一种食品中溴代阻燃剂含量的检测方法与流程

本发明属于分析化学、食品安全领域，具体涉及一种食品中溴代阻燃剂含量的检测方法。
背景技术：
溴代阻燃剂(brominatedflameretardants，bfrs)是一类含溴有机阻燃剂，由于其添加量小，阻燃效果好等优点，广泛应用于电子电器、塑料、泡沫、家具、装饰和纤维制品等。多溴联苯醚(pbdes)是一类常用的添加型溴代阻燃剂，常用的商业品主要有五溴联苯醚(penta-bde)、八溴联苯醚(octa-bde)和十溴联苯醚(deca-bde)。由于pbdes在环境中持久性、生物富集性和可能的生物毒性，甚至致癌性，在欧盟和北美五溴联苯醚、八溴联苯醚和十溴联苯醚商业品已被禁用，我国于2018年1月禁用十溴联苯醚。为了满足防火和安全规定，将十溴联苯醚乙烷(dbdpe)作为deca-bde的替代品，由于它们结构相似，均是具有较强的亲脂疏水性，易于富积在脂肪含量高的动物组织或器官中。随着人们对动物源食品需求量的增加，近10年来，已有较多报道在鱼肉、水产品等生物样品中pbdes残留量的检测技术和方法。例如专利申请号为201610974088.6公开了定量分析水产品十溴二苯乙烷气相色谱与质谱联用的方法，即是用索式提取与凝胶渗透色谱-氧化铝-硅胶复合柱净化联合技术处理水产品，具体包括一、样品干燥粉碎；二、加入250ml丙酮和正己烷(体积比1:1)混合液索氏提取48h，三、凝胶渗透色谱柱净化；四、氧化铝-硅胶复合层析柱净化；五、仪器分析溶剂定容，经膜过滤后，gc-nci-ms定量分析。该发明样品提取效率高，但该方法提取时间长，增加了dbdpe和bde209等高溴代物发生分解的风险。2011年10月海洋环境科学公开了《海洋生物样品中多溴联苯醚和多溴联苯的分析方法》，采用超声提取，提取液经酸性硅胶、中性硅胶层析柱净化联合气相色谱-负离子化学源(nci)/质谱法分析各种鱼和贝类中bde-47、bde-99、bde-100、bde-153和bde154共5种多溴联苯(醚)残留，但对高溴代bde209和dbdpe未进行分析。总之上述方法样品前处理时间长或者提取不彻底等。微波辅助萃取是一种省时、省溶剂、自动化操作的萃取技术。微波辅助萃取已经广泛应用于土壤或沉积物等固体基质中多溴联苯醚的提取，但对于禽蛋类等食品中pbdes残留的微波萃取的研究报道较少，因此建立此方面的测定方法意义重大。另外，禽蛋中含有较高的蛋白质和脂肪，对基线干扰较大，需要净化处理后才能进仪器分析，传统的净化方法有浓硫酸除脂肪和凝胶渗透色谱柱、固相萃取柱净化联合技术，该法脂肪去除量大，但需要更多步地萃取、过滤和转换溶剂，增加了目标物的损失和实验的强度。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种食品中溴代阻燃剂含量的检测方法，该检测方法的检出限提高，实验人员的工作强度降低。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：一种食品中溴代阻燃剂含量的检测方法，包括如下步骤：(1)将食品进行微波辅助萃取，离心收集上清液，将所述的上清液浓缩得到提取液；(2)将所述的提取液通过复合柱，洗脱并收集洗脱液；(3)采用柱长8～15m、内径0.1～0.25mm、液膜厚0.10～0.25μm的毛细管柱，结合gc-nci-ms选择离子模式对所述的洗脱液进行检测，采用外标法进行定量计算所述的溴代阻燃剂的含量。目前关于多溴联苯醚和十溴二苯乙烷检测仪器常用气质联用仪一般有ei源和nci源两种离子源，但nci源相对于ei源来说，具有更高的灵敏度，能够满足一些食品和蔬菜等样品中痕量水平的检测。常用短柱长、薄膜厚的色谱柱，能有效阻止高分子化合物的降解。