一种荧光碳纳米颗粒及检测Ni2+离子和甘氨酸的方法与流程

本发明涉及一种荧光碳纳米颗粒以及基于荧光碳纳米颗粒高灵敏检测ni²⁺离子及甘氨酸的荧光分析方法。

背景技术：

镍是人体必须微量元素之一，具有刺激血液生长的作用，能促进红细胞再生的作用。但是，过量的镍会对人体造成炎症、癌症、神经衰弱症、系统紊乱、降低生育能力、致畸和致突变等危害，故被认为是一种潜在的危害物。工业上镍主要用于不锈钢和抗腐蚀合金及催化剂制造等，由此而产生的过量排放也对大气、水体及土壤等环境造成了极大的污染。因此，对镍离子的高灵敏检测及实时监测具有非常重要的意义。

目前，水环境中镍离子检测的最普遍方法为原子吸收、电感耦合等离子发射光谱等，但这些方法的检测过程较为繁琐，仪器价格高昂，不适合样品的实时检测。此外，电化学方法也常被用于检测镍离子，但是方法本身的重现性较差。相比而言，荧光检测法具有灵敏度高、重现性好、分析快速等优势，已被广泛用于环境中金属离子的检测。但迄今为止，报道的用于检测镍离子的荧光探针亦存在一些缺陷，如合成过程复杂、响应灵敏度不高、生物及环境毒性大等。因此，构建一种可以简单合成、同时又能高灵敏检测镍离子的荧光探针是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题克服现有技术存在的缺陷，提供一种荧光碳纳米颗粒及检测ni²⁺离子和甘氨酸的方法，达到提高检测灵敏度的目的。

为解决以上技术问题，根据本发明的一个方面，提供一种荧光碳纳米颗粒的合成方法，将甲脒亚磺酸加入到乙二醇中，室温超声溶解，将得到的混合溶液转移到高压反应釜中，在200-250℃下加热反应2-3小时，反应结束后自然冷却至室温并加入超纯水，然后离心除去大的颗粒，随后以分子截留量1000的透析袋透析，所得水溶液通过旋转蒸发除去水分后得到所述的荧光碳纳米颗粒，将上述荧光碳纳米颗粒重新分散在超纯水中，保存备用。

本发明的另一方面，提供由上述合成方法得到的荧光碳纳米颗粒。该荧光碳纳米颗粒用于检测ni²⁺离子，或是在ni²⁺离子和甘氨酸共存体系中检测，能够获得高灵敏度的检测结果。

根据本发明的另一方面，提供一种检测ni²⁺离子的方法，包括步骤：

（1）配制不同浓度的ni²⁺离子溶液；

（2）将具有不同浓度的ni²⁺离子溶液加入到2.5ml含有10μg/ml荧光碳纳米颗粒的b-r缓冲溶液中配制成混合溶液，该混合溶液ph=10-12，室温反应完成后，在320nm激发条件下测量其荧光光谱，绘制荧光强度比f0/f与镍离子浓度标准曲线；f0是不存在ni²⁺离子时的荧光强度，f是存在ni²⁺离子时的荧光强度；

（3）取荧光碳纳米颗粒配制的溶液、含有ni²⁺离子的待测样品溶液和b-r缓冲溶液配制成混合溶液，该混合溶液ph=10-12，用荧光分光光度计测定395nm处的荧光强度，并根据步骤（2）所述的标准曲线计算ni²⁺离子的浓度。

根据本发明的另一方面，提供一种检测甘氨酸的方法，包括步骤：

（1）配制不同浓度的ni²⁺离子溶液；

（2）将具有不同浓度的甘氨酸溶液加入到2.5ml同时含有10μg/ml荧光碳纳米颗粒和50μmni²⁺离子的b-r缓冲溶液中配制成混合溶液，该混合溶液ph=10-12，室温反应完成后，在320nm激发条件下测量其荧光光谱，绘制荧光强度比f/f0与甘氨酸浓度标准曲线；f0是不存在甘氨酸时的荧光强度，f是存在甘氨酸时的荧光强度；

（3）取荧光碳纳米颗粒配制的溶液、ni²⁺离子标准溶液、含有甘氨酸的待测样品溶液和b-r缓冲溶液配制成混合溶液，该混合溶液的ph=10-12，用荧光分光光度计测定395nm处的荧光强度，并根据所述的标准曲线计算甘氨酸的浓度。

