本发明涉及一种检测罗丹明b的聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器的制备方法及应用，属于罗丹明b分析检测技术领域。
背景技术：
罗丹明b是一种合成的红色染料，已经被用于荧光标记和食用色素。但是，它对人类和动物都有害，特别是对皮肤、眼睛和呼吸道产生刺激，属于致癌物质。因此，禁止在食品中添加罗丹明b作为食品添加剂。但由于罗丹明b价格低廉，颜色鲜艳，不少商家为了节约成本获得更大利润，继续使用罗丹明b作为食品添加剂，这大大危害了人类的健康。检测罗丹明b的传统方法有薄层色谱法和高效液相色谱法等，这些方法不但成本非常昂贵，而且还存在操作繁琐的问题。且由于食物的成分复杂，食物中罗丹明b的含量低，需要对实际样品进行样品预处理，样品前处理方法不但步骤繁琐，会产生大量的有机废液，且缺乏选择性吸附能力。因此，建立一种简便快速的方法测定实际样品中的罗丹明b是非常有必要的。
分子印迹聚合物(molecularimprintingpolymers，简称mips)是一种利用分子印迹技术加工而成的聚合物，这种技术使聚合物基体中的空腔与选定的“模板”分子具有亲和力。该聚合物不仅有特异性识别能力，还具有选择性吸附。并且mips还具有以下优点：第一，制备mips的方法相当简单并且经济，大多数mips是通过本体法和沉淀聚合法合成的；第二，mips具有良好的物理和化学稳定性；最后，mips可以在恶劣的化学环境中使用，不丧失吸附性能。
荧光传感器通常可分为淬灭型荧光传感器、增强型荧光传感器和比率型荧光传感器三种类型。根据响应原理的不同，不同类型的传感器对不同物质的响应模式也有所不同。到目前为止，大多数荧光材料都采用单一的响应信号进行检测，这种信号易受荧光强度变化以及环境和仪器效率等外部因素的影响。而比率测量通过比较两个荧光峰的比值而不是一个峰的绝对强度得出更精确的结果，具有消除环境影响的优点。
由于mips是聚合物，属于固体，因此寻找一种在固体状态发出强烈荧光的分子是非常重要的。聚集诱导发光(aggregation-inducedemission,简称aie)分子在固态发出强烈的荧光，将其引入到mips中是非常实用的。但目前还没有将aie与mips相结合的报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种以aie分子为荧光基团，以mips为识别基团，结合分子印迹技术和荧光检测技术，采用沉淀聚合法，合成检测罗丹明b的聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器(aie-mips)的制备方法及应用，所得aie-mips对罗丹明b具有较强的识别能力和优异的选择性。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种检测罗丹明b的聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器的制备方法，将功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯与分子印迹聚合物相结合，采用沉淀聚合法制得聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器aie-mips。
具体的，检测罗丹明b的聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器的制备方法为：准确称取华法林0.8-1.2mmol置于三口瓶中，加入0.1-0.3g偶氮二异丁腈，150-200ml乙腈，然后加入5-15mmolα-甲基丙烯酸，60-100mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯，再加入0.01-0.05mmol功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯，超声震荡15-30min，使其全部溶解，在70-90℃的条件下，机械搅拌反应8-12h，抽滤，烘干，洗脱。
优选的，检测罗丹明b的聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器的制备方法为：准确称取华法林1.0mmol置于三口瓶中，加入0.2g偶氮二异丁腈，150ml乙腈，然后加入9mmolα-甲基丙烯酸，60mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯，再加入0.01mmol功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯，超声震荡15min，使其全部溶解，在83℃的条件下，机械搅拌反应8h，抽滤，烘干，洗脱。
洗脱的方法为：搭建索氏抽提装置，加入200-300ml甲醇和乙酸的混合液，将合成好的aie-mips用滤纸包好放入到索氏提取装置中，控温90-100℃，洗脱2-3天后，用100-300ml纯甲醇洗脱，每隔一段时间用荧光检测仪测定洗脱液的荧光光谱，华法林分子的荧光发射波长为385nm，在此波长处无峰则说明洗脱干净，最后烘干备用。