本发明的具体实施方式利用了15m长，0.25mm内径，0.10μm膜厚的高温毛细管柱(db-5ht)，有效减少了分析时间，总运行时间不超过30min。优选地，步骤(1)中，先将所述的食品进行冷冻干燥，然后研磨成粉末，再进行所述的微波辅助萃取。本发明中，所述的食品包括禽蛋、咸蛋、卤蛋或松花蛋。当所述的食品为禽蛋时，将禽蛋表面洗净、晾干，去壳，将蛋黄和蛋清混匀，先在-15～-25℃下冷冻成固体，然后置于冻干机中，在-50～-55℃下真空冷冻干燥20～30h，研磨成粉末，再进行所述的微波辅助萃取；或者，准确称取冷冻干燥后的样品，加入无水硫酸钠，充分研磨成粉末状，在进行所述的微波辅助萃取。优选地，步骤(1)中，取1～2g食品研磨成的粉末或者1～2g冷冻干燥后的样品进行所述的微波辅助萃取。优选地，步骤(1)中，进行所述的微波辅助萃取时，采用的提取剂为有机溶剂，所述的提取剂的添加体积为微波萃取管体积的0.2～0.35，提取温度为100～110℃。进一步优选地，所述的提取剂为体积比为1:0.85～1.25的正己烷和丙酮的混合溶剂，或者体积比为1:1.25～1.75的正己烷和二氯甲烷的混合溶剂。进一步优选地，所述的微波萃取管的体积为60～150ml。本发明通过对微波辅助萃取的提取剂种类、提取剂的体积、提取温度的优化，使得对多种溴代阻燃剂获得较好的回收率。优选地，步骤(1)中，离心收集上清液，将所述的上清液浓缩得到提取液的具体方法为：采用3500～4000rpm离心5～10min，转移上清液，为避免粘附在微波萃取管内壁上的残留，加入正己烷冲洗微波萃取管内壁，3500～4000rpm离心5～10min，合并上清液，将上清液用旋转蒸发仪浓缩至尽干，用正己烷重溶得到所述的提取液。进一步优选地，加入5～10ml正己烷冲洗微波萃取管内壁。进一步优选地，用1.0～2.0ml正己烷重溶。优选地，步骤(2)中，所述的复合柱中自下而上依次填充有脱脂棉或玻璃棉、中性氧化铝、中性硅胶、酸性硅胶、碱性硅胶和无水硫酸钠，其中，所述的中性氧化铝、所述的中性硅胶、所述的酸性硅胶、所述的碱性硅胶和所述的无水硫酸钠的装填质量比为1:0.9～1.1:1～2.5:0.9～1.1:0.4～0.6。本发明将氧化铝-硅胶复合层析柱净化技术联合微波萃取技术作为禽蛋中pbdes和dbdpe残留分析的前处理，本发明将提取液低流速上样，使提取液与颗粒材料充分接触，有效去除脂肪和大分子化合物等污染物，克服了浓硫酸除脂肪的繁琐步骤和商品化小柱净化不彻底的问题，克服了分散固相吸附材料的分散、难回收额问题。此法用于禽蛋中痕量溴代阻燃剂残留检测中，能够获得较好的回收率和满足检测的检出限要求。进一步优选地，所述的酸性硅胶由质量比为1:0.7～0.9的中性硅胶和浓硫酸配制而成。进一步优选地，所述的碱性硅胶由质量比为1:0.4～0.5的中性硅胶和0.4～0.6mol/l氢氧化钾甲醇溶液搅拌均匀后，甲醇挥发干后制得。进一步优选地，根据提取液中脂肪含量高低，增减酸性硅胶用量，当提取液中脂肪含量高时，增加酸性硅胶用量。进一步优选地，所述的脱脂棉或玻璃棉、所述的中性氧化铝的装填质量比为0.25～0.75:1。优选地，步骤(2)的具体操作方法为：依次用二氯甲烷和正己烷对所述的复合柱进行活化，然后将所述的提取液上样，用体积比为1:0.9～1.1的正己烷和二氯甲烷的混合溶剂以1～2ml/min的流速洗脱目标物并收集于试管中，氮吹至干，用异辛烷溶解混匀得到所述的洗脱液。进一步优选地，依次用8～12ml二氯甲烷和8～12ml正己烷对所述的复合柱进行活化。进一步优选地，所述的提取液的上样量为1～2ml。进一步优选地，所述的混合溶剂的使用量为30～50ml。进一步优选地，所述的异辛烷的使用量为90～110μl。