进一步地，在以上检测ni²⁺离子或甘氨酸的方法中，步骤（2）和步骤（3）中所述的混合溶液的ph=11为最佳条件。

进一步地，在以上检测ni²⁺离子的方法中，步骤（3）中，在hg²⁺离子存在的体系中加入乙二胺以消除hg²⁺离子干扰；在ag⁺离子存在的体系中加入巯基乙酸铵以消除ag⁺离子的干扰。

进一步地，在以上检测甘氨酸的方法中，步骤（3）中，在hg²⁺离子存在的体系中加入乙二胺以消除hg²⁺离子干扰；在ag⁺离子存在的体系中加入巯基乙酸铵以消除ag⁺离子的干扰。

进一步地，在以上检测甘氨酸的方法中，步骤（3）中，混合溶液中ni²⁺离子浓度为50μm。

本发明提供的一种基于荧光碳纳米颗粒高灵敏检测ni²⁺离子及甘氨酸的荧光分析方法，相比于现有技术而言，有益效果是：①荧光探针的合成具有步骤简单、绿色环保等优点；②该探针对镍离子具有超低检出限，显示了超灵敏的检测能力；③所合成的荧光探针通过ni²⁺离子的协同作用可以进一步灵敏的检测甘氨酸。④所建立的分析方法简单便捷，成本低。

附图说明

图1荧光碳纳米颗粒的透射电镜图。

图2不同ph条件下ni²⁺离子对荧光碳纳米颗粒溶液的荧光猝灭柱状图。

图3不同浓度ni²⁺离子存在下荧光碳纳米颗粒溶液的荧光光谱图（激发波长320nm，激发狭缝和发射狭缝均为5nm）。

图4ni²⁺离子检测的标准曲线。

图5（a）不同金属离子存在时的荧光强度柱状图；图5（b）掩蔽剂对hg²⁺和ag⁺离子干扰消除的荧光柱状图（其中1：荧光碳纳米颗粒溶液；2：荧光碳纳米颗粒溶液+ni²⁺离子；3：荧光碳纳米颗粒溶液+ag⁺离子；4：荧光碳纳米颗粒溶液+ag⁺离子+巯基乙酸铵；5：荧光碳纳米颗粒溶液+ag⁺离子+巯基乙酸铵+ni²⁺离子；6：荧光碳纳米颗粒溶液+hg²⁺离子；7：荧光碳纳米颗粒溶液+hg²⁺离子+乙二胺；8：荧光碳纳米颗粒溶液+hg²⁺离子+乙二胺+ni²⁺离子）。

图6不同浓度甘氨酸存在下荧光碳纳米颗粒/ni²⁺体系的荧光光谱图。

图7甘氨酸检测的标准曲线。

具体实施方式

本发明一种典型的实施方式提供一种荧光碳纳米颗粒的合成方法，其特征在于：将甲脒亚磺酸加入到乙二醇中，室温超声溶解，将得到的混合溶液转移到高压反应釜中，在200-250℃下加热反应2-3小时，反应结束后自然冷却至室温并加入超纯水，然后离心除去大的颗粒，随后以分子截留量1000的透析袋透析，所得水溶液通过旋转蒸发除去水分后得到所述的荧光碳纳米颗粒。上述得到的荧光碳纳米颗粒重新分散在超纯水中，在4℃冰箱中保存备用。该合成方法具有步骤简单、绿色环保等优点。

本发明另一种典型的实施方式是提供由合成方法得到的荧光碳纳米颗粒及其水溶液。荧光碳纳米颗粒的形貌如图1所示，呈现准球形形貌，尺寸分布在28nm~48nm。

申请人发现上述荧光碳纳米颗粒作为探针可用于分析检测ni²⁺离子和甘氨酸含量。探针对镍离子具有超低检出限，显示了超灵敏的检测能力。在检测甘氨酸含量时加入ni²⁺离子，通过甘氨酸与与荧光碳纳米颗粒竞争性争夺ni²⁺离子，导致荧光恢复，可以进一步灵敏的检测甘氨酸，在现有技术中尚无相关报道。

下面两种实施方式分别是应用本发明所述荧光碳纳米颗粒分析检测ni²⁺离子和甘氨酸含量的具体方法。以下实施方式中使用的b-r缓冲溶液（0.04m）按照分子克隆试验指南配制。主要成分磷酸、硼酸、冰醋酸。

