一种大豆水溶性蛋白的提取方法与流程

本发明是基于行业相关标准的基础上对大豆水溶性蛋白提取工艺进行优化，属于粮食安全品质检测领域。

背景技术：

大豆在我国常被用来制作各种各样的豆制食品，或用于榨取豆油、酿造酱油，或用于制作蛋白质。大豆是一种极好的蛋白质来源，含有所有必需氨基酸，其加工功能，营养和风味特性在食品工业中发挥着重要作用。在所有粮油籽粒中，大豆是蛋白质含量最高的，约占总体质量的30%~50%，新收获的大豆通常90%以上的蛋白质均可溶于水，这部分蛋白质称之为水溶性蛋白质。目前，能够溶解于水的蛋白质在生产加工中应用广泛，而非水溶性的蛋白都残留在豆渣之中，因此大豆水溶性蛋白的提取受到一系列《国家标准》的严格要求。经过查询，大豆水溶性蛋白主要由大豆球蛋白和大豆清蛋白组成，随着大豆新鲜度的降低，大豆中的水溶性蛋白含量逐渐降低，通常来说，水溶性蛋白含量在我国是大豆是否适合储存的重要判定指标，只有正确地认识大豆中水溶性蛋白的含量标准，在生产加工过程中才可以做到最大量的提高产品的合格率，并且能够提高企业的生产效率。因此，探讨大豆中水溶性蛋白含量的提取具有重要意义，也对我国进行更多大豆产品的研发带来重要影响。

目前，测定蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法、燃烧定氮法、近红外光谱法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、紫外吸收法等，其中测定大豆蛋白的主要方法是凯氏定氮法和考马斯亮蓝法。考马斯亮蓝法也bradford法，在1976年由bradford建立，该方法试剂配制简单，操作简便快捷，反应也是极为灵敏，可测定微克级蛋白质含量，是一种常见的微量蛋白质的测定方法。凯氏定氮法是由丹麦化学家凯道尔于1883年建立的，现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，这些方法是分析有机化合物含氮量的常用方法。凯氏定氮法经典、准确，适用于食品中蛋白质的测定，但是在提升水溶性蛋白提取率方面相关报到较少，因此对这方面的研究有着很大的前景。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆水溶性蛋白的提取方法，能够有效提高大豆水溶性蛋白的提取率，并在此基础上简化提取大豆水溶性蛋白的实验操作，是一种简单、方便、高效、稳定的提取方法。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

1）大豆经垂直旋风磨磨粉，过筛。

2）将所述步骤1）得到的大豆粉装到离心管中，加入蒸馏水，料液比为1:35~1:50。

3）将所述步骤2）得到的豆浆恒温振荡提取大豆水溶性蛋白，提取温度为30~40℃，提取时间为90~150min。

4）将所述步骤3）得到的混合溶液离心，大豆水溶蛋白存在于上清液中。

5）将所述步骤4）得到的上清液放于消化管中消化，随后用自动凯氏定氮仪进行检测。

优选的，所述步骤2）大豆粉与蒸馏水的料液比为1:40。

优选的，所述步骤3）所得溶液的提取温度为35℃。

优选的，所述步骤3）所得溶液的提取时间为120min。

优选的，所述步骤4）所得混合溶液在离心机中的离心转速为3000r/min，离心时间为10min。

附图说明

图1为本发明实施例中时间对提取水溶性大豆蛋白的影响示意图；

图2为本发明实施例中温度对提取水溶性大豆蛋白的影响示意图；

图3为本发明实施例中料液比对提取水溶性大豆蛋白的影响示意图；

图4为行业方法与本发明实施例优化方法的提取率比较图。

具体实施方法

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

（1）振荡提取时间对大豆水溶性蛋白的影响

分别取5.000g(精确到0.001g)磨碎的大豆样品于50ml离心管中，取50ml蒸馏水加入至离心管中。将离心管固定至35℃恒温水浴锅振荡，振荡时间分别为30min、60min、90min、120min、150min。以3000r/min的转速离心10min，取上清液倒入250ml容量瓶中定容。

（2）提取温度对大豆水溶性蛋白的影响

分别取5.000g(精确到0.001g)磨碎的大豆样品于50ml离心管中，加入50ml蒸馏水，摇匀。水浴锅震荡120min，提取温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，3000r/min的转速离心10min。

（3）料液比对大豆水溶性蛋白的影响

分别取1.000g(精确到0.001g)磨碎的大豆样品于50ml离心管中，分别加入体积为10、15、20、25、30、35、40、45、50ml的蒸馏水，摇匀。35℃水浴锅震荡120min，以3000r/min的转速离心10min。