甲醇和乙酸的混合液中甲醇和乙酸的体积比为4:1-6:1。
功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯的制备方法为：
(1)称取1.5-2.5mmol三苯溴乙烯放入圆底烧瓶中，然后加入2-3mmol4-羟基苯硼酸，20-30mmol碳酸钾，0.05-0.10mmol四(三苯基磷)钯，10-20ml水和20-30ml四氢呋喃，抽空烧瓶并充入氮气保护，在75-95℃的条件下反应12-24h；将所得产物过滤，收集滤液，用二氯甲烷萃取后收集有机相；加入5g无水硫酸钠干燥后，通过柱色谱分离，得到功能化aie分子中间体4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯酚；
(2)将3-5mmol功能化aie分子中间体溶解在25ml二氯甲烷中，加入10-12mmol三乙胺，并逐滴加入8-10mmol丙烯酰氯，室温下搅拌4-6h，过滤，减压蒸馏除去溶剂，得到功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯粗品；通过柱色谱分离，得到纯的功能化aie分子。
优选的，功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯的制备方法为：
(1)称取2mmol三苯溴乙烯放入圆底烧瓶中，然后加入2.4mmol4-羟基苯硼酸，20mmol碳酸钾，0.1mmol四(三苯基磷)钯，15ml水和25ml四氢呋喃，抽空烧瓶并充入氮气保护，在85℃的条件下反应12h；将所得产物过滤，收集滤液，用二氯甲烷萃取后收集有机相；加入5g无水硫酸钠干燥后，通过柱色谱分离，得到功能化aie分子中间体4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯酚；
(2)将4mmol功能化aie分子中间体溶解在25ml二氯甲烷中，加入12mmol三乙胺，并逐滴加入8mmol丙烯酰氯，室温下搅拌4h，过滤，减压蒸馏除去溶剂，得到功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯粗品；通过柱色谱分离，得到纯的功能化aie分子。
柱色谱分离所用洗脱剂为体积比1:30-1:10的石油醚-乙酸乙酯。
一种利用聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器检测罗丹明b的方法，将制得的aie-mips加入待测样品溶液中，斡旋1-5min后放在摇床上室温吸附1-3h，抽滤，用5-15ml二氯甲烷淋洗，抽干，荧光检测。
荧光检测的条件：激发波长设定为345nm，记录发射范围为370-680nm。
本发明有益效果：
1、本发明所制备的功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯属于四苯乙烯类aie分子，其具有荧光量子产率高、结构稳定性好，且合成简单、成本低廉、易修饰等突出优点。由于aie分子在固态发出强烈的荧光，把aie分子引入到mips中，即可通过荧光光谱仪原位检测罗丹明b。
2、本发明结合分子印迹技术和荧光检测技术，采用华法林为模板分子，α-甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，乙腈为溶剂，加入功能化aie分子，采用沉淀聚合法合成aie-mips。当aie-mips与待测物特异性结合后，能够直接在原位产生荧光变化，通过在线检测荧光强度的变化，实现对待测物的检测。另一方面，由于目标分析物罗丹明b本身具有颜色，难以完全洗脱干净，影响aie-mips吸附前后颜色变化的判断，因此本发明选择结构相似且没有颜色的华法林作为替代模板，采用沉淀聚合法合成aie-mips。
3、本发明aie-mips不仅操作简便，使用有机试剂较少，且具有特异性吸附能力，能够从复杂体系中特异性吸附目标分子，排除杂质的干扰，提高检测灵敏度和准确度。检测aie-mips吸附不同浓度的罗丹明b溶液后的荧光光谱发现，aie-mips对罗丹明b具有较强的识别能力，并且线性关系良好。用aie-mips分别吸附浓度为1×10-5mol/l的罗丹明b、亮蓝、胭脂红、苋菜红、胭脂红和诱惑红溶液，并分别测试其荧光光谱，发现aie-mips对罗丹明b溶液具有优异的选择性。且吸附后的aie-mips可不用洗脱，直接进行在线检测。
4、本发明的荧光传感器aie-mips，在检测罗丹明b时，随着罗丹明b浓度的增加，功能化aie分子的荧光峰逐渐降低，罗丹明b的荧光峰逐渐升高，呈比率型变化。aie-mips对罗丹明b检测的标准曲线表明，aie-mips吸附罗丹明b溶液后，在线检测其荧光光谱，在浓度范围为1×10-5-10×10-5mol/l内线性关系良好。把aie-mips用于对实际样品木瓜干、芬达饮料进行加标回收实验，结果表明罗丹明b的回收率范围为96.2-103.5％，相对标准偏差范围为1.5-4.7％。这些数据表明了荧光检测技术与分子印迹技术相结合得到的aie-mips可应用于实际样品中罗丹明b的检测。
附图说明
