本发明属于生物技术领域，涉及一种微球试剂及其制备方法和应用。
背景技术：
β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11.8kd，它是细胞表面人类淋巴细胞抗原(hla)的β链(轻链)部分(为一条单链多肽)，广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中，含量很低。正常人β2-微球蛋白的合成率及从细胞膜上的释放量相当恒定，β2-微球蛋白可以从肾小球自由滤过，99.9％在近端肾小管吸收，因此测定血液β2-微球蛋白可以作为反映肾小球滤过率的指标。β2-微球蛋白检测被认为是衡量糖尿病患者轻度肾功能减退和疗效观察的一项简便、精确而又敏感的方法。故而β2-微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。
目前常用的测定β2-微球蛋白的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法、胶乳增强免疫透射比浊法。其中应用最多的就是胶乳增强免疫透射比浊法，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。
目前市场上免疫比浊法制备的β2微球蛋白的检测试剂盒大多采用两步法，第一步偶联剂将微球表面的官能团活化，第二步活化后的微球与抗体结合产生共价键。这种方法为了把未结合的抗体和偶联剂除去，需要进行多次的过滤和清洗，在过滤和清洗过程中，一般使用离心和超滤的方法。这些过滤和清洗过程耗时长、工艺繁锁，且受设备、人员、场地等多种因素限制，单批次制备量少、损耗大、生产成本高。
cn108226531a公开了一种β2微球蛋白检测试剂盒，包括试剂r1、试剂r2，所述试剂r1为缓冲液，所述试剂r2包括聚苯乙烯胶乳颗粒偶联的β2微球蛋白抗体以及缓冲液，所述试剂r2的制备方法包括胶乳颗粒激活、β2微球蛋白抗体活化、偶联的步骤。但该方法需要激活、活化和偶联多步骤分开操作，需要洗涤操作，步骤繁琐，制备工艺复杂，生产效率较低。cn106645753a公开了一种β2微球蛋白的快速检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1由磷酸二氢钾、十二烷基葡萄糖苷、八(乙二醇)一(十二烷基)醚、单十二烷基九乙二醇醚、氯化钙、对羟基苯甲酸酯和水组成；所述试剂r2由单十二烷基九乙二醇醚、十二烷基葡萄糖苷、抗人β2微球蛋白抗体胶乳、对羟基苯甲酸酯和水组成；所述抗人β2微球蛋白抗体胶乳的直径为130-150nm。但该发明的试剂组分繁多，成本较高，还需要离心去上清，不利于推广应用。cn102590526b提供了一种β2-微球蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂r1、试剂r2，试剂r1包括缓冲液、防腐剂、稳定剂、电解质、表面活性剂，其余为纯化水，试剂r2包括用β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂、稳定剂，其余为纯化水。β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒采用定向偶联的方法，制备步骤包括：聚苯乙烯胶乳颗粒的激活；β2-微球蛋白抗体的氧化；β2-微球蛋白抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联。该方法对于激活、氧化和偶联的方法未进行优化，其体系稳定性和检测灵敏度有待进一步提高。
因此，对β2-微球蛋白检测试剂进行优化，提供一种方便快捷的微球试剂的制备方法，提高检测准确度、体系稳定性和生产效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现要素：
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种微球试剂及其制备方法和应用，所述方法采用一步法制备微球试剂，将微球、抗体和偶联剂按特定浓度混合，经过混匀、超声，再加入稳定剂、防腐剂、贮存剂等使所得体系稳定保存，此法操作简单，受设备的限制小，单次生产量大，有效的降低生产成本和提高生产效率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种微球试剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将微球溶液、微球蛋白抗体溶液和偶联剂溶液混合均匀，超声分散；
(2)向步骤(1)分散后的溶液加入助剂2，混匀后超声分散；
(3)向步骤(2)分散后的溶液加入助剂3，混匀后得到所述微球试剂。
本发明中，发明人在长期生产实践中，深入调研免疫比浊法制备β2微球蛋白的检测试剂的优缺点，为简化生产工艺，省去超滤和离心的步骤，优化实验操作方法，创造性地先将微球、抗体和偶联剂按照特定比例混合后，再进行超声混匀，各步骤各条件协同增效，实现分散均匀稳定的试剂体系，方法简洁高效，有效降低生产成本，提高生产效率。