实施方式一，一种分析检测ni²⁺离子的方法，包括步骤：

（1）配制不同浓度的ni²⁺离子溶液；

（2）将具有不同浓度的ni²⁺离子溶液加入到2.5ml含有10μg/ml荧光碳纳米颗粒的b-r缓冲溶液中配制成混合溶液，该混合溶液ph=10-12，室温反应完成后，在320nm激发条件下测量其荧光光谱，绘制荧光强度比f0/f与镍离子浓度标准曲线；f0是不存在ni²⁺离子时的荧光强度，f是存在ni²⁺离子时的荧光强度；

（3）取荧光碳纳米颗粒配制的溶液、含有ni²⁺离子的待测样品溶液和b-r缓冲溶液配制成混合溶液，该混合溶液ph=10-12，用荧光分光光度计测定395nm处的荧光强度，并根据步骤（2）所述的标准曲线计算ni²⁺离子的浓度。

图3所示，随着ni²⁺离子浓度的增加，荧光碳纳米颗粒在395nm处的荧光强度逐渐减弱，如图4所示，荧光强度比f0/f与ni²⁺离子浓度在5.0×10^-7~1.0×10^-4范围内呈现优良的线性关系，检出限可达5×10^-13m。

ni²⁺离子检测最佳ph的优化

将荧光碳纳米颗粒浓溶液分别稀释在ph2~11br缓冲溶液中，加入相同浓度的ni²⁺离子溶液，室温反应5分钟后，在320nm激发条件下测量395nm处的荧光强度值。结果如图2所示。可以看出，ph=11时，ni²⁺离子对荧光碳纳米颗粒的猝灭效果最好。因此，优选地，实施方式一中，步骤（2）和步骤（3）中所述的混合溶液的ph=11。

金属离子干扰研究及hg²⁺离子和ag⁺离子的干扰消除

如图5a所示，ni²⁺离子、hg²⁺离子和ag⁺离子的存在均会导致荧光碳纳米颗粒溶液的荧光发生明显猝灭，所以为了消除hg²⁺离子和ag⁺离子的干扰，乙二胺和巯基乙酸铵分别被用作hg²⁺离子和ag⁺离子的掩蔽剂。如图5b所示，在hg²⁺离子存在的体系中加入乙二胺，或在ag⁺离子存在的体系中加入巯基乙酸铵后，体系荧光基本完全恢复，在这两种复合体系中继续加入ni²⁺离子，荧光继而发生相同程度的猝灭，说明乙二胺和巯基乙酸铵可以很好地消除hg²⁺离子和ag⁺离子的干扰，使对ni²⁺离子的检测没有明显的影响。因此，优选地，在hg²⁺离子存在的体系中加入乙二胺以消除hg²⁺离子干扰；在ag⁺离子存在的体系中加入巯基乙酸铵以消除ag⁺离子的干扰。在ph=11条件下，汞离子的干扰通过加入乙二胺可以完全掩蔽，银离子的干扰通过加入巯基乙酸铵可以完全掩蔽。

实施方式二，一种分析检测甘氨酸的方法，包括步骤：

（1）配制不同浓度的ni²⁺离子溶液；

（2）将具有不同浓度的甘氨酸溶液加入到2.5ml同时含有10μg/ml荧光碳纳米颗粒和50μmni²⁺离子的b-r缓冲溶液中配制成混合溶液，该混合溶液ph=10-12，室温反应完成后，在320nm激发条件下测量其荧光光谱，绘制荧光强度比f/f0与甘氨酸浓度标准曲线；f0是不存在甘氨酸时的荧光强度，f是存在甘氨酸时的荧光强度；

（3）取荧光碳纳米颗粒配制的溶液、ni²⁺离子标准溶液、含有甘氨酸的待测样品溶液和b-r缓冲溶液配制成混合溶液，该混合溶液的ph=10-12，用荧光分光光度计测定395nm处的荧光强度，并根据所述的标准曲线计算甘氨酸的浓度。优选地，混合溶液中ni²⁺离子浓度为50μm。

如图6所示，随着甘氨酸浓度的增加，荧光碳纳米颗粒在395nm处的荧光强度逐渐增强，如图7所示，荧光强度比f/f0与甘氨酸浓度在1.0×10^-5~4.25×10^-4范围内呈现优良的线性关系，检出限可达1.0×10^-5m。

优选地，实施方式二中，步骤（2）和步骤（3）中所述的混合溶液的ph=11。

优选地，在hg²⁺离子存在的体系中加入乙二胺以消除hg²⁺离子干扰；在ag⁺离子存在的体系中加入巯基乙酸铵以消除ag⁺离子的干扰。在ph=11条件下，hg²⁺离子的干扰通过加入乙二胺可以完全掩蔽，ag⁺离子的干扰通过加入巯基乙酸铵可以完全掩蔽。

