一种基于表面增强拉曼光谱痕量检测赤藓红浓度的方法与流程

本发明涉及一种通过表面增强拉曼散射痕量检测赤藓红浓度的方法，属于色素检测技术领域。

背景技术

赤藓红作为一种合成色素，因其色泽鲜艳，性能稳定，外观美观等优势，在食品和化妆品行业中被广泛应用。然而，近期的研究表明使用含有赤藓红的食品和化妆品增加了消费者患癌症的风险，这些产品包括红酒、鸡尾酒、糖果和口红等产品。部分国家对赤藓红的使用有严格的限制，然而，这些国家禁止的染料仍然可以出口到其他没有严格要求的国家。此外，由于法律没有严格的规定，制造商通常不会标记化妆品中使用的赤藓红。在这种情况下，所有含有赤藓红的商品均有可能出口到原国家和其他国家。

同时某些产品含有低浓度的赤藓红，常规方法很难检测，因而为了降低全球癌症风险，限制赤藓红的使用，需要一种敏感的定量检测方法。现有的对赤藓红的痕量检测方法包括：一阶导数可见光分光光度法、高效液相色谱、液相色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法、化学滴定法等。然而，上面提及的大多数方法需要复杂的预处理，操作费时，同时检测成本相对较高，需要有机或水溶剂提取，并且包含多个洗涤和固相萃取的过程。

表面增强拉曼光谱技术作为一种集成无损检测，独特的光谱指纹和高灵敏度等特征的光谱技术，已被应用于化学和生物传感的识别和检测中；但是常规的表面增强拉曼技术很难实现定量检测，一方面，样品的光学吸收可以通过衰减激发和拉曼强度来影响拉曼谱带强度，这种效应称为自吸收，发生在紫外-可见-近红外吸收带与激发波长和拉曼散射一致的样品中，导致样品浓度和谱带强度之间存在非线性关系；另一方面是仪器和基板是，在定量测试中，诸如光源和背景噪声等因素可能对拉曼响应产生不可预测的影响。因此，通过直接测量不同浓度下的峰强度，定量分析存在很大误差。目前仅仅是利用该技术实现了赤藓红的定性鉴别，还无法定量痕量检测出赤藓红具体含量，从而制约了表面增强拉曼光谱技术的在化学和生物传感识别和检测方面的应用发展。

技术实现要素：

为了解决上述问题，实现表面增强拉曼散射(sers)对赤藓红的痕量检测，本发明引入了内标法，减少了利用拉曼光谱技术进行定量检测时出现的光源的不稳定性、背景噪声和“自吸收”效应对检测正确性的影响，使得定量检测可行性更高，更为准确。

本发明的第一个目的是提供一种表面增强拉曼散射测量赤藓红浓度的方法，所述方法是结合内部标准法，包括如下步骤：

(1)制备表面增强拉曼所需的纳米银基底；

(2)制备多浓度梯度的赤藓红与固定浓度内标化合物的混合溶液；

(3)将混合溶液与银纳米基底结合，测量其拉曼谱图；

(4)根据步骤(3)测得的拉曼谱图，计算得到赤藓红特征峰与内标化合物特征峰的绝对峰强度的比值，建立峰强比值与赤藓红浓度之间的线性关系模型。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(1)中，纳米银基底制备具体包括：以硫酸亚铁还原硝酸银，合成了银纳米粒子，同时在反应溶液中加入柠檬酸钠，其吸附在银纳米粒子表面，起到稳定和分散的作用。先将30-40ml柠檬酸钠溶液(350-450g/l)和20-30ml硫酸亚铁溶液(350-450g/l)均匀混合以制备还原液，再制备20-30ml硝酸银溶液(80-120g/l)，然后将还原液以的速率搅拌滴加到20-30ml硝酸银溶液(80-120g/l)中，将所得的混合溶液进行提纯并将纳米银泥涂抹在玻璃片上，最后进行干燥得到基底。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(1)中还原液的滴加速度为10-20ml/min。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(2)中的内标化合物包括硫氰化钾。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(2)中混合溶液包括150-250mg/l内标化合物和不同浓度的赤藓红。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(3)中，在sers测量之前，将样品液滴在基板上，利用拉曼显微镜进行测量，其光源由掺钕钇铝石榴石的波长为532nm激光器提供，光通过1800个凹槽/mm的衍射光栅，引导到背照式电子倍增检测器上，激光束以0.025mw的功率聚焦在基底与待测溶液接触面上，同时每个液滴随机选择多个点进行拉曼测量。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(4)中赤藓红的特征峰包括1092±5cm^-1，1173±5cm^-1和1310±5cm^-1。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(4)中硫氰化钾的特征峰包括2115±5cm^-1。

