有核红细胞模拟粒子及其制备方法与应用与流程

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种有核红细胞模拟粒子及其制备方法与应用。

背景技术：

正常的人的成熟红细胞不含有细胞核，主要成分是蛋白质和铁，具备运输氧的能力，有核红细胞属于红细胞发育过程中的初始幼稚状态，一般存在于骨髓中，但一些病理情况下，外周血内也会出现有核红细胞(nrbc)，对人体血液中有核红细胞的检测，可以为一些疾病的诊断提供依据。

其临床意义如下：

1、增生性贫血：最常见于各种贫血，急性失血性贫血、巨幼红细胞性贫血、严重的低色素性贫血；以出现晚幼红细胞或中幼红细胞为多见；外周血中出现有核红细胞表示骨髓中红细胞系增生明显活跃；

2、红血病、红白血病：骨髓中幼稚红细胞异常增生并释放入血，以原红细胞、早幼红细胞为多见；

3、髓外造血：骨髓纤维化时，脾、肝、淋巴结等组织恢复胚胎时期的造血功能，这些组织因缺乏对血细胞释放的调控能力，幼稚血细胞大量进入外周血；各发育阶段的幼红细胞都可见到，并可见到幼稚粒细胞及巨核细胞；

4、其他：如骨髓转移癌、严重缺氧等。

目前，越来越多的血细胞分析仪具有检测有核红细胞的功能，为了保证测值的准确性，需对其进行质量控制，即使用含有有核红细胞模拟粒子的质控品进行检测。

美国专利us5559037(kim等人)公开了一种用于有核红细胞和白细胞的流式细胞计数分析的方法。该方法使用了荧光、低角度光散射和轴光损失测量法，以便从白色血样中分辨出nrbc。美国专利us5879900(kim等人)进一步地公开了一种辨别nrbc、白细胞和受损白细胞的方法，以及通过流式细胞仪提供血液样品中的白细胞差别的方法，这种方法的缺点是准确性不高。

美国专利us7176031和us6962817公开了使用人工合成粒子模拟人有核红细胞的方法。这种方法的缺陷在于合成粒子的生产工艺复杂，成本较高。美国专利us7354767公开了使用普通哺乳动物红细胞(不含细胞核)制备有核红细胞模拟粒子的方法。这种方法制备的模拟粒子与人有核红细胞的细胞核大小接近，适用于采用阻抗法检测有核红细胞的血液细胞分析仪。但这种模拟粒子不含细胞核，不适于模拟人有核红细胞被特定荧光染料染色后的荧光特性。美国专利us7195919公开的技术方案通过在红细胞表面连接生物大分子(如：核酸、肤链等)，使其能够模拟人有核红细胞的荧光特性。这种方法的不足之处在于工艺复杂，且作为原料的生物大分子成本较高。

美国专利us6723563和us6653137提出用鸟类(如火鸡或鸡)、爬行类(如短吻鳄)或鱼类(如蛙鱼)的红细胞为原料制备有核红细胞模拟粒子。美国专利us6406915、us6403377、us6399388、us6221668和us6200500公开了使用火鸡红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利us6448085公开了使用鸡红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利us6187590和us5858790公开了使用火鸡、鸡和蛙蹲类鱼的红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。美国专利us7285417、us7135341和us7198953公开了使用短吻鳄红细胞制备有核红细胞模拟粒子的方法。这些技术方案的共同点是：使用带有细胞核的动物红细胞，包括鸟类、爬行类和鱼类的红细胞模拟人有核红细胞。这种方法的不足之处在于，绝大多数鸟类、爬行类和鱼类的红细胞呈椭圆形，与近圆形的人类有核红细胞形态差异较大。因此在某些情况下，这些动物有核红细胞并不能很好的模拟人有核红细胞的特征。例如，运用流式细胞术对细胞进行检测时，椭圆形细胞通过流动室方向不一致，因而产生大小差异很大的前向散射光信号，而圆形或近圆形细胞则不会出现这种状况。

由此可见，现有技术中制备有核红细胞模拟粒子的方法均具有一定的缺点，亟需一种工艺简单、产率高、产物稳定性好的有核红细胞模拟粒子的制备方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是如何提供一种工艺简单、产率高、产物稳定性好的有核红细胞模拟粒子的制备方法，并提供该方法制备的有核红细胞模拟粒子作为以荧光-散射光法为检测原理的细胞血液分析仪的质控物的应用。

