一种Bcr-Abl融合蛋白检测方法与流程

本发明涉及蛋白质检测方法，特别涉及一种bcr-abl融合蛋白检测方法。

背景技术：

白血病作为一种恶性肿瘤，严重危害人类的生命健康。目前的诊断方法包括细胞形态学分析，免疫学分析，遗传学分析，分子学生物分析等。分子学生物分析主要是针对融合蛋白，融合基因等具有特异性的分子生物标记，若是结合具有高灵敏度的检测手段，即可实现白血病快速微量的检测，对于白血病的检测具有重大意义。

现有技术中白血病细胞内融合蛋白表达水平常用的检测方法为逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)、定量聚合酶链反应(quantitativepolymerasechainreaction，q-pcr)、细胞遗传学、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，fish)和单群微球流式分析。研究表明，rt-pcr技术简易，但检测的是mrna逆转录cdna拷贝，易受反应条件影响，产生假阴性或假阳性结果；q-pcr检测敏感性超过10-4，达到10-5分子水平缓解标准，但只有管家基因mrna拷贝数高于2.5x10⁵，结果才有效；染色体核型分析数目少，定量困难；非流式fish技术3％左右的假阳性率过高，不适用于白血病细胞内融合蛋白表达检测；白血病细胞内融合蛋白的单群微球流式分析方法变异系数大。

对于慢性粒细胞白血病(cml)，由22号染色体的长臂与9号染色体的短臂相互易位(t(9；22)(q34.1；q11.2))产生的费城(ph)染色体是其特征染色体，在分子水平上表现为bcr-abl融合基因的的形成，并表达bcr-abl融合蛋白。由于可能的融合位点不同，产生融合蛋白也不同。根据bcr序列保留在融合蛋白上的数量可以分为三种bcr-abl蛋白，是cml的生物分子标志，其中，p210bcr-abl1蛋白的相关性高达95％。

表面增强拉曼散射(sers，surfaceenhancedramanscattering)光谱学是一种功能强大且极其敏感的分析技术，具有独特的光谱指纹、高灵敏度和非破坏性数据采集等优良特性，相较于荧光，sers灵敏度更佳，在痕量物质的检测方面更具优势。

技术实现要素：

发明目的：本发明目的是提供一种bcr-abl融合蛋白检测方法，该方法灵敏度高。

技术方案：本发明提供一种bcr-abl融合蛋白检测方法，包括如下步骤：

(1)制备捕获磁球：制备纳米磁球，将纳米磁球表面包裹硅壳，包硅磁球表面生长金壳并通过连接抗bcr抗体，使用bsa(牛血清蛋白)填补纳米磁球金壳表面的空隙，形成捕获磁球；

(2)制备sers探针：制备金属纳米棒，在金属纳米棒表面连接拉曼报告分子，将连接有拉曼报告分子的金属纳米棒表面连接抗c-abl抗体，使用bsa填补金属纳米棒表面的空隙，形成sers探针；

(3)融合蛋白检测：取cml细胞细胞裂解液，加入bbs缓冲液稀释，再与捕获磁球和sers探针混合，将混合溶液放在摇床上孵育，磁力分离提纯，分离出的磁球滴在玻片上，烘干，采用sers光谱成像检测，即可。

针对bcr-abl融合蛋白含有两种蛋白的部分这一特性，使用两种对应的抗体将融合蛋白从细胞裂解液中分离出来并识别。纳米磁球具有磁性，可以轻松实现目标蛋白的分离提纯；而检测手段，则使用sers技术。细胞裂解液中的bcr-abl融合蛋白与抗体间的连接为抗原和抗体间的特异性识别。待检测细胞裂解液中若含有bcr-abl融合蛋白，则其会与磁球和探针形成“三明治”结构，通过分离出磁球检测磁球是否具有sers信号，可以检测该“三明治”结构是否已形成，证明bcr-abl融合蛋白的存在。

