基于SPR的角蛋白18‑3A9的检测方法与流程

本发明属于角蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于spr的角蛋白18-3a9的检测方法。

背景技术：

尽管已有化学法、色谱法、光谱法、免疫法、毛细管电泳法和离子迁移谱法等方法应用到生物样本检测中，但化学法灵敏度低，色谱法、毛细管电泳法和离子迁移谱法前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器，光谱法灵敏度低以及对待测样品纯度要求较高，免疫法操作时间过长。目前应用于检测中最广泛的为胶体金试纸，但其以结肠癌易感人群血液为检测对象，且其灵敏度只有300-1000ng/ml。而本技术以其高灵敏度，可实现对结肠癌易感人群的血液中癌症标志物进行检测，从而避免了对客体隐私的侵犯，并大大提高了工作效率。

表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,spr)技术是基于物理光学现象的一种分析技术。当偏振光以共振角入射照在金属和电介质的界面上时，发生全反射，入射光的一部分能量与表面等离子体波发生耦合，引起表面等离子体共振，产生光强急剧减少的反射光。利用光学spr技术测定时，一般是将一种功能反应物(如配体)固定在传感芯片表面金属膜上，当加入待测样品(受体)并使其与传感芯片上的功能反应物相互作用时，引起体系的折射率变化，从而引起spr光学信号的改变。由于spr技术的高识别性、高灵敏性、快速、原位(无需标记)、便捷、实时等优点，spr传感技术现已被广泛应用于生命科学研究、药物筛选、食品分析、环境监测、农业生产等领域。目前，国内外未见将角蛋白18-3a9检测与spr技术结合在一起的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种基于spr的角蛋白18-3a9的检测方法，该检测方法可实时、快速、高灵敏度的检测角蛋白18-3a9，大大降低结肠癌易感人群检测的漏检率，可应用于结直肠癌的早期筛查，具有一定的临床应用价值。

本发明采用如下技术方案：

基于spr的角蛋白18-3a9的检测方法，包括以下步骤:

步骤一：将spr芯片放置到spr仪器中作为传感芯片，仪器温度设定为20～30℃，spr为表面等离子共振的简称；

步骤二：以10～30μl/min的流速往spr芯片表面通入200～300μledc和nhs的混合液，活化该芯片面的羧基基团，该spr芯片经edc/nhs活化后的羧基基团可以偶联bsa上的氨基；

步骤三：在步骤二活化表面羧基后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入0.5～2mg/mlbsa-methamphetamine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到2000～3000；

步骤四：在步骤三bsa-methamphetamine偶联后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入75～100μl乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

步骤五：在步骤四处理后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入30～50μl梯度浓度的角蛋白18-3a9抗体，确定合适的抗体浓度；

步骤六：将一系列不同浓度的30～50μl的角蛋白18-3a9标准品分别与步骤五确定的浓度抗体混合后，以10～30μl/min的流速依次通入spr芯片，建立标准曲线；其中角蛋白18-3a9抗原与步骤五确定的浓度抗体等体积；

步骤七：将30～50μl的待检测样品与步骤五确定的浓度抗体等体积混合后，以10～30μl/min的流速通入spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中角蛋白18-3a9含量。

更进一步地，步骤一中所述spr芯片是先在玻璃基底上表面镀一层2～3nm厚的铬层，再在铬层上表面镀一层40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巯基烷醇后用环氧氯丙烷处理生成环氧基，环氧基共价结合葡聚糖后用溴乙酸处理使葡聚糖羧基化，从而得到羧基化的葡聚糖表面。

更进一步地，步骤二中所述edc和nhs的混合液为edc和nhs的等体积混合溶液，所述edc为n-(3-二甲基氨丙基)-n’-乙基碳二亚胺，浓度为0.2～0.4m；nhs为n-羟基琥珀酰亚胺，浓度为0.1～0.2m。

更进一步地，步骤三中所述bsa-methamphetamine为人工合成的角蛋白18-3a9完全抗原，即在bsa(牛血清白蛋白)表面偶联了methamphetamine(角蛋白18-3a9)分子，可购买获得；ph值为4.5～5.5；

更进一步地，步骤四中所述乙醇胺盐酸盐溶液的浓度为1～2m。

更进一步地，步骤五中所述的角蛋白18-3a9抗体为对bsa-methamphetamine具有特异性识别的鼠源单克隆抗体。

更进一步地，步骤五中每个角蛋白18-3a9抗体反应完成后以10～30μl/min的流速通入naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体；所述的氢氧化钠溶液为50～100mm。