本发明实现上述目的采取的技术方案如下。

有核红细胞模拟粒子的制备方法，步骤如下：

步骤一、分离并洗涤红细胞，得到纯化红细胞；

步骤二、用稀释液稀释纯化红细胞，加入加载剂，在脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内；

所述加载剂为人工合成的dna或rna片段，加载剂的添加量大于1.5μg/l且在3.0μg/l以内；

步骤三、向引入加载剂后的细胞中加入细胞固定液，18-28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到有核红细胞模拟粒子。

优选的是，所述步骤一中，红细胞为人红细胞或者mcv与人红细胞类似的哺乳动物红细胞。

优选的是，所述步骤二中，用稀释液稀释纯化红细胞至10^12-10¹⁴个/l。

优选的是，所述步骤二中，稀释液的ph值为7.1-7.5，由atp、mgcl2、kh2po4、nahco3、葡萄糖和水组成，atp的浓度为0.1％-1.0％，mgcl2的浓度为0.1％-0.5％，kh2po4浓度为0.5％-3.0％，nahco3浓度为0.05％-0.3％，葡萄糖的浓度0.01％-0.1％。

优选的是，所述步骤二中，将脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内的过程为：电穿孔仪器90-120v电压刺激4-8秒钟。

优选的是，所述步骤一和步骤三中，洗涤采用的洗涤剂包括缓冲液、防腐剂、无机盐和水。

优选的是，所述步骤三中，细胞固定液包括固定剂、缓冲液、乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)、防腐剂和水；固定剂为甲醛、乙醛、戊二醛、多聚甲醛、甲醇、丙酮中的一种或多种；固定时间为3-5h。

优选的是，所述步骤三中，细胞保存液包括缓冲液、营养成分、防腐剂和水。

本发明还提供上述有核红细胞模拟粒子的制备方法制备的有核红细胞模拟粒子。

本发明还提供上述有核红细胞模拟粒子作为以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪的质控物的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的有核红细胞模拟粒子的制备方法，运用电脉冲刺激细胞的方式将核酸物质引入成熟红细胞内制备出有核红细胞模拟粒子，该模拟粒子制备步骤简单，所用试剂成分较单一，制得的产物产率较高，适合大量的生产。

附图说明

图1显示的是未经电脉冲刺激细胞引入核酸物质的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。

图2显示的是实施例1所制备的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。

图3显示的是实施例2所制备的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。

图4显示的是实施例3所制备的有核红细胞模拟粒子，与成熟红细胞模拟物按质量比1:4混合配制血液分析仪用的全血质控物，在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供有核红细胞通道)。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明的有核红细胞模拟粒子的制备方法，先分离并洗涤红细胞，得到纯化红细胞；然后将纯化红细胞加入稀释液中，加入加载剂，经脉冲电场的作用将加载剂导入到纯化红细胞内，最后向引入加载剂后的细胞中加入细胞固定液，18-28℃固定，洗涤细胞，用细胞保存液保存，得到有核红细胞模拟粒子。

上述技术方案中，红细胞可以是人的红细胞，也可以是mcv值与人接近的哺乳动物的红细胞，以新鲜血液制备本发明中的模拟物效果更佳。分离方法是通过离心、洗涤、过滤的方式去除血液样本中的白细胞和血小板，其中，过滤可以用白细胞滤器去除白细胞。

上述技术方案中，稀释液的ph值为7.1-7.5；稀释液由atp、mgcl2、kh2po4、nahco3、葡萄糖和水组成；atp的浓度为0.1％-1.0％；mgcl2的浓度为0.1％-0.5％；kh2po4浓度为0.5％-3.0％；nahco3浓度为0.05％-0.3％；葡萄糖的浓度0.01％-0.1％；一般稀释液稀释纯化红细胞至10¹²-10¹⁴个/l。

上述技术方案中，加载剂是人工合成的rna片段，加载剂的添加量大于1.5μg/l且在3.0μg/l以内。对人工合成的dna或rna片段的序列无特殊要求，可为任意序列的200-1000bp的片段；与之连接的表达载体选择使用pet-15b。具体可为：将序列1或序列2中所示的dna经人工合成后克隆到pet-15b载体内，扩增后提取并分离纯化表达载体，最后经酶切纯化后得到大量dna片段，即加载剂。