图1为功能化aie分子的激发光谱图(线a)和发射波光谱图(线b)。
图2为aie-mips的激发光谱图(线a)和发射光谱图(线b)。
图3功能化aie分子在水/乙醇中的荧光谱图(a)和紫外吸收光谱图(b)。图中，箭头表示水的体积分数增加方向。
图4为功能化aie分子在丙三醇/乙醇中的荧光光谱图。图中，箭头表示丙三醇的体积分数增加方向。
图5为aie-mips吸附不同浓度罗丹明b后荧光光谱图(a)和线型关系图(b)。
图6为aie-mips与aie-nips随罗丹明b浓度变化的荧光强度比值图。
图7为aie-mips吸附不同色素的荧光强度比值图。
图8为aie-mips对罗丹明b检测的标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯的制备
(1)称取2mmol三苯溴乙烯放入100ml圆底烧瓶中，然后加入2.4mmol4-羟基苯硼酸，20mmol碳酸钾提供碱性环境，再加入0.10mmol四(三苯基磷)钯，15ml水和25ml四氢呋喃(thf)作为溶剂，抽空烧瓶并充入氮气保护，在85℃的条件下反应12h；将所得产物过滤，收集滤液，用二氯甲烷萃取后收集有机相；加入5g无水硫酸钠干燥后，通过柱色谱分离(洗脱剂为体积比1:30-1:10的石油醚-乙酸乙酯，梯度洗脱)，得到功能化aie分子中间体4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯酚；
(2)将4mmol功能化aie分子中间体溶解在25ml二氯甲烷中，加入12mmol三乙胺，并逐滴加入8mmol丙烯酰氯，室温下搅拌4h，过滤，减压蒸馏除去溶剂，得到功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯粗品；通过柱色谱分离(洗脱剂为体积比1:30-1:10的石油醚-乙酸乙酯，梯度洗脱)，得到纯的功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯。
采用高分辨质谱对所得产物进行表征，得到分子量为403.1695的正离子峰，与目标分子加质子的分子量(403.1693)一致，证明是4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯。进一步，通过元素分析，得到产物中的元素含量为c86.59％，h5.55％，o7.86％，与理论值c86.54％，h5.51％，o7.95％相吻合。对功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯进行光谱分析，结果见图1。由图1可知，功能化aie分子的最佳激发波长是365nm，最佳发射波长是453nm。
实施例2、聚集诱导发光-分子印迹荧光传感器(aie-mips)的制备
准确称取华法林1.0mmol置于250ml三口瓶中，加入0.2g偶氮二异丁腈(aibn)，150ml乙腈，然后加入9mmolα-甲基丙烯酸(α-maa)，60mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯(edma)，再加入0.01mmol功能化aie分子4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯基丙烯酸酯(模板摩尔量的1/100)，超声震荡15min，使其全部溶解，在83℃的条件下，机械搅拌反应8h，抽滤，烘干，洗脱，得到aie-mips。
其中，洗脱的方法为：搭建索氏抽提装置，加入200ml甲醇和乙酸(体积比4:1)的混合液，将合成好的aie-mips用滤纸包好放入到索氏提取装置中，控温90℃，洗脱3天后，用150ml纯甲醇洗脱，每隔一段时间用荧光检测仪测定洗脱液的荧光光谱，华法林分子的荧光发射波长为385nm，在此波长处无峰则说明洗脱干净，最后烘干备用。
图2为aie-mips的荧光激发和发射光谱图，由图2可知，aie-mips的最佳激发波长是345nm，最佳发射波长是450nm。
实施例3、功能化aie分子性能的测试
3.1溶剂对功能化aie分子荧光强度的影响
分别用水/乙醇的混合溶剂(水的体积分数分别为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)配制浓度为1×10-5mol/l功能化aie分子溶液，备用，检测荧光光谱，结果见图3(a)。由图3(a)可知，当水的体积分数达到70％时，荧光发射明显增强。功能化aie分子在纯水中的荧光强度比在纯乙醇中的荧光强度高45倍。一般情况下，水是大多数有机物的不良溶剂，功能化aie分子在水中发生聚集，因此产生强烈的荧光，即aie发光。因此，随着混合溶剂中水的体积分数的增加，功能化aie分子逐渐聚集，功能化aie分子的荧光逐渐增强。
为了进一步验证水/乙醇中的荧光是因为功能化aie分子的聚集，检测了紫外吸收光谱，如图3(b)所示。在乙醇溶剂中，功能化aie分子具有很好的溶解性，并在312nm处出现了一个吸收峰。然而，由于功能化aie分子在水中的溶解度较低，其会在溶液中产生聚集体，从而发生光散射现象。相应的紫外吸收光谱的精细结构消失且在光谱的可见区260-500nm能够清晰的观察到紫外拖尾现象，证明了功能化aie分子在水中处于聚集状态。