本方面的一个实施方式中，所述步骤(4)中，当样品浓度在朗伯-比尔定律的工作范围内时，可以使用内标进行定量。样本拉曼谱图特征峰强度ix与内标物质特征峰强度ii之间的强度比r，可以计算为：

式中k1，k2为常量，cx和ci分别为样品和内标物质的浓度。

本发明的第二个目的是将上述方法应用于赤藓红痕的量检测中。

本发明的第三个目的是提供一种测量食品或化妆品中赤藓红的方法，所述方法是利用权利要求1-5任一所述方法。

本方面的一个实施方式中，所述食品包括红酒、鸡尾酒、糖果等。

本方面的一个实施方式中，所述化妆品包括口红、脂粉等。

本发明的有益效果：

本发明将表面增强拉曼技术与内标法相结合，检测极低浓度的赤藓红，既将低浓度的赤藓红的拉曼信号进行了放大，又引入内标法减少了利用拉曼光谱技术进行定量检测时出现的光源的不稳定性、背景噪声和“自吸收”效应对检测正确性的影响，建立了峰值比与赤藓红浓度的线性关系。本发明建立的检测赤藓红的方法检测灵敏，线性关系模型的线性较好，赤藓红三种特征峰的线性系数分别可达0.91，0.95和0.95，可以检测极低的赤藓红浓度，检测范围可达0.4mg/l～20mg/l，操作简单、成本低、具有较好的工业适应性。

附图说明

图1为测量赤藓红浓度的流程图；

图2为表面增强拉曼基底在过滤和纯化过程中的吸收光谱；

图3为不同浓度结晶紫的平均表面增强拉曼散射光谱(样品数为10)；

图4为赤藓红和硫氰酸钾溶液(内标物)的平均表面增强拉曼散射光谱(n＝10)；

图5为混合溶液的表面增强拉曼散射光谱；

图6为三种特征峰下各赤藓红浓度和相对强度的线性拟合图；

图7为特征峰1092cm^-1下赤藓红浓度和相对峰面积的线性拟合图；

图8为特征峰1173cm^-1下赤藓红浓度和相对峰面积的线性拟合图；

图9为特征峰1310cm^-1下赤藓红浓度和相对峰面积的线性拟合图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施1：

(1)制作表面增强拉曼基底：

将35ml柠檬酸钠溶液(400g/l)和25ml硫酸亚铁溶液(400g/l)均匀混合以制备还原液，然后在400r/min的速度下机械搅拌，将还原液以12ml/min的速率滴加到25ml硝酸银溶液(100g/l)中，反应后，得到反应混合物；

将反应混合物以3500rpm离心5分钟，除去上层液体，将20ml去离子水加入到底层沉淀的纳米银颗粒中，通过超声震荡将纳米银均匀地分散到悬浮液中，最后将混合物再次离心，然后将10ml柠檬酸钠溶液(400g/l)加入底层并超声处理，然后再次离心，该过程重复两次，将合成的沉淀物储存在20ml去离子水中用于进一步表征；