上述技术方案中，将脉冲电磁场的作用下将加载剂引入到纯化红细胞内的过程为：电穿孔仪器90-120v电压刺激4-8秒钟。

上述技术方案中，固定液的固定时间为3-5h。

上述技术方案中，细胞固定液、细胞保存液、对红细胞和产物进行洗涤处理时采用的洗涤剂，均为本领域常用物质，没有特殊限制。其中，洗涤剂为常规的等渗溶液，包括缓冲液、防腐剂、无机盐和水，细胞固定液包括固定剂、缓冲液、edta-2na、防腐剂和水，还可以包括营养物质；其中，固定剂为甲醛、乙醛、戊二醛、多聚甲醛、甲醇、丙酮中的一种或多种，每种固定剂的浓度为0.1-2.0ml/l。细胞保存液包括缓冲液、营养成分、防腐剂和水。上述技术方案中，防腐剂为proclin-150、proclin-200、proclin-300和proclin-500中的一种或两种；缓冲液为pbs缓冲液、d-hanks缓冲液、hepes缓冲液、柠檬酸缓冲液、氯化钠缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或多种；营养物质为葡萄糖、甘露醇、腺嘌呤等。常用的，洗涤剂由20.0g/l磷酸氢二钠、3.0g/l磷酸二氢钠、5.5g/l氯化钠、0.2g/lproclin-200和1l纯化水组成；细胞固定液由0.3-2.0ml/l乙醛、0.1-0.2ml/l戊二醛、2.0g/l磷酸二氢钠、0.15g/ledta-2na、8.0g/l葡萄糖、2.5g/l腺嘌呤、0.2g/lproclin-200和1l纯化水组成；细胞保存液由0.2-0.5/l柠檬酸、1.5-2.0g/l柠檬酸钠、1.0g/l磷酸二氢钠、8.0-15.0g/l葡萄糖、12.0g/l甘露醇、2.5g/l腺嘌呤、0.3g/lproclin-200和1l纯化水组成。

以下结合实施例进一步说明本发明，实施例中所采用的化学试剂为分析纯，可通过商购获得。

实施例1

有核红细胞模拟粒子的制备方法：将抗凝人全血放置离心机中，3000rpm离心10min，去除上清液，用洗涤剂清洗沉淀细胞，3000rpm离心10min，去除上清液，重复洗涤2-3次，用白细胞滤器除去白细胞，得到纯化红细胞。用稀释液1将纯化红细胞稀释至10¹²个/l，按照1.51μg/l加入加载剂1，电穿孔仪器100v电压刺激5秒钟，向电刺激后的纯化红细胞中加入细胞固定液1室温下固定3h。用洗涤剂重复洗涤反应产物3-4次，用细胞保存液1对产物进行悬浮，得到质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测，结果参见图2(仅提供有核红细胞通道图像)。

加载剂1：将序列1中所示的dna经人工合成后克隆到pet-15b载体内，扩增后提取并分离纯化表达载体，最后经酶切纯化后得到大量dna片段，即加载剂1。

洗涤剂：20.0g/l磷酸氢二钠、3.0g/l磷酸二氢钠、5.5g/l氯化钠、0.2g/lproclin-200、1l纯化水。

稀释液1：1.0g/l氯化镁、12.0g/l磷酸二氢钾、1.2g/l碳酸氢钠、5.0g/latp、0.4g/l葡萄糖、1l纯化水；ph值7.2。

细胞固定液1：2.0ml/l乙醛、0.1ml/l戊二醛、2.0g/l磷酸二氢钠、0.15g/ledta-2na、8.0g/l葡萄糖、2.5g/l腺嘌呤、0.2g/lproclin-200、1l纯化水。

细胞保存液1：0.2g/l柠檬酸、1.5g/l柠檬酸钠、1.0g/l磷酸二氢钠、8.0g/l葡萄糖、12.0g/l甘露醇、0.3g/lproclin-200、1l纯化水。