进一步地，所述步骤(2)制备sers探针的方法为：向每毫升金属纳米棒溶液中加入10-11μl、8-10mm的拉曼报告分子，搅拌，离心清洗，去除多余的拉曼报告分子，再加入通过戊二醛间隔法修饰的抗c-abl抗体，之后加入过量3-5wt％的bsa，离心清洗后重悬于bbs缓冲液中，冷藏，所述抗c-abl抗体的用量为1-2μg抗c-abl抗体对应金属纳米棒2-4ml。

进一步地，所述步骤(2)的金属纳米棒为金纳米棒，制备方法包括如下步骤：先采用ctab(十六烷基三甲基溴化铵)辅助金种生长法制备金纳米棒，将合成的金纳米棒离心，清洗去除多余的ctab，最后重悬于去离子水中，即可。

进一步地，所述步骤(2)中金属纳米棒为金包银纳米棒，制备方法包括如下步骤：先采用ctab辅助金种生长法制备金纳米棒，将合成的金纳米棒离心，清洗去除多余的ctab，加入去离子水搅拌后获得金纳米棒溶液，之后，在25-28℃水浴搅拌下，取2-4ml金纳米棒溶液，向其中依次加入0.0728-0.08gctab，4-5ml去离子水，200-250μl、浓度为14-15mm的溶液，270-280μl、浓度为0.1-0.2m的抗坏血酸，475-480μl、浓度为0.1-0.2m的氢氧化钠，搅拌，待溶液变为酒红色溶液，在8000-10000rpm转速下离心清洗20-22min，重复清洗两次，最后重悬于去离子水中，即可。

进一步地，所述步骤(2)金属纳米棒为银纳米棒，采用湿化学法制备。

进一步地，所述步骤(1)将纳米磁球表面通过stober法包裹硅壳。

进一步地，所述步骤(1)所述包硅磁球表面通过金种静电吸附和金种生长法包裹金壳。

上述技术方案中，拉曼分子通过s-au或s-ag键连接到金属纳米粒子上，在戊二醛修饰抗c-abl抗体中，戊二醛通过聚丙烯氯化铵(pah)包裹住纳米粒子，蛋白质的氨基与戊二醛的醛基形成席夫式碱，将蛋白质连接在纳米粒子上。在金壳上通过au-s键修饰上11-巯基十一烷酸(mua)，再通过edc/hns辅助mua的羧基与蛋白质的氨基发生缩合反应，将蛋白修饰再包金磁球上。

有益效果：本发明的检测方法，灵敏度大，精确度高；本发明的sers探针即使在微量情况下也具有很强的信号，而且纳米磁球表面修饰的金壳与探针连接后形成“热点”，即间隙，可以进一步增强信号，提高检测的灵敏度；相较于荧光流式磁球分选技术，拉曼的光谱峰宽度窄，不存在光漂白现象，可以延长检测时间获得更好的信号，不会发生自淬灭；使用捕获磁球作为基底，可以与待检测细胞裂解液充分混合，增强捕获效率，并且易于分离提纯；仅需μl量级的样品和试剂即可完成，节省资源；不需要大型仪器，只需要拉曼光谱仪即可完成检测，操作方法更加简便。

附图说明

图1为检测bcr-abl融合蛋白的原理示意图；

图2为检测产生sers信号的示意图，其中，laser是激光信号。

具体实施方式

实施例1

本实施例的bcr-abl融合蛋白检测方法，见图1、2，包括如下步骤：

(1)细胞裂解液的制备：取细胞浓度为1.25×106cells/mlk-562细胞(cml细胞，bcr-abl融合蛋白阳性细胞)培养液8ml，转移到10ml离心管中，500g离心10min去除培养液，再使用10ml的冷pbs以500g的转速离心清洗5min，重复两次，加入2ml配置好的裂解液(1mlripa溶液，10μl磷酸酶抑制剂，5μl100mmpmsf溶液，1μl蛋白酶抑制剂)，震荡30秒再在冰上静置4min，重复5次，离心取上清液，-70℃分装保存。