3.2溶剂粘度对发光性能的影响
分别用丙三醇/乙醇的混合溶剂(丙三醇的的体积分数为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)配制浓度为1×10-5mol/l功能化aie分子溶液，备用，检测荧光光谱，结果见图4。由图4可知，功能化aie分子的发光性能受溶剂粘度的影响。在不同比例的丙三醇/乙醇溶剂中，随着丙三醇的体积分数增加，功能化aie分子的荧光强度逐渐增强。这是因为，溶剂粘度增加，功能化aie分子的分子内旋转受限，使得功能化aie分子发出很强的荧光。
实施例4、aie-mips的静态吸附曲线的测定
用蒸馏水配制不同浓度梯度(0、1×10-6、5×10-6、1×10-5、5×10-5、1×10-4、5×10-4mol/l)的罗丹明b溶液，准确称取6份aie-mips和6份aie-nips(制备方法同aie-mips，唯一区别在于不加入华法林)60mg分别放在10ml离心管中，各加入5ml上述不同浓度的罗丹明b溶液，斡旋1min后下放在摇床上室温吸附1h，抽滤，用5ml二氯甲烷淋洗，抽干，得到吸附不同浓度罗丹明b的aie-mips和aie-nips固体，用于荧光光谱检测(图5、6)。
由图5(a)可知，aie-mips吸附不同浓度的罗丹明b溶液后，在450nm处的荧光峰逐渐降低，582nm处荧光峰逐渐升高，呈比率型变化。由图5(b)可知，在罗丹明b浓度为1×10-6-1×10-4mol/l的范围内，其582nm与450nm波长处的荧光强度比值(i582/i450)与罗丹明b溶液具有很好的线性关系，线性方程为y＝0.00606+0.02475x，其中r2＝0.9992。
由图6可知，吸附不同浓度的罗丹明b时，aie-mips所对应的i582/i450始终比aie-nips所对应的i582/i450大。这说明了aie-mips的吸附能力比aie-nips的吸附能力强。
实施例5、aie-mips的选择吸附性能测试
分别配制1×10-5mol/l的诱惑红、胭脂红、苋菜红、品红、亮蓝、罗丹明b溶液，准确称取6份aie-mips60mg分别放入10ml离心管中，各加入5ml上述相同浓度的不同物质溶液，斡旋1min后放在摇床上室温吸附1h，抽滤，用5ml二氯甲烷淋洗，抽干，得到吸附不同物质的aie-mips固体。将吸附后的aie-mips用于荧光光谱检测(图7)。由图7可知，aie-mips吸附罗丹明b溶液后所对应的i582/i450远大于其它色素。这说明了aie-mips对罗丹明b具有很好选择性吸附和检测能力。
实施例6、实际样品分析
6.1标准曲线的绘制
配制不同浓度梯度(1×10-5、2×10-5、3×10-5、4×10-5、5×10-5、6×10-5、7×10-5、8×10-5、9×10-5、10×10-5mol/l)的罗丹明b溶液，准确称取10份aie-mips60mg分别放入10ml离心管中，各加入5ml上述不同浓度的溶液，斡旋1min后放在摇床上室温吸附1h，抽滤，用5ml二氯甲烷淋洗，抽干，得到吸附罗丹明b的aie-mips固体，将每一份固体进行荧光光谱检测。上述实验平行做三组，结果见图8。
由图8可知，在1×10-5-10×10-5mol/l范围内，aie-mips对罗丹明b溶液具有良好的线性检测能力，线性方程为：y＝0.44247+0.24773x，r2＝0.99698。
6.2实际样品处理
木瓜干样品的处理：准确称取30.00g研磨均匀的木瓜干置于250ml锥形瓶中，加入90mltris缓冲溶液(ph＝7.5)，在摇床上震荡混匀10min，超声提取10min，转移至离心管中，在4000rpm下离心10min以分离提取液和木瓜干沉淀，重复以上步骤反复提取木瓜干沉淀三次，合并上清液，用tris缓冲溶液定容至300ml，再使用布氏漏斗、抽滤瓶加0.45μm滤膜过滤，滤液保存在锥形瓶中备用。
芬达饮料的处理：准确称取30.00g饮料，电炉上加热煮沸5min以除去饮料中co2及其它易挥发杂质，用tris缓冲溶液定容至300ml，使用布氏漏斗、抽滤瓶加0.45μm滤膜过滤，保存在锥形瓶中备用。
6.3aie-mips在检测实际样品中罗丹明b的应用
准确称取60mgaie-mips于10ml离心管中，加入待测样品溶液5ml，斡旋1min后放在摇床上室温吸附1h，抽滤，用5ml二氯甲烷淋洗，抽干，收集滤饼，使用荧光光谱仪测定发射光谱图。平行进行三组，并重复以上步骤分别进行以实际样品为基质的3.0×10-5、6.0×10-5、9.0×10-5mol/l罗丹明b溶液的加标实验，结果见表1。
表1实际样品的加标回收率
由表1可知，芬达饮料的加标回收率范围101.7-103.5％，相对标准偏差(relativestandarddeviation，简称rsd)的范围为2.2-3.5％；木瓜干的加标回收率范围96.2-98.7％，rsd的范围为1.5-4.7％。由此可说明该方法的回收效果良好，可用于食品中罗丹明b的分析检测。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。