实施例2

有核红细胞模拟粒子的制备方法：将抗凝人全血放置离心机中，3000rpm离心10min，去除上清液，用洗涤剂清洗沉淀细胞，3000rpm离心10min，去除上清液，重复洗涤2-3次，用白细胞滤器除去白细胞，得到纯化红细胞。用稀释液2将纯化红细胞稀释至10¹²个/l，按照2.0μg/l加入加载剂2，电穿孔仪器100v电压刺激8秒钟，向电刺激后的纯化红细胞中加入细胞固定液2室温下固定4h。用洗涤剂重复洗涤反应产物3-4次，用细胞保存液2对产物进行悬浮，得到质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测，结果参见图3(仅提供有核红细胞通道图像)。

加载剂2：将序列2中所示的dna经人工合成后克隆到pet-15b载体内，扩增后提取并分离纯化表达载体，最后经酶切纯化后得到大量dna片段，即加载剂2。

洗涤剂：20.0g/l磷酸氢二钠、3.0g/l磷酸二氢钠、5.5g/l氯化钠、0.2g/lproclin-300、1l纯化水。

稀释液2：5.0g/l氯化镁、12.0g/l磷酸二氢钾、1.2g/l碳酸氢钠、8.0g/latp、0.6g/l葡萄糖、1l纯化水；ph值7.4。

细胞固定液2：0.5ml/l甲醛、0.1ml/l戊二醛、2.0g/l磷酸二氢钠、0.15g/ledta-2na、0.2g/lproclin-500、1l纯化水。

细胞保存液2：0.5g/l柠檬酸、2.0g/l柠檬酸钠、1.0g/l磷酸二氢钠、15.0g/l葡萄糖、2.5g/l腺嘌呤、0.3g/lproclin-300、1l纯化水。

实施例3

有核红细胞模拟粒子的制备方法：将所选的人抗凝全血放置离心机中，3000rpm离心10min，去除上清液，用洗涤剂清洗沉淀细胞，3000rpm离心10min，去除上清液，重复洗涤2-3次，用白细胞滤器除去白细胞，得到纯化红细胞。用稀释液3将纯化红细胞稀释至10¹²个/l，按照3.0μg/l加入加载剂1，电穿孔仪器100v电压刺激6秒钟，向电刺激后的纯化红细胞中加入细胞固定液3室温下固定5h。用洗涤剂重复洗涤反应产物3-4次，用细胞保存液3对产物进行悬浮，得到质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测，结果参见图4(仅提供有核红细胞通道图像)。

加载剂1：将序列1中所示的dna经人工合成后克隆到pet-15b载体内，扩增后提取并分离纯化表达载体，最后经酶切纯化后得到大量dna片段，即加载剂1。

洗涤剂：20.0g/l磷酸氢二钠、3.0g/l磷酸二氢钠、5.5g/l氯化钠、0.2g/lproclin-300、1l纯化水。

稀释液3：5.0g/l氯化镁、11.5.0g/l磷酸二氢钾、2.0g/l碳酸氢钠、10.0g/latp、1.0g/l葡萄糖、1l纯化水；ph值7.5。

细胞固定液3：0.3ml/l甲醛、0.2ml/l戊二醛、2.0g/l磷酸二氢钠、0.15g/ledta-2na、0.2g/lproclin-300、1l纯化水。

细胞保存液3：0.5g/l柠檬酸、2.0g/l柠檬酸钠、1.0g/l磷酸二氢钠、15.0g/l葡萄糖、0.3g/lproclin-300、1l纯化水。

由附图1-4可见，经过本发明各实施例制得的有核红细胞质控物在血液分析仪中检测分析，未加载核酸物质的模拟粒子在散点图上无法看到有核红细胞的部分，如图1所示；而经过电磁脉冲处理后的，在散点图上可以看到与成熟红细胞区、白细胞区具有明显界限的有核红细胞区，如图2至图4所示。综上可知，本发明的制备方法工艺简单、产率高、适合大批量生产，制得的有核红细胞模拟粒子作为以荧光-散射光法为检测原理的细胞血液分析仪的质控物的应用具有良好的前景。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>迪瑞医疗科技股份有限公司

<120>有核红细胞模拟粒子及其制备方法与应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>427

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cttggaagagaggcgggtcaaagaagtagtgaagaagcactctcagttcataggctatcc60

catcaccctttatttgaagaaggagcgagagaaggaaattagtggtgatgaggcagagga120

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