优选地，步骤(3)中，采用不分流进样，进样量1.0μl；流量：1.0～1.5mlmin-1；进样口温度为280℃；程序升温：初始温度100℃，保持1min，以30℃min-1升温至240℃，保持1min，再以5℃min-1升温到300℃，保持10min。优选地，步骤(3)中，反应气体为甲烷气；选择离子扫描模式；em电压1100～1300v；离子源压力为2.04×10-4torr；接口温度280～300℃；四级杆和离子源温度均为150℃。进一步优选地，步骤(3)中，载气为氦气。更为优选地，氦气的纯度≥99.999％。优选地，所述的溴代阻燃剂包括bde-28、bde-47、bde-99、bde-100、bde-153、bde-154、bde-183、bde-203、bde-206、bde-207、bde-208、bde-209、dbdpe、多溴联苯醚的同系物中的一种或多种。进一步地，本发明能够方便、快捷、准确、高效地同时检测bde-28、bde-47、bde-99、bde-100、bde-153、bde-154、bde-183、bde-203、bde-206、bde-207、bde-208、bde-209、dbdpe等13种溴代阻燃剂的残留，为人体饮食暴露和食品安全监管提供可靠、快速的检测方法。进一步优选地，bde-28、bde-47、bde-99、bde-100、bde-153、bde-154、bde-183、bde-203、bde-206、bde-207、bde-208、dbdpe的扫描离子或定量离子质荷比(m/z)为78.9和80.9；bde-209的扫描离子或定量离子质荷比(m/z)为78.9、80.9、486.4和488.4，13c-bde-209的扫描离子或定量离子质荷比(m/z)为494和496。禽蛋中bfrs的残留处于痕量水平(仅有几个pg/g)，为了消除实验器皿和使用药品等的干扰，对实验过程所使用的器皿和药品的处理，其操作如下：实验过程所有玻璃器皿洗过之后，经马弗炉450℃烘烤12h消除潜在的有机物残留，使用前用丙酮和二氯甲烷淋洗。使用前后用丙酮、二氯甲烷和正己烷依次超声清洗。中性氧化铝(100～200目)、中性硅胶(80～100目)、无水硫酸钠使用之前，用二氯甲烷抽提48h，晾干后分别于180℃、140℃和450℃烘烤24h。冷却至室温后，取56g已烘烤硅胶加入44g浓硫酸，搅拌1.0h，直至混匀配成酸性硅胶，装入棕色带磨口盖的试剂瓶，放入干燥器中静置6h后可用。取70g已烘烤硅胶，加入30g0.5mol/l氢氧化钾甲醇溶液，搅拌均匀，甲醇挥发干后稳定24h，配成碱性硅胶备用。由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明与以往的方法比较，具有简单、快速、准确和高效的特点，样品的最低检出险、回收率和重复性的试验结果均满足禽蛋等食品中多种bfrs残留量的检测。本发明采用微波辅助提取，克服了传统的索氏抽提的溶剂用量大和超声提取的回收率不高的问题，在一定温度和压力下的微波辅助萃取，使得溶剂与基质接触更加充分，提高了提取效率，减少了分析时间。本发明采用气相色谱-负化学源-质谱仪的选择离子监测模式，克服了电子轰击离子源灵敏度低的问题，提高了方法的检出限。附图说明图1为13种溴代阻燃剂的总离子流图，附图说明1：bde28；2：bde47；3：bde100；4：bde99；5：bde154；6：bde153；7：bde183；8：bde203；9：bde208；10:bde207；11：bde206；12：bde209；13：dbdpe；1-7的浓度为2μg/l；8-11的浓度为10μg/l；bde209为20μg/l；dbdpe为100μg/l。图2为实施例3中采用不同质量的酸性硅胶进行净化的色谱对比图，其中，(a)为酸性硅胶用量为2g；(b)为酸性硅胶用量为5g。