【能不能具体说明ni²⁺离子的协同作用体现在哪些方面】当体系中存在甘氨酸时，甘氨酸可以和ni²⁺离子发生络合，从而与荧光碳纳米颗粒发生竞争性争夺ni²⁺离子，使ni²⁺离子与荧光碳纳米颗粒间的作用减弱甚至远离其表面，导致荧光碳纳米颗粒的荧光进一步恢复。

下面通过一些实施例对本发明要求保护的技术方案作进一步说明。但是，实施例和对比例是用于解释本发明实施方案，并不超出本发明主题的范围，本发明保护范围不受所述实施例的限定。除非另作特殊说明，本发明中所用材料、试剂均可从本领域商业化产品中获得。

实施例1：荧光碳纳米颗粒的合成

将300mg甲脒亚磺酸加入到10ml乙二醇中，室温超声溶解20分钟，将混合溶液转移到25ml高压反应釜中，在220℃下加热反应2.5小时，反应结束后自然冷却至室温并加入10ml超纯水，然后在8000rpm/min条件下离心10分钟除去大的颗粒，随后以分子截留量1000的透析袋透析36小时，所得水溶液通过旋转蒸发除去水分。所得产物重新分散在超纯水中，配制成浓度为5mg/ml的水溶液，保存在4℃冰箱中备用。

实施例2：荧光碳纳米颗粒的合成

将300mg甲脒亚磺酸加入到10ml乙二醇中，室温超声溶解20分钟，将混合溶液转移到25ml高压反应釜中，在200℃下加热反应3小时，反应结束后自然冷却至室温并加入10ml超纯水，然后在8000rpm/min条件下离心10分钟除去大的颗粒，随后以分子截留量1000的透析袋透析36小时，所得水溶液通过旋转蒸发除去水分。所得产物重新分散在超纯水中，保存在4℃冰箱中备用。

实施例3：荧光碳纳米颗粒的合成

将300mg甲脒亚磺酸加入到10ml乙二醇中，室温超声溶解20分钟，将混合溶液转移到25ml高压反应釜中，在250℃下加热反应2小时，反应结束后自然冷却至室温并加入10ml超纯水，然后在8000rpm/min条件下离心10分钟除去大的颗粒，随后以分子截留量1000的透析袋透析36小时，所得水溶液通过旋转蒸发除去水分。所得产物重新分散在超纯水中，保存在4℃冰箱中备用。

实施例4：ni²⁺离子的分析检测

步骤（1），配制不同浓度的ni²⁺离子溶液；

步骤（2），将具有不同浓度的ni²⁺离子溶液加入到2.5ml含有10μg/ml荧光碳纳米颗粒的br缓冲溶液中配制成混合溶液，混合溶液的ph=11，室温反应5分钟后，在320nm激发条件下测量其荧光光谱，以荧光强度比f0/f,为纵坐标，镍离子浓度为横坐标，绘制标准曲线。

步骤（3），取实施例1所述的荧光碳纳米颗粒配制的水溶液、含有ni²⁺离子的待测样品溶液和b-r缓冲溶液配制成混合溶液，混合溶液中荧光碳纳米颗粒的浓度为10μg/ml，混合溶液的ph=11，用荧光分光光度计测定395nm处的荧光强度，并根据所述的标准曲线计算ni²⁺离子的浓度，计算回收率，加标回收率在95.2%~106.7%。

实施例5：甘氨酸的分析检测

步骤（1），配制不同浓度的甘氨酸溶液；

步骤（2），将具有不同浓度的甘氨酸溶液加入到2.5ml同时含有10μg/ml荧光碳纳米颗粒和50μmni²⁺离子的br缓冲溶液中配制成混合溶液，混合溶液的ph=11，室温反应5分钟后，在320nm激发条件下测量其荧光光谱，以荧光强度比f/f0为纵坐标，甘氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

步骤（3），取实施例1所述的荧光碳纳米颗粒配制的溶液、ni²⁺离子标准溶液、含有甘氨酸的待测样品溶液和b-r缓冲溶液配制成混合溶液，混合溶液中，荧光碳纳米颗粒的浓度为10μg/ml，ni²⁺离子的浓度为50μm，混合溶液的ph=11，用荧光分光光度计测定395nm处的荧光强度，并根据所述的标准曲线计算甘氨酸的浓度。