静置，不清洗。其它同实施例1。
三、实验结果
实验结果如表12所示。两实验组结果比较，清洗的检测结果优于不清洗，相关系数r值分别为0.996含0.979。说明实验进样后伴有清洗的步骤是必要的。
表12本发明清洗步骤对检测结果的影响(单位：图像色度值)