图3不同种类提取剂下13种目标物的回收率效果图。图4不同提取剂体积下13种目标物的回收率效果图。图5不同微波萃取温度下13种目标物的回收率效果图。具体实施方式下面采用具体实施方式对本发明的技术方案进一步详细说明。下述实施例中的中性氧化铝、中性硅胶、无水硫酸钠、酸性硅胶、碱性硅胶采用如下方法处理得到:将中性氧化铝(100～200目)、中性硅胶(80～100目)、无水硫酸钠用二氯甲烷抽提48h，晾干后分别于180℃、140℃和450℃烘烤24h。冷却至室温后，取56g已烘烤硅胶加入44g浓硫酸，搅拌1.0h，直至混匀配成酸性硅胶，装入棕色带磨口盖的试剂瓶，放入干燥器中静置6h后备用。取70g已烘烤硅胶，加入30g0.5mol/l氢氧化钾甲醇溶液，搅拌均匀，甲醇挥发干后稳定24h，配成碱性硅胶备用。实施例1本实施例着重对13种溴代阻燃剂进行了gc-nci-ms分析，确保定性定量的准确性。步骤一：用从百灵威科技公司购买型号为bde-csm的pbde8混标、bde-203、bde-206、bde-207、bde-208和dbdpe单标，浓度为1000mg/l，利用色谱级异辛烷配制成pbdes(低溴代bde：bde-28、bde-47、bde-99、bde-100、bde-153、bde-154、bde-183)标准工作曲线浓度为0.5、1.0、5.0、10.0和50.0μg/l，高溴代-bde(bde-203、bde-206、bde-207、bde-208)标准工作曲线浓度为1.0、5.0、10.0、50.0和100.0μg/l，bde209和dbdpe标准工作曲线浓度为5.0、10.0、50.0、100.0和500.0μg/l的混合标准工作溶液。步骤二：设定气相色谱-质谱条件：选择db-5ht毛细管色谱柱(15m×0.25mmi.d.,0.10μm,agilent公司)；不分流进样，进样量1.0μl；流量：1.0mlmin-1；进样口温度为280℃；程序升温：初始温度100℃，保持1min，以30℃min-1升温至240℃，保持1min，再以5℃min-1升温到300℃，保持10min；共运行28.67min。反应气体为高纯甲烷气；高纯氦气(≥99.999％)为载气，溶剂延迟5min，nci四级杆和离子源温度均为150℃，接口温度280℃；em电压1200v；离子源压力为2.04×10-4torr；离子扫描方式为选择离子扫描(sim)；bde-28、bde-47、bde-99、bde-100、bde-153、bde-154、bde-183、bde-203、bde-206、bde-207、bde-208和dbdpe扫描离子或定量离子质荷比m/z为78.9和80.9，bde-209的m/z为78.9、80.9、486.4和488.4，13c-bde-209为494/496。步骤三：依据保留时间和峰面积进行定性定量分析。如图1所示，28.6min内对13种多溴联苯醚可完全分离，信号灵敏度高，峰形较好。步骤四：以目标物的浓度为横坐标x，对应定量离子峰面积为纵坐标y，进行线性回归分析。结果见表1，所有目标物在对应的浓度下浓度与响应值之间有良好的线性关系，相关系数(r)不低于0.99，满足定量分析的要求。表1目标物的保留时间、线性范围、回归方程和相关系数r目标物保留时间/min线性范围/μg/l线性回归方程相关系数bde-2810.460.5～50y＝856.7x-280.30.9998bde-4712.970.5～50y＝748.9x-348.20.9996bde-10014.780.5～50y＝761x-335.40.9996bde-9915.300.5～50y＝670.5x-310.80.9996bde-15416.730.5～50y＝589.9x-338.60.9987bde