用洗涤剂清洁1mm厚的普通磨砂玻璃(2mm×2.5mm)，并用去离子水和乙醇冲洗，用移液管将纳米银胶体滴加在玻璃上，然后在氮气氛中干燥；

对表面增强拉曼基底进行表征，测量其在洗涤过程中的稳定性和制成后的增强效果。紫外-可见光谱(uv-vis)光谱用于表征过滤和纯化过程中银纳米粒子(agnps)的粒度变化。如图2，随着清洗次数的增加，紫外-可见光谱特征吸收峰变的更窄，更高，显示银纳米粒子的纯度越来越高。吸收峰在406nm处保持稳定，表明银纳米颗粒的尺寸分布相对稳定并且未发生聚集或生长。如图3，拉曼指示剂结晶紫通常用于表面增强拉曼散射测量，以验证基板的增强。结果表明，基板产生显着的拉曼增强。

(2)配制混合溶液：

配制混合溶液，每份混合溶液制均含有相同浓度的硫氰化钾(200mg/l)，含有不同浓度的赤藓红，浓度分别为20，10，8，6，4，2，1，0.8，0.6，0.4，0.2mg/l，将样品液滴在基板上，并用拉曼显微镜进行测量。

(3)使用表面增强拉曼散射基板检测混合溶液，如图4所示，硫氰酸钾的表面增强拉曼散射光谱只有一个强拉曼峰，并且没有干扰赤藓红的特征谱带，它证实了硫氰化钾可以作为检测赤藓红浓度的内标。

选取赤藓红的特征峰，分别为1092，1173和1310cm^-1，硫氰化钾的特征峰为2115cm^-1，图5是0.2mg/l-20mg/l浓度的混合溶液的表面增强拉曼散射光谱，其中0.2mg/l-0.8mg/l如图5中右侧放大图所示，随着赤藓红浓度的降低，特征峰(1092，1173和1310cm^-1)的相对强度逐渐降低，表明拉曼峰强度与赤藓红浓度成正比。将两种物质特征峰的峰强度作比值，图6显示了3组拉曼峰比值与赤藓红浓度关系。结果表明，3组拉曼峰比值与赤藓红的浓度具有良好的线性关系。测定系数达到0.91,0.95和0.95，为0.4mg/l～20mg/l范围内的赤藓红的定量检测提供了依据。

对比例1：

以峰面积比作为测试样品的线性相关因素：

(1)制作表面增强拉曼基底：

将35ml柠檬酸钠溶液(400g/l)和25ml硫酸亚铁溶液(400g/l)均匀混合以制备还原液，然后在400r/min的速度下机械搅拌，将还原液以12ml/min的速率滴加到25ml硝酸银溶液(100g/l)中，反应后，得到反应混合物；

将反应混合物以3500rpm离心5分钟，除去上层液体，将20ml去离子水加入到底层沉淀的纳米银颗粒中，通过超声震荡将纳米银均匀地分散到悬浮液中，最后将混合物再次离心，然后将10ml柠檬酸钠溶液(400g/l)加入底层并超声处理，然后再次离心，该过程重复两次，将合成的沉淀物储存在20ml去离子水中用于进一步表征；

用洗涤剂清洁1mm厚的普通磨砂玻璃(2mm×2.5mm)，并用去离子水和乙醇冲洗，用移液管将纳米银胶体滴加在玻璃上，然后在氮气氛中干燥，得到银纳米基底。

(2)配制混合溶液：

配制混合溶液，每份混合溶液制均含有相同浓度的硫氰化钾(200mg/l)，含有不同浓度的赤藓红，浓度分别为20，10，8，6，4，2，1，0.8，0.6，0.4，0.2mg/l，将样品液滴在基板上，并用拉曼显微镜进行测量。

(3)使用表面增强拉曼散射基板检测混合溶液，如图4所示，硫氰酸钾的表面增强拉曼散射光谱只有一个强拉曼峰，并且没有干扰赤藓红的特征谱带，它证实了硫氰酸钾可以作为检测赤藓红浓度的内标。

选取赤藓红的特征峰，分别为1092，1173和1310cm^-1，硫氰化钾的特征峰为2115cm^-1，将两个物质特征峰的峰面积作比值，与赤藓红的浓度建立关系模型，三种特征峰的线性拟合结果分别如图7、8、9所示，线性系数r²分别为0.77，0.66和0.85，都不超过0.9，线性较差，检测结果准确性不高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。