(2)制备金包银纳米棒，制备方法包括如下步骤：先采用ctab辅助金种生长法制备金纳米棒，将合成的金纳米棒离心，清洗2次，去除多余的ctab，加入去离子水搅拌后获得金纳米棒溶液，之后，在25℃水浴搅拌下，取2ml金纳米棒溶液，向其中依次加入0.0728gctab，4ml去离子水，200-250μl硝酸银(agno3，15mm)，280μl抗坏血酸(aa，0.1m)，480μl氢氧化钠(naoh，0.1m)，搅拌1分钟，待溶液变为酒红色溶液，在8000rpm转速下离心清洗20min，重复清洗两次，最后重悬于2ml去离子水中，即可。

(3)制备sers探针：向每毫升金属纳米棒溶液中加入10μl、10mm的拉曼报告分子4mba，搅拌12h，离心清洗18min，去除多余的拉曼报告分子，再加入通过戊二醛间隔法修饰的抗c-abl抗体，之后加入160μl以上、3wt％的bsa，离心清洗后重悬于bbs缓冲液中，冷藏，所述抗c-abl抗体的用量为1μg抗c-abl抗体对应金属纳米棒2ml；

(4)制备捕获磁球：

a、制备纳米磁球，取质量为1g的氯化铁、0.3g聚乙二醇和1.5g醋酸钠，加到40ml乙二醇溶液中，搅拌溶解，150℃下加热6h，产物用无水乙醇清洗，再用去离子水清洗，通过磁力分离出纳米磁球，在惰性气体环境下装入去离子水中，冷藏；

b、磁球包硅，取2ml纳米磁球，加入40ml去离子水和0.1gpvp(polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮，mw：58000)，超声处理后清洗去除pvp，之后再加入10ml去离子水，8ml氨水，180ml无水乙醇，超声处理后加入90μlteos(四乙基原硅酸盐)，再次超声处理后用乙醇清洗，产物重悬于60ml无水乙醇中，接着向无水乙醇中加入2mlaptms(氨丙基三乙氧基硅烷)和500μl去离子水，超声处理后在烘箱中放置，进行氨基固化，完成后使用无水乙醇清洗并重悬于无水乙醇中，即得氨基化的包硅纳米磁球；

c、制备包金纳米磁球，取1ml氨基化的包硅纳米磁球，加到40ml使用thpc(四羟甲基氯化磷)法制备的金种中，振荡12h，磁力分离出吸附了金种的纳米磁球，加到40ml生长溶液中，超声处理0.5min，再加入90μl甲醛，振荡至溶液变为墨绿色，获得包金纳米磁球，使用去离子水清洗并重悬于1ml去离子水中，所述生长溶液是将50ml去离子水，6mg碳酸钾，75μl、8％wt氯金酸溶液混合，摇晃至无色，制得；

d、捕获磁球的制备：将1ml包金纳米磁球与过量的80μl、10mm以上的mua(11-巯基十一烷酸)溶液混合振荡1h，通过au-s键连接mua，去离子水清洗后重悬于mes缓冲液中，分别加入18μl、100mm的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和40μl、100mm的sulfo-hns(硫化n-羟基丁二酰亚胺)溶液，活化10min，使用pbs清洗并重悬于1mlpbs中，加入抗bcr抗体，抗bcr抗体的加入量为每毫升包金纳米磁球添加1μg，振荡孵育1h，最后加入160μl以上、3wt％的bsa，清洗后重悬于bbs缓冲液中，冷藏；

(5)融合蛋白检测：取50μlcml细胞细胞裂解液，加入bbs缓冲液稀释到500μl，与50μl捕获磁球和40μlsers探针混合，将混合溶液放在摇床上孵育1h，磁力分离提纯，分离出的磁球滴在玻片上，烘干，采用sers光谱成像检测，即可。