其中，步骤(1)所述混合的微球浓度为0.1-0.5％，抗体浓度为0.1-0.5％，偶联剂浓度为0.1-1.0mg/l。
其中，所述微球的浓度例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％。
所述抗体的浓度例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％。
所述偶联剂的浓度例如可以是0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l、0.4mg/l、0.5mg/l、0.6mg/l、0.7mg/l、0.8mg/l、0.9mg/l或1.0mg/l。
优选地，所述微球溶液、β2微球蛋白抗体溶液和偶联剂溶液的溶剂为助剂1。
其中，所述助剂1的组分包括：10-100mm的缓冲液，1-5％的无机盐，0.5％-2.0％的悬浊剂。
所述缓冲液的浓度例如可以是10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm。
所述无机盐的浓度例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
优选地，所述助剂1的ph为5.0-7.5，例如可以是5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.5。
优选地，所述助剂1的缓冲液包括mes、mopso或pbs中的任意一种或至少两种的组合。
所述助剂1的无机盐包括kcl和/或nacl。
所述助剂1的悬浊剂包括海藻糖、蔗糖或peg中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)混合均匀的时间为1-72h，例如可以是1h、5h、10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h或72h，混合均匀的转速为20-50转/min，例如可以是20转/min、30转/min、40转/min或50转/min。
步骤(1)所述超声分散的条件为：超声功率10-50％，例如可以是10％、20％、30％、40％或50％，超声开启时间为1-3s，例如可以是1s、2s或3s，超声关闭时间为3-6s，例如可以是3s、4s、5s或6s，超声总时间为5-30min，例如可以是5min、10min、15min、20min、25min或30min。
优选地，步骤(2)所述混合均匀的时间为1-5h，例如可以是1h、2h、3h、4h或5h，混合均匀的转速为20-50转/min，例如可以是20转/min、30转/min、40转/min或50转/min。
优选地，步骤(2)所述助剂2与步骤(1)分散后溶液的体积比为1:(9-11)。
步骤(2)所述超声分散的条件为：超声功率10-50％，例如可以是10％、20％、30％、40％或50％，超声开启时间为1-3s，例如可以是1s、2s或3s，超声关闭时间为3-6s，例如可以是3s、4s、5s或6s，超声总时间为5-30min，例如可以是5min、10min、15min、20min、25min或30min。
优选地，步骤(2)所述助剂2的组分包括10-100mm的缓冲液、1-5％的无机盐、0.5-2.0％的悬浊剂和5-10％的稳定剂。
所述缓冲液的浓度例如可以是10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm。
所述无机盐的浓度例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
所述悬浊液的浓度例如可以是0.5％、1％、1.5％或2％。
所述稳定剂的浓度为5％、6％、7％、8％、9％或10％。
步骤(2)所述助剂2的ph为5.0-7.5，例如可以是5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或7.5。
步骤(2)所述助剂2的缓冲液包括mes、mopso或pbs中的任意一种或至少两种的组合。
步骤(2)所述助剂2的无机盐包括kcl和/或nacl。
步骤(2)所述悬浊剂包括海藻糖、蔗糖或peg中的任意一种或至少两种的组合。
步骤(2)所述稳定剂包括bsa、明胶或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述助剂3的组分包括10-100mm的缓冲液、1-5％的无机盐、0.1-0.5％的防腐剂、1-5％的悬浮剂、1-5％稳定剂和0.01-1％表面活性剂。
所述缓冲液的浓度例如可以是10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm。