更进一步地，在进入步骤六前，可进行多次注射步骤五确定的最合适浓度抗体,验证实验的重复性。

更进一步地，步骤七中的待测样品为血液或唾液。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)本发明所述检测方法操作简便，实时、快速，只需将抗原抗体混合通入芯片，便可实时观测结果；

(2)本发明所述的芯片制备方案成熟，已经商业化，购买方便，并可重复使用上百次，是一种非常经济的检测方法；

(3)本发明检测方法所达到的灵敏度较高，时间较短，是其他任何技术都没法比拟的；

(4)由于胶体金试纸的灵敏度只有300-1000ng/ml，当待检样品含量低于其灵敏度时，胶体金试纸将无法检测，而本发明正好解决了这一问题。

附图说明

图1为不同浓度抗体与spr响应信号间的关系，其中，抗体浓度依次为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml抗角蛋白18-3a9；

图2为spr芯片的再生示意图，注射氢氧化钠后spr信号骤降，并逐渐恢复至初始基线状态；

图3为分别注射5次恒定浓度抗体的spr响应图；

图4中为角蛋白18-3a9检测的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

基于spr的角蛋白18-3a9的检测方法，包括以下步骤:

步骤一：将spr芯片放置到spr仪器中作为传感芯片，仪器温度设定为20～30℃，spr为表面等离子共振的简称；

步骤二：以10～30μl/min的流速往spr芯片表面通入200～300μledc和nhs的混合液，活化该芯片面的羧基基团，该spr芯片经edc/nhs活化后的羧基基团可以偶联bsa上的氨基；

步骤三：在步骤二活化表面羧基后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入0.5～2mg/mlbsa-methamphetamine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到2000～3000；

步骤四：在步骤三bsa-methamphetamine偶联后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入75～100μl乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

步骤五：在步骤四处理后的spr芯片上以10～30μl/min的流速通入30～50μl梯度浓度的角蛋白18-3a9抗体，确定合适的抗体浓度；

步骤六：将一系列不同浓度的30～50μl的角蛋白18-3a9标准品分别与步骤五确定的浓度抗体混合后，以10～30μl/min的流速依次通入spr芯片，建立标准曲线；其中角蛋白18-3a9抗原与步骤五确定的浓度抗体等体积；

步骤七：将30～50μl的待检测样品与步骤五确定的浓度抗体等体积混合后，以10～30μl/min的流速通入spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中角蛋白18-3a9含量。

更进一步地，步骤一中所述spr芯片是先在玻璃基底上表面镀一层2～3nm厚的铬层，再在铬层上表面镀一层40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巯基烷醇后用环氧氯丙烷处理生成环氧基，环氧基共价结合葡聚糖后用溴乙酸处理使葡聚糖羧基化，从而得到羧基化的葡聚糖表面。

更进一步地，步骤二中所述edc和nhs的混合液为edc和nhs的等体积混合溶液，所述edc为n-(3-二甲基氨丙基)-n’-乙基碳二亚胺，浓度为0.2～0.4m；nhs为n-羟基琥珀酰亚胺，浓度为0.1～0.2m。

更进一步地，步骤三中所述bsa-methamphetamine为人工合成的角蛋白18-3a9完全抗原，即在bsa(牛血清白蛋白)表面偶联了methamphetamine(角蛋白18-3a9)分子，可购买获得；ph值为4.5～5.5；

更进一步地，步骤四中所述乙醇胺盐酸盐溶液的浓度为1～2m。

更进一步地，步骤五中所述的角蛋白18-3a9抗体为对bsa-methamphetamine具有特异性识别的鼠源单克隆抗体。

更进一步地，步骤五中每个角蛋白18-3a9抗体反应完成后以10～30μl/min的流速通入naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体；所述的氢氧化钠溶液为50～100mm。

更进一步地，在进入步骤六前，可进行多次注射步骤(5)确定的最合适浓度抗体,验证实验的重复性。

以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。

表1

表2

以下实施例所采用的spr芯片为kei公司生产的cm5芯片，该芯片的表面为羧甲基化葡聚糖，易偶联bsa上的氨基；所使用的spr仪器为kei公司生产的esprit；胶体金试纸购自艾博生物医药(杭州)有限公司。

实施例1

(1)打开spr仪器，解锁spr芯片插槽，将spr芯片放置到插槽中，锁上芯片插槽；spr仪器温度设定为25℃；

(2)以20μl/min的流速往在spr芯片表面通入注射250μl的edc和nhs等体积比混合液，活化该芯片表面的羧基基团；其中edc浓度为0.4m,nhs浓度为0.1m；