对比例：将检测用的bcr-abl融合蛋白阳性细胞换成bcr-abl融合蛋白阴性细胞(如ccrf)，其他检测条件同实施例1。

检测结果为：实施例1对于bcr-abl融合蛋白阳性细胞，如k562，可以检测到明显的sers信号，而对比例，对于bcr-abl融合蛋白阴性细胞，如ccrf和其他阴性对照组，如bsa溶液，sers信号很弱或者几乎没有。

实施例2

本实施例的bcr-abl融合蛋白检测方法，包括如下步骤：

(1)细胞裂解液的制备：取细胞浓度为1.25×106cells/mlk-562细胞(cml细胞，bcr-abl融合蛋白阳性细胞)培养液8ml，转移到10ml离心管中，800g离心10min去除培养液，再使用10ml的冷pbs以800g的转速离心清洗5min，重复两次，加入2ml配置好的裂解液(1mlripa溶液，10μl磷酸酶抑制剂，5μl100mmpmsf溶液，1μl蛋白酶抑制剂)，震荡40秒再在冰上静置4min，重复8次，离心取上清液，-70℃分装保存。ccrf细胞(急性淋巴白血病(all)细胞，bcr-abl融合蛋白阴性细胞)的裂解过程同上。

(2)制备金包银纳米棒，制备方法包括如下步骤：先采用ctab辅助金种生长法制备金纳米棒，将合成的金纳米棒离心，清洗3次，去除多余的ctab，加入去离子水搅拌后获得金纳米棒溶液，之后，在28℃水浴搅拌下，取2ml金纳米棒溶液，向其中依次加入0.0728gctab，4ml去离子水，250μl硝酸银(agno3，15mm)，280μl抗坏血酸(aa，0.1m)，480μl氢氧化钠(naoh，0.1m)，搅拌2分钟，待溶液变为酒红色溶液，在10000rpm转速下离心清洗20min，重复清洗两次，最后重悬于2ml去离子水中，即可。

(3)制备sers探针：向每毫升金属纳米棒溶液中加入10μl、10mm的拉曼报告分子，搅拌14h，离心清洗20min，去除多余的拉曼报告分子，再加入通过戊二醛间隔法修饰的抗c-abl抗体，之后加入160μl以上、5wt％的bsa，离心清洗后重悬于bbs缓冲液中，冷藏，所述抗c-abl抗体的用量为1μg抗c-abl抗体对应金属纳米棒4ml：

(4)制备捕获磁球：

a、制备纳米磁球，取质量为1.35g的氯化铁、0.5g聚乙二醇和1.8g醋酸钠，加到40-45ml乙二醇溶液中，搅拌溶解，200℃下加热8h，产物用无水乙醇清洗，再用去离子水清洗，通过磁力分离出纳米磁球，在惰性气体环境下装入去离子水中，冷藏；

b、磁球包硅，取2.5ml纳米磁球，加入45ml去离子水和0.2gpvp，超声处理后清洗去除pvp，之后再加入10ml去离子水，10ml氨水，180ml无水乙醇，超声处理后加入100μl四乙基原硅酸盐，再次超声处理后用乙醇清洗，产物重悬于70ml无水乙醇中，接着向无水乙醇中加入2.4mlaptms和600μl去离子水，超声处理后在烘箱中放置，进行氨基固化，完成后使用无水乙醇清洗并重悬于无水乙醇中，即得氨基化的包硅纳米磁球；

c、制备包金纳米磁球，取2ml氨基化的包硅纳米磁球，加到50ml使用thpc法制备的金种中，振荡14h，磁力分离出吸附了金种的纳米磁球，加到50ml生长溶液中，超声处理1min，再加入100μl甲醛，振荡至溶液变为墨绿色，获得包金纳米磁球，使用去离子水清洗并重悬于2ml去离子水中，所述生长溶液是将55ml去离子水，7mg碳酸钾，85μl、10％wt氯金酸溶液混合，摇晃至无色，制得；