所述无机盐的浓度例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
所述防腐剂的浓度例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％。
所述悬浮剂的浓度例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
所述稳定剂的浓度例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
所述表明活性剂的浓度例如可以是0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
优选地，步骤(3)所述助剂3的缓冲液包括mops、pbs或taps中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述助剂3的无机盐包括kcl和/或nacl。
优选地，步骤(3)所述助剂3的悬浊剂包括海藻糖、蔗糖或peg中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述助剂3的防腐剂包括proclin300和/或nan3。
优选地，步骤(3)所述助剂3的稳定剂包括bsa、明胶或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述助剂3的表面活性剂包括tween-20、tween-80或tritonx-100中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述混匀的转速为20-50转/min，例如可以是20转/min、30转/min、40转/min或50转/min。
优选地，步骤(3)所述助剂3与步骤(2)分散后溶液的体积比为10:(9-11)。
其中，所述助剂1-3的制备方法为：分别称取各物质，溶于纯化水。
本发明中，发明人为实现微球、抗体和偶联剂混合体系的均匀和稳定，优化助剂的浓度和配方，筛选助剂1-3共三种不同配方的助剂，配合各步骤各混合液的需求，优选稳定剂、贮存剂和防腐剂的种类和浓度，各助剂相互配合，协同增效，最大程度促进微球试剂的稳定高效制备。
作为优选技术方案，一种微球试剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将微球溶液、β2微球蛋白抗体溶液和偶联剂溶液混合均匀1-72h，转速为20-50转/min，混合后微球浓度为0.1-0.5％，抗体浓度为0.1-0.5％，偶联剂浓度为0.1-1.0mg/l，超声分散，超声功率10-50％，超声开启时间为1-3s，超声关闭时间为3-6s，超声总时间为5-30min；
(2)向步骤(1)分散后的溶液加入助剂2，步骤(2)所述助剂2与步骤(1)分散后溶液的体积比为1:(9-11)，20-50转/min混匀1-5h后超声分散，超声功率10-50％，超声开启时间为1-3s，超声关闭时间为3-6s，超声总时间为5-30min；
(3)向步骤(2)分散后的溶液加入助剂3，步骤(3)所述助剂3与步骤(2)分散后溶液的体积比为10:(9-11)，转速为20-50转/min混匀后得到所述微球试剂。
第二方面，本发明提供一种微球试剂，所述微球试剂采用第一方面所述的方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括试剂r1和第二方面所述的微球试剂；
其中，所述试剂r1的组分包括10-100mm的缓冲液、1-5％的无机盐、0.01-0.1％的防腐剂和0.01-0.2％表面活性剂；
优选地，所述试剂r1的ph为6.0-8.0。
其中，缓冲液包括mes，mopso或pbs中的任意一种或至少两种的组合；无机盐包括kcl和/或nacl；防腐剂优选proclin300和/或nan3；表面活性剂包括tween-20、tween-80或tritonx-100中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供一种如第二方面所述微球试剂或第三方面所述试剂盒用于检测β2微球蛋白的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用的一步法制备β2微球蛋白的检测试剂，只需将微球、抗体和偶联剂混合，进过混匀、超声，再加入稳定剂、防腐剂、贮存剂等使所得体系稳定保存，各步骤各条件协同增效，操作简单，受设备的限制小，单次生产量大，有效的降低生产成本和提供了生产效率。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
1)将微球溶于助剂1中，记为混合液a；
2)将β2微球蛋白抗体溶于助剂1，记为混合液b；
3)将偶联剂溶于助剂1，记为混合液c；
4)将混合液a、b、c加入容器中混匀36h，转速为35转/min，混合后微球浓度为0.3％，抗体浓度为0.3％，偶联剂浓度为0.5mg/l，超声分散，超声功率35％，超声开启时间为2s，超声关闭时间为5s，超声总时间为20min；