（4）正交优化试验设计

从附图1可以看出，随着提取时间的延长大豆水溶性蛋白溶解的比率在30~90min内显著增加，在90min以后大豆水溶性蛋白的提取量变化不大，几乎处于平稳。从图2中可以看出，温度对大豆水溶性蛋白质的提取也具有重要的影响，当温度在低于25℃时，随着温度的升高，水溶性蛋白质含量提升明显，当温度在25℃~30℃时，温度升高，水溶性蛋白质含量都有小幅度的提高。随着温度的升高，一些难溶于水的蛋白质（如球蛋白）溶解于水，造成实验测定的水溶性蛋白质含量增多。当温度在30℃~40℃时，大豆水溶性蛋白质含量稳定，此时温度对大豆水溶性蛋白质含量的测定，影响可以忽略不计。从图3中可以看出，加水量对大豆水溶性蛋白的提取有着显著的影响。当加水量较低时，大豆水溶性蛋白不能完全从打大豆中析出，有一小部分残留在残渣中，使得测定的水溶性蛋白质含量偏低，所以随着加水提取量逐渐增加大豆水溶性蛋白质含量整体趋势先倾斜上升，直到料液比达到1:35时，大豆水溶性蛋白质含量才趋于稳定。根据单因素试验结果，选择提取温度、提取时间、料液比进行三因素三水平l9(3⁴)正交试验。结果可得，料液比为1:35~1:50，提取温度为30~40℃，提取时间为90~150min；优选为料液比1:40、提取温度35℃、提取时间120min。

表1正交试验因素水平表

实施例1

大豆经垂直旋风磨磨粉，混匀备用。称取1.000g(精确到0.001g)样品于50ml离心管中，加入35ml蒸馏水，摇混使样品均匀分散。将离心管放置于30℃条件下的恒温水浴锅中振荡90min，然后以3000r/min的速度离心10min。离心后取10ml样品于消化管中，同时向消化管中加入12ml浓硫酸和催化剂。消化结束后采用全自动凯氏定氮仪进行测定，记录数据。

实施例2

大豆经垂直旋风磨磨粉，混匀备用。称取1.000g(精确到0.001g)样品于50ml离心管中，加入40ml蒸馏水，摇混使样品均匀分散。将离心管放置于35℃条件下的恒温水浴锅中振荡120min，然后以3000r/min的速度离心10min。离心后取10ml样品于消化管中，同时向消化管中加入12ml浓硫酸和催化剂。消化结束后采用全自动凯氏定氮仪进行测定，记录数据。

实施例3

大豆经垂直旋风磨磨粉，混匀备用。称取1.000g(精确到0.001g)样品于50ml离心管中，加入50ml蒸馏水，摇混使样品均匀分散。将离心管放置于40℃条件下的恒温水浴锅中振荡150min，然后以3000r/min的速度离心10min。离心后取10ml样品于消化管中，同时向消化管中加入12ml浓硫酸和催化剂。消化结束后采用全自动凯氏定氮仪进行测定，记录数据。

对比例1

大豆经高速多功能粉碎机磨成粉，混匀备用。取5.000g(精确到0.001g)样品于50ml离心管中，加入50ml蒸馏水，使劲摇晃使得试样不结块，样品均匀分散。将离心管固定于水浴锅振荡60min，温度控制在（20±2）℃。取下离心管，以2000r/min离心10min，将上清液倒入250ml容量瓶中，向离心管残渣中重新加入50ml20℃蒸馏水，同前再振荡60min，以2000r/min的转速离心10min，将离心管中的上清液倒入容量瓶中。重复操作两次，将提取液收集全部倒入容量瓶中，加蒸馏水定容至250ml。取10ml样品于消化管中，同时向消化管中加入12ml浓硫酸和催化剂1。消化结束后采用全自动凯氏定氮仪进行测定，记录数据。

对比例2

大豆经高速多功能粉碎机磨粉，混匀备用。取1.000g(精确到0.001g)样品，于250ml高型烧瓶中，在室温（25±5）℃下进行。加入50.00ml氢氧化钾溶液，立即在磁力搅拌器上搅拌（搅拌器不加热，磁子转速为700r/min）20min。搅拌结束后立即将全部溶液转移至80ml离心管中，离心10min，转速2700r/min。取上清液15.00ml于消化管中，同时向消化管中加入12ml浓硫酸和催化剂。消化结束后采用全自动凯氏定氮仪进行测定，记录数据。

对比例3

大豆经高速多功能粉碎机磨成粉，混匀备用。称取粉样品5.000g(精确到0.001g)，将试样置于磨口带塞锥形瓶中，加入蒸馏水200ml，摇混使试样均匀分散，然后在25℃~30℃温度下水浴振荡2h，取出后将混合液转移至250ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀后静置1min~2min，将上清液倒入离心管中，在转速1500r/min的离心机中离心10min，再将离心液用玻璃纤维过滤，收集清晰滤液置于锥形瓶中，即为样品水溶性蛋白质测定液。取10ml样品于消化管中，同时向消化管中加入12ml浓硫酸和催化剂。消化结束后采用全自动凯氏定氮仪进行测定，记录数据。

表2本发明及对比例大豆水溶性蛋白的得率

由表2可以看出，对比例1-3是现有国标的提取方法，与本发明相比，本发明中大豆水溶性蛋白的提取率达到34.63%，而且数值稳定，优于对比例。由以上实例可看出，本发明提供的提取水溶性蛋白的方法其操作更为简单，高效，便捷，同时对提升水溶性蛋白的提取率有帮助，对于粮食安全检测有显著的成效。