-15317.530.5～50y＝556.2x-333.40.9994bde-18319.410.5～50y＝319.8x-166.00.9993bde-20321.821-100y＝223.4x-14670.9954bde-20823.861～100y＝16.13x-50.910.9993bde-20723.981～100y＝26.66x-918.70.9963bde-20624.481～100y＝26.58x-195.10.9951bde-20926.7950～5000y＝411.1x-584.60.9970dbdpe28.0250～5000y＝11.49x-879.90.9978实施例2：本实施例着重于禽蛋中13种溴代阻燃剂的微波辅助萃取，并对微波辅助萃取的条件进行优化。步骤一：将鸡蛋表面洗净、晾干，去壳，将蛋黄和蛋清混匀，先在-20℃下冷冻成固体，然后置于冻干机中，在-55℃下真空冷冻干燥24h，研磨成粉末，将1.0g蛋类样品，加5.0g无水硫酸钠混匀，完全转移到100ml聚四氟乙烯提取管，加13种待测物标准样品(50ng/g)，震荡混匀，平衡3h。步骤二：分别向步骤一的聚四氟乙烯提取管中加入30ml正己烷/丙酮(1/1，v/v)混合液、正己烷：丙酮(体积比，2:3)混合液、正己烷：丙酮(体积比，3:2)混合液、正己烷：二氯甲烷(体积比，2:3)混合液和正己烷：水(体积比，2:3)混合液，于110℃微波提取20min，冷却至室温，4000rpm离心5min，转移上清液，用5ml正己烷冲洗提取管内壁，4000rpm离心5min，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩至干，用1.5ml正己烷重溶，后续净化。步骤三：分别向步骤一的聚四氟乙烯提取管中加入30ml、10ml、20ml和40ml正己烷/丙酮(1/1，v/v)混合液，于110℃微波提取20min，冷却至室温，4000rpm离心5min，转移上清液，用5ml正己烷冲洗提取管内壁，4000rpm离心5min，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩至干，用1.5ml正己烷重溶，后续净化。步骤四：向步骤一的聚四氟乙烯提取管中加入30ml正己烷/丙酮(1/1，v/v)混合液，分别于110℃、80℃、90℃、100℃和120℃微波提取20min，冷却至室温，4000rpm离心5min，转移上清液，用5ml正己烷冲洗提取管内壁，4000rpm离心5min，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩至干，用1.5ml正己烷重溶，后续净化。步骤五：分别将步骤二、步骤三、步骤四的萃取液采用4000rpm离心5min，转移上清液，为避免粘附在微波萃取管内壁上的残留，加入5ml正己烷冲洗微波萃取管内壁，4000rpm离心5min，合并上清液，将上清液用旋转蒸发仪浓缩至尽干，用1.0ml正己烷重溶，后续净化。步骤六：在100mm长的玻璃层析柱(10mmi.d.)中自下至上依次填充1g脱脂棉或玻璃棉、2g中性氧化铝、2g中性硅胶、2g酸性硅胶、2g碱性硅胶和1g无水硫酸钠。先后用10ml二氯甲烷和10ml正己烷活化，步骤五处理得到的提取液(约1.5ml)上样，用30ml正己烷/二氯甲烷(1:1v/v)以1.0ml/min的流速洗脱目标物并收集于试管中，氮吹仪氮吹至干，用100μl异辛烷定容，加内插管，装瓶待分析。以上微波萃取优化结果见图3-图5，其中，图3为步骤二处理后的结果图；图4为步骤三处理后的结果图；图5为步骤四处理后的结果图。