5)加入十分之一体积的助剂2，继续混匀3h，转速为35转/min，超声分散，超声功率35％，超声开启时间为2s，超声关闭时间为5s，超声总时间为20min；
6)加入等体积的助剂3，转速为30转/min混匀，即为β2微球蛋白检测试剂盒r2。
实施例2
1)将微球溶于助剂1中，稀释至浓度为0.1％，记为混合液a；
2)将β2微球蛋白抗体溶于助剂1，稀释至浓度0.1％，记为混合液b；
3)将偶联剂溶于助剂1，稀释至浓度为1mg/ml，记为混合液c；
4)将混合液a、b、c加入容器中混匀1h，转速为20转/min，混合后微球浓度为0.1％，抗体浓度为0.1％，偶联剂浓度为0.1mg/l，超声分散，超声功率10％，超声开启时间为3s，超声关闭时间为3s，超声总时间为5min；
5)加入九分之一体积的助剂2，继续混匀1h，转速为20转/min，超声分散，超声功率10％，超声开启时间为3s，超声关闭时间为3s，超声总时间为5min；
6)加入九分之十体积的助剂3，转速为20转/min混匀，即为β2微球蛋白检测试剂盒r2。
实施例3
1)将微球溶于助剂1中，记为混合液a；
2)将β2微球蛋白抗体溶于助剂1，记为混合液b；
3)将偶联剂溶于助剂1，记为混合液c；
4)将混合液a、b、c加入容器中混匀72h，转速为50转/min，混合后微球浓度为0.5％，抗体浓度为0.5％，偶联剂浓度为1.0mg/l，超声分散，超声功率50％，超声开启时间为1s，超声关闭时间为6s，超声总时间为30min；
5)加入十一分之一体积的助剂2，继续混匀5h，转速为50转/min，超声分散，超声功率50％，超声开启时间为1s，超声关闭时间为6s，超声总时间为30min；
6)加入十一分之十体积的助剂3，转速为50转/min混匀，即为β2微球蛋白检测试剂盒r2。
对比例1
与实施例1相比，除了先用偶联剂活化微球，再加入抗体共价结合外，其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，除了微球的浓度改为1％外，其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，除了抗体的浓度改为1％外，其他条件与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，除了偶联剂的浓度改为2mg/ml外，其他条件与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，除了均不采用超声分散外，其他条件与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，除了将助剂1改为ph为3.0外，其他条件与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，除了将助剂2中稳定剂浓度改为1％外，其他条件与实施例1相同。
对比例8
与实施例1相比，除了将助剂3改为不含表面活性剂外，其他条件与实施例1相同。
对比例9
采用市售商品化试剂盒(北京利德曼的β2-微球蛋白测定试剂盒)进行检测。
实施例4
制备试剂r1：10-100mm缓冲液，无机盐，防腐剂，表面活性剂，ph＝6.0-8.0；其中，缓冲液优选mes，mopso，pbs；无机盐优选kcl，nacl；防腐剂优选proclin300，nan3；表面活性剂优选tween-20，tween-80，tritonx-100。
r1的制备方法：分别称取各物质，溶于纯化水，搅拌均匀。
实验检测
将实施例1-3和对比例1-8制得的微球试剂分别与实施例4制得的试剂r1组装成试剂盒，加上对比例9的市售试剂盒，进行实验检测；
试剂检测方法(以日立7170为例)：两点速率法；检测波长546nm；测光点18-26；血清样本量/r1/r2＝3/240/60；反应方向为上升。
表1
由表1可知，实施例1-3按照本发明提供的技术方案制备微球试剂，组装得到的试剂盒检测结果准确，与市售试剂盒结果基本一致，但制备方法更简洁；而对比例1和对比例5不采用本申请的操作顺序，对比例2-4的微球试剂的配方超范围，对比例6-8的助剂配方超范围，其组装得到的试剂盒的检测结果明显降低或升高，与市售试剂盒的标准结果相违背，表明本申请的制备方法中各组分各配方协同增效，缺一不可，搭配特定的实验步骤顺序，共同实现体系的稳定和检测结果的准确，降低了生产成本，提高了生产效率。
综上所述，本发明提供的一种微球试剂及其制备方法和应用，所述方法采用一步法制备微球试剂，优化实验操作方法，创造性地先将微球、抗体和偶联剂按照特定比例混合后，再进行超声混匀，各步骤各条件协同增效，实现分散均匀稳定的试剂体系，方法简洁高效，有效降低生产成本，提高生产效率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。