d、捕获磁球的制备：将1.5ml包金纳米磁球与过量的80μl、10mm以上的mua溶液混合振荡1h，通过au-s键连接mua，去离子水清洗后重悬于mes缓冲液中，分别加入18μl、100mm的edc溶液和40μl、100mm的sulfo-hns溶液，活化10min，使用pbs清洗并重悬于1mlpbs中，加入抗bcr抗体，抗bcr抗体的加入量为每毫升包金纳米磁球添加1μg，振荡孵育1h，最后加入160μl以上、3wt％的bsa，清洗后重悬于bbs缓冲液中，冷藏；

(5)融合蛋白检测：取50μlcml细胞细胞裂解液，加入bbs缓冲液稀释到500μl，与50μl捕获磁球和40μlsers探针混合，将混合溶液放在摇床上孵育1h，磁力分离提纯，分离出的磁球滴在玻片上，烘干，采用sers光谱成像检测，即可。

对比例：将检测用的bcr-abl融合蛋白阳性细胞换成bcr-abl融合蛋白阴性细胞(如ccrf)，其他检测条件同实施例1。

检测结果为：实施例1对于bcr-abl融合蛋白阳性细胞，如k562，可以检测到明显的sers信号，而对比例，对于bcr-abl融合蛋白阴性细胞，如ccrf，和其他阴性对照组，如bsa溶液，sers信号很弱或者几乎没有。

实施例3

本实施例的bcr-abl融合蛋白检测方法，包括如下步骤：

(1)细胞裂解液的制备：取细胞浓度为1.25×106cells/mlk-562细胞(cml细胞，bcr-abl融合蛋白阳性细胞)培养液8ml，转移到10ml离心管中，600g离心10min去除培养液，再使用10ml的冷pbs以700g的转速离心清洗5min，重复两次，加入2ml配置好的裂解液(1mlripa溶液，10μl磷酸酶抑制剂，5μl100mmpmsf溶液，1μl蛋白酶抑制剂)，震荡35秒再在冰上静置4min，重复7次，离心取上清液，-70℃分装保存。ccrf细胞(急性淋巴白血病(all)细胞，bcr-abl融合蛋白阴性细胞)的裂解过程同上。

(2)制备金包银纳米棒，制备方法包括如下步骤：先采用ctab辅助金种生长法制备金纳米棒，将合成的金纳米棒离心，清洗3次，去除多余的ctab，加入去离子水搅拌后获得金纳米棒溶液，之后，在26℃水浴搅拌下，取2ml金纳米棒溶液，向其中依次加入0.0728gctab，4ml去离子水，230μl硝酸银(agno3，15mm)，280μl抗坏血酸(aa，0.1m)，480μl氢氧化钠(naoh，0.1m)，搅拌2分钟，待溶液变为酒红色溶液，在9000rpm转速下离心清洗20min，重复清洗两次，最后重悬于2ml去离子水中，即可。

(3)制备sers探针：向每毫升金属纳米棒溶液中加入10μl、10mm的拉曼报告分子，搅拌13h，离心清洗19min，去除多余的拉曼报告分子，再加入通过戊二醛间隔法修饰的抗c-abl抗体，之后加入160μl以上、4wt％的bsa，离心清洗后重悬于bbs缓冲液中，冷藏，所述抗c-abl抗体的用量为1μg抗c-abl抗体对应金属纳米棒3ml：