(3)在活化表面羧基后的spr芯片上以20μl/min的流速通入1mg/ml的ph5.0的bsa-methamphetamine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到3000；

(4)在偶联bsa-methamphetamine的spr芯片上以20μl/min的流速通入100μl的1m的乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

(5)以20μl/min的流速通入40μl的6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml梯度浓度的角蛋白18-3a9抗体，结果如图1所示，结果表明6.25μg/ml和12.5μg/ml的抗体浓度下的ru值过小，标曲梯度较窄，降低灵敏度；50μg/ml和100μg/ml的抗体浓度下的ru值较高，但是会耗费掉过多的抗体，不利于成本控制，综合比较下，25μg/ml的抗体浓度最为合适，确定后续测试中的抗体浓度为25μg/ml；

(6)每个样品反应完成后以20μl/min的流速通入10μl50mm的naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体，如图2所示，起始基线为1980ru，再生后基线回到1978ru，cv(变异系数)仅为0.07％，表明芯片再生效果较好；

(7)以20μl/min的流速通入25μg/ml的抗体40μl共5次，验证实验的重复性，结果如图3所示；5次重复的ru分别为1039.5ru，1065.0ru，1062.3ru，1047.1ru，1006.2ru，cv仅为2.26％，表明实验的重复性较好；

(8)将一系列不同浓度的40μl的角蛋白18-3a9标准品(125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.91ng/ml、1.95ng/ml、0.98ng/ml、0.49ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0ng/ml)与25μg/ml抗体等体积依混合后以20μl/min的流速依次通入40μl到spr芯片获取spr响应信号，建立标准曲线，结果如图4所示，在0.06～7.81ng/ml范围内，角蛋白18-3a9的浓度与spr响应信号成线性关系，最低检测浓度在0.06-0.12ng/ml范围，当角蛋白18-3a9浓度超过7.81ng/ml或低于0.06ng/ml时，角蛋白18-3a9的浓度与spr信号不再成线性关系。

(9)待检测人(甲)的基本情况：性别男，年龄31，其血液经胶体金试纸检测结果为角蛋白18-3a9阳性。

将甲的血液12000pm离心10min后，取40μl的样品与等体积的抗体混合后，以20μl/min的流速依次通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中角蛋白18-3a9含量为超出标曲，大于7.18ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得甲血液中角蛋白18-3a9含量为1042.12ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例2

(1)打开spr仪器，解锁spr芯片插槽，将spr芯片放置到插槽中，锁上芯片插槽；spr仪器温度设定为25℃；

(2)以约10μl/min的流速往spr芯片表面通入100μl0.2medc和100μl0.1mnhs的混合液，活化该芯片表面的羧基基团；

(3)在步骤(2)活化表面羧基后的spr芯片上以10μl/min的流速通入0.5mg/mlbsa-methamphetamine溶液(ph值为4.5)，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到约2000；

(4)在步骤(3)bsa-methamphetamine偶联后的spr芯片上以10μl/min的流速通入75μl2m乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

(5)以10μl/min的流速通入30μl的6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml梯度浓度的角蛋白18-3a9抗体，结果如图1所示，结果表明6.25μg/ml和12.5μg/ml的抗体浓度下的ru值过小，标曲梯度较窄，降低灵敏度；50μg/ml和100μg/ml的抗体浓度下的ru值较高，但是会耗费掉过多的抗体，不利于成本控制，综合比较下，25μg/ml的抗体浓度最为合适，确定后续测试中的抗体浓度为25μg/ml；

(6)每个样品反应完成后以10μl/min的流速通入10μl50mm的naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体，如图2所示，起始基线为1980ru，再生后基线回到1978ru，cv(变异系数)仅为0.07％，表明芯片再生效果较好；

(7)以10μl/min的流速通入25μg/ml的抗体30μl共5次，验证实验的重复性，结果如图3所示；5次重复的ru分别为1039.5ru，1065.0ru，1062.3ru，1047.1ru，1006.2ru，cv仅为2.26％，表明实验的重复性较好；