正己烷：二氯甲烷也具有较高回收率，但考虑到二氯甲烷的毒性，选择正己烷和丙酮(体积比1：1)混合液；提取体积为40ml微波萃取过程中，高温和高压会让萃取液有液态转变为气态，而剩余空间较少，会使得萃取管内气压过大，引起泄露，因此选择30ml为最佳结果；萃取温度为120℃时一些高溴代-bdes发生部分降解，因此选择在110℃为最佳萃取温度。实施例3本实施例着重于禽蛋中13种溴代阻燃剂前处理技术，根据实际样品脂肪含量选择酸性硅胶的比例。由于鸭蛋的脂肪含量相对高于鸡蛋，提高净化效果，增加酸性硅胶用量。步骤一：从某电子拆解集中区农户家，购买家养鸭蛋，放入冰盒后带回实验室，去蛋壳，放入不锈钢碗用玻璃棒将蛋白与蛋黄搅拌均匀，-20℃冷冻成固态，利用冻干机冷冻干燥，准确称取2.0g样品，加适量无水硫酸钠，研磨均匀。完全转移至微波萃取管，加30ml正己烷/丙酮(50/50,v/v)混合液，于110℃微波萃取20min，冷却到室温，于4000r/min离心5min，上清液转移至250ml圆底烧瓶，在35±2℃的温度下旋转蒸发至1.0ml。步骤二：将1g脱脂棉、2g中性氧化铝、2g中性硅胶、5g酸性硅胶、2g碱性硅胶和1g无水硫酸钠按照从下至上顺序装好，依次用10ml二氯甲烷和10ml正己烷活化。以0.5ml/min流速上样，用30ml正己烷/二氯甲烷(50/50,v/v)洗脱，收集洗脱液，于35±2℃的温度下，氮吹至干。加内标，用100μl异辛烷定容，过0.22μm滤膜。步骤三：将脱脂棉、2g中性氧化铝、2g中性硅胶、2g酸性硅胶、2g碱性硅胶和1g无水硫酸钠按照从下至上顺序装好，依次用10ml二氯甲烷和10ml正己烷活化。以0.5ml/min流速上样。用30ml正己烷/二氯甲烷(体积比1:1)混合液洗脱，收集洗脱液，于35±2℃的温度下，氮吹至干。加入100μl异辛烷震荡溶解，过0.22μm有机滤膜，加进样内标。使用2.0g(a)和5.0g(b)酸性硅胶净化后的色谱图见图2。实施例4本实施例着重于本方法的准确度和精密度。步骤一：从某菜市场购买到鲜草鸡蛋，放入冰盒带回实验室，去壳，将蛋黄和蛋白混匀，-20℃冷冻成固态，利用冻干机冷冻干燥，样品研磨均匀后，利用正己烷和丙酮混合液(体积比1:1)对鸡蛋样品进行多次提取，直至提取液中无目标物检出，此时的鸡蛋样品作为空白基质(未检出，残留量均小于lod)。步骤二：加入7种低溴pbdes(bd-28、bde-47、bde-100、bde-99、bde-154、bde-153和bde-183)浓度分别为50、100和200ng/g；4种高溴pbdes(bde-203、bde-208、bde-207、bde-206)浓度分别为100、200和400ng/g；bde-209和dbdpe的浓度分别为500、1000和2000ng/g(每克鸡蛋(干重))，平衡3h，做基质加标回收实验，每组平行做6次。步骤三：后续步骤按照实施例1和实施例2最优条件进行分析。空白样品的测定值、加标回收率、标准偏差和检出限见表2，空白样品中有少量的bde-47、bde-99和bde-209检出，但其含量均低于样品的3％，pbdes和dbdpe平均回收率在84.3％～121.5％之间和在72.8％～86.8％之间。平行测定6次，目标物的相对标准偏差(rsd)均小于20％。方法定量限mloq定义为目标峰的信号与噪声比的10倍，这是信号对应的最小浓度，方法检出限mlod定义为3倍的信噪比时对应浓度。本发明中以干重1.0g蛋类样品，定容体积100μl计，计算目标物的方法检出限。12种pbdes和dbdpe的方法检出限在0.01～0.38ng/g之间。具体目标化合物的回收率、相对标准偏差和检出限见表2。表2目标物的加标回收率、标准偏差和检出限(n＝6)以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12