(4)制备捕获磁球：

a、制备纳米磁球，取质量为1.2g的氯化铁、0.4g聚乙二醇和1.6g醋酸钠，加到42ml乙二醇溶液中，搅拌溶解，160℃下加热7h，产物用无水乙醇清洗，再用去离子水清洗，通过磁力分离出纳米磁球，在惰性气体环境下装入去离子水中，冷藏；

b、磁球包硅，取2.3ml纳米磁球，加入42ml去离子水和0.15gpvp，超声处理后清洗去除pvp，之后再加入10ml去离子水，9ml氨水，180ml无水乙醇，超声处理后加入95μl四乙基原硅酸盐，再次超声处理后用乙醇清洗，产物重悬于64ml无水乙醇中，接着向无水乙醇中加入2.2mlaptms和550μl去离子水，超声处理后在烘箱中放置，进行氨基固化，完成后使用无水乙醇清洗并重悬于无水乙醇中，即得氨基化的包硅纳米磁球；

c、制备包金纳米磁球，取2ml氨基化的包硅纳米磁球，加到43ml使用thpc法制备的金种中，振荡13h，磁力分离出吸附了金种的纳米磁球，加到45ml生长溶液中，超声处理0.6min，再加入95μl甲醛，振荡至溶液变为墨绿色，获得包金纳米磁球，使用去离子水清洗并重悬于2ml去离子水中，所述生长溶液是将53ml去离子水，7mg碳酸钾，77μl、9％wt氯金酸溶液混合，摇晃至无色，制得；

d、捕获磁球的制备：将1.4ml包金纳米磁球与过量的80μl、10mm以上的mua溶液混合振荡1.3h，通过au-s键连接mua，去离子水清洗后重悬于mes缓冲液中，分别加入19μl、100mm的edc溶液和43μl、100mm的sulfo-hns溶液，活化12min，使用pbs清洗并重悬于1mlpbs中，加入抗bcr抗体，抗bcr抗体的加入量为每毫升包金纳米磁球添加1.2μg，振荡孵育2h，最后加入160μl以上、4wt％的bsa，清洗后重悬于bbs缓冲液中，冷藏；

(5)融合蛋白检测：取70μlcml细胞细胞裂解液，加入bbs缓冲液稀释到500μl，与80μl捕获磁球和50μlsers探针混合，将混合溶液放在摇床上孵育2h，磁力分离提纯，分离出的磁球滴在玻片上，烘干，采用sers光谱成像检测，即可。

对比例：将检测用的bcr-abl融合蛋白阳性细胞换成bcr-abl融合蛋白阴性细胞(如ccrf)，其他检测条件同实施例1。

检测结果为：实施例1对于bcr-abl融合蛋白阳性细胞，如k562，可以检测到明显的sers信号，而对比例，对于bcr-abl融合蛋白阴性细胞，如ccrf和其他阴性对照组，如bsa溶液，sers信号很弱或者几乎没有。

实施例4

本实施例与实施例1的区别是将金包银纳米棒改成金纳米棒，制备方法包括如下步骤：先采用ctab辅助金种生长法制备金纳米棒，将合成的金纳米棒离心，清洗2-3次，去除多余的ctab，最后重悬于2ml去离子水中，即可。其他操作同实施例1。

检测结果显示对于bcr-abl融合蛋白阳性细胞，如k562，可以检测到明显的sers信号，而对于bcr-abl融合蛋白阴性细胞，如ccrf和其他阴性对照组，如bsa溶液，sers信号很弱或者几乎没有。

实施例5

本实施例与实施例1的区别是将金包银纳米棒改成银纳米棒，采用湿化学法制备银纳米棒，制备方法包括如下步骤：准备50ml、0.2mm的硝酸银溶液，加入十二烷基磺酸钠(sdsn)至终浓度为1mm，再加入4ml、10mm的柠檬酸三钠，将混合溶液在100℃下搅拌回流70min，溶液变为黄绿色即可。在4000rpm转速下，离心30min，清洗生成的银纳米棒，重复至上清液无色，即可获得银纳米棒。其他操作同实施例1。

检测结果显示对于bcr-abl融合蛋白阳性细胞，如k562，可以检测到明显的sers信号，而对于bcr-abl融合蛋白阴性细胞，如ccrf和其他阴性对照组，如bsa溶液，sers信号很弱或者几乎没有。