(8)将一系列不同浓度的30μl的角蛋白18-3a9标准品(125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.91ng/ml、1.95ng/ml、0.98ng/ml、0.49ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0ng/ml)与25μg/ml抗体等体积依混合后以20μl/min的流速依次通入30μl到spr芯片获取spr响应信号，建立标准曲线，结果如图4所示，在0.06～7.81ng/ml范围内，角蛋白18-3a9的浓度与spr响应信号成线性关系，最低检测浓度在0.06-0.12ng/ml范围，当角蛋白18-3a9浓度超过7.81ng/ml或低于0.06ng/ml时，角蛋白18-3a9的浓度与spr信号不再成线性关系。

(9)待检测人(乙)的基本情况：性别男，年龄43，其血液经胶体金试纸检测结果为角蛋白18-3a9阴性。

将乙的血液12000pm离心10min后，取30μl的样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以10μl/min的流速通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中角蛋白18-3a9含量超出标曲，大于7.81ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得乙血液中角蛋白18-3a9含量为142.47ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例3

(1)打开spr仪器，解锁spr芯片插槽，将spr芯片放置到插槽中，锁上芯片插槽；spr仪器温度设定为30℃；

(2)以约30μl/min的流速往spr芯片表面通入150μl0.2medc和150μl0.2mnhs的混合液，活化该芯片表面的羧基基团；

(3)在步骤(2)活化表面羧基后的spr芯片上以30μl/min的流速通入2mg/mlbsa-methamphetamine溶液(ph值为5.5)，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(ru)达到约3000；

(4)在步骤(3)bsa-methamphetamine偶联后的spr芯片上以30μl/min的流速通入100μl2m乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

(5)以30μl/min的流速通入50μl的6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml梯度浓度的角蛋白18-3a9抗体，结果如图1所示，结果表明6.25μg/ml和12.5μg/ml的抗体浓度下的ru值过小，标曲梯度较窄，降低灵敏度；50μg/ml和100μg/ml的抗体浓度下的ru值较高，但是会耗费掉过多的抗体，不利于成本控制，综合比较下，25μg/ml的抗体浓度最为合适，确定后续测试中的抗体浓度为25μg/ml；

(6)每个样品反应完成后以30μl/min的流速通入10μl50mm的naoh溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体，如图2所示，起始基线为1980ru，再生后基线回到1978ru，cv(变异系数)仅为0.07％，表明芯片再生效果较好；

(7)以30μl/min的流速通入25μg/ml的抗体50μl共5次，验证实验的重复性，结果如图3所示；5次重复的ru分别为1039.5ru，1065.0ru，1062.3ru，1047.1ru，1006.2ru，cv仅为2.26％，表明实验的重复性较好；

(8)将一系列不同浓度的50μl的角蛋白18-3a9标准品(125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.91ng/ml、1.95ng/ml、0.98ng/ml、0.49ng/ml、0.24ng/ml、0.12ng/ml、0.06ng/ml、0ng/ml)与25μg/ml抗体等体积依混合后以20μl/min的流速依次通入40μl到spr芯片获取spr响应信号，建立标准曲线，结果如图4所示，在0.06～7.81ng/ml范围内，角蛋白18-3a9的浓度与spr响应信号成线性关系，最低检测浓度在0.06-0.12ng/ml范围，当角蛋白18-3a9浓度超过7.81ng/ml或低于0.06ng/ml时，角蛋白18-3a9的浓度与spr信号不再成线性关系。

(9)待检测人(丙)的基本情况：性别男，年龄22，其血液经胶体金试纸检测结果为角蛋白18-3a9阴性。

将乙的血液12000pm离心10min后，取50μl的样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以30μl/min的流速通入50μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中角蛋白18-3a9含量为6.11ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得丙血液中角蛋白18-3a9含量为6.02ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例4

待检测人(丁)的基本情况：性别男，年龄21，其血液经胶体金试纸检测结果为角蛋白18-3a9阳性。

取40μl丁的血液样品与等体积的抗体混合后，以20μl/min的流速依次通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中角蛋白18-3a9含量为超出标曲，大于7.18ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得丁血液中角蛋白18-3a9含量为3219.65ng/ml，与本发明测得的结果一致。

实施例5

待检测人(戊)的基本情况：性别男，年龄37，其血液经胶体金试纸检测结果为角蛋白18-3a9阳性。

取30μl戊的血液样品与等体积的抗体混合后，以10μl/min的流速通入30μl到spr芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得血液中角蛋白18-3a9含量超出标曲，大于7.81ng/ml。

验证下本实施例检测结果的真实性：以气相色谱-质谱联用技术(gc/ms)和固相萃取技术(spe)相结合测得戊血液中角蛋白18-3a9含量为2613.72ng/ml，与本发明测得的结果一致。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。