ang2作为索拉非尼治疗肝癌效果的指示分子的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及ang2作为索拉非尼治疗肝癌效果的指示分子的应用。

背景技术：

原发性肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率均高居各种恶性肿瘤前列。中国是肝癌的高发区，占全世界hcc患者总数的55％。众所周知，癌症难以根治的主要原因是局部复发和远处转移，癌细胞转移是肿瘤复发的主要原因。一般认为，肝脏丰富的血管系统以及肝癌活跃的血管生成，是肝癌患者易于发生血行转移的因素，尤其是早期肝内播散的重要因素。但是，已有的研究表明肝癌中微血管的数量与肝癌复发转移的相关性存在争议。而我们发现：肝癌中存在vetc(sinusoid-likevesselsthatformacobweb-likepatternandencapsulatetumorclusters，内皮细胞包绕肿瘤团块，即肿瘤包绕型血管)和经典的毛细血管两种血管结构。vetc血管呈网络状连接，将肿瘤块包绕分割。在40％-50％肝癌患者肿瘤组织中均出现vetc结构血管。与不具有vetc结构的(vetc^-)肝癌患者相比，具有vetc结构的(vetc⁺)肝癌患者具有更多肝内转移灶，行根治性切除术后复发率更高、生存时间更短。此外，我们发现vetc结构中被血管包绕的肿瘤团块能够直接进入血液循环，通过不依赖emt的方式进行转移。

我们的早期研究发现，angiopoietin-2(ang-2)是影响vetc血管形成的重要分子。angiopoietin/tie是血管生成尤其是肿瘤血管生成的重要调控通路。其中，ang2能够竞争性的结合tie-2，使内皮细胞由静息态变为激活状态，开始增殖和出芽，生成新的血管。同时ang2还可以降低壁细胞的覆盖，使血管表现出不成熟的特征。目前多数研究认为ang2主要起到一个促肿瘤的作用，肿瘤中ang-2的高表达与其活跃的血管生成密切相关。ang2在vetc的形成过程中也起着关键的作用。在vetc肝癌组织中ang2表达显著高于非vetc肝癌，此外，动物实验中敲低ang2显著抑制vetc的形成，提示ang-2可作为判断vetc肝癌的分子标记。

索拉非尼(甲苯磺酸索拉非尼，4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)-n2-甲基吡啶-2-羧酰胺-4-甲苯磺酸盐，分子式为c21h16clf3n4o3·c7h8o3s)是晚期肝癌临床治疗的一线用药，其属于激酶抑制剂类药物，能够通过抑制肿瘤的生长和血管生成，延长病人的生存时间。但是，其治疗效果有限，根据已有临床实验报道来看，在sharp(sorafenibhepatocellularcarcinomaassessmentrandomizedprotocol)试验中，索拉非尼对肝癌病人中位总存时间仅提高2.8个月；在亚太地区的进展性肝癌iii期临床实验中，索拉非尼仅提高病人中位总生存时间2.3个月。此外，索拉非尼临床治疗的效果也具有个体差异。因此，筛选指导肝癌索拉非尼治疗的分子标志物十分必要，以便医护人员能够简便快速地判断和了解使用索拉非尼后，癌症病情是否得到缓解，以掌握患者的存活时间，以及是否改变用药量。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种用于指示索拉非尼对肝癌治疗效果的分子标记物，尤其是用于指示索拉非尼对vetc血管类型肝癌的治疗效果，以便医护人员可以直接通过调查该指示分子的表达量，从而确认索拉非尼对肝癌的治疗效果，尤其是明确vetc血管类型肝癌的治疗效果，有助于医生对患者生存时间的判断。

本发明的技术方案如下：

本发明提供索拉非尼在治疗vetc血管类型肝癌药物中的应用。

在另一实施方案中，本发明还提供肝癌患者血浆或血清中ang2的表达水平作为索拉非尼治疗效果的分子标志物的应用。

在另一实施方案中，本发明还提供一种包含ang2特异抗体或探针的试剂在检测vetc血管类型肝癌中的应用。

在另一实施方案中，本发明还提供一种包含ang2特异抗体或探针的试剂盒在预测索拉非尼治疗肝癌效果中的应用。

附图说明

图1为肝癌病人vetc⁺/vetc^-血管结构示意图；

图2为cohort1及cohort2中vetc⁺/vetc^-肝癌病人使用索拉非尼治疗后，总的生存时间曲线图；

图3为vetc⁺/vetc^-肝癌中，血管内皮细胞分子标记cd34和ang2的免疫组化图及表达量统计图；

图4为elisa检测肝癌病人血浆中ang2表达量的统计图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明解释本发明，而不以任何形式限制本发明。

本发明所采用的ang2免疫组化特异抗体由abcam公司(美国)购得；cd34免疫组化抗体由北京中衫公司(中国)购得；血浆中ang2的elisa检测试剂盒由r&d公司(美国)购得。

本发明所称的索拉非尼是指甲苯磺酸索拉非尼，其全称为4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)-n2-甲基吡啶-2-羧酰胺-4-甲苯磺酸盐。

实施例1索拉非尼对vetc⁺/vetc^-肝癌患者的治疗效果分析

1.1免疫组化检测肝癌组织血管类型

人肝癌组织的切片由中山大学附属肿瘤医院标本库提供。制成石蜡切片4℃保存。后续检测步骤为：

(1)预处理：取出55℃烤片1h，放于二甲苯中脱蜡两次，每次10min；依次用100％、95％、90％、80％、70％的乙醇洗一次，每步3min，后用双蒸水洗3min；0.3％的双氧水处理10min，双蒸水再洗3次，每次3min；浸泡于修复液中，用微波炉进行热修复，室温冷却半小时；用1×pbs洗三次，每次3min；

(2)杂交染色：用cd34抗体进行孵育，4℃过夜；恢复室温，弃去抗体液，用1×pbs洗三次，每次5min；加入二抗，37℃半小时；用1×pbs洗三次，每次5min；加入dab显色液进行显色，然后用苏木精复染；

(3)计数：cd34染色判断肝癌血管类型为vetc⁺型还是vetc^-型，可具体参照如图1所示的vetc⁺/vetc^-肝癌血管形状进行判断。

其中，cohort1人肝癌组织的切片及病理资料由中山大学附属肿瘤医院标本库提供。cohort2人肝癌组织的切片及病理资料由中山大学附属第三医院、东方肝胆外科医院、广州医科大学肿瘤中心标本库提供。

1.2结果分析

分别分析cohort1、cohort2中vetc⁺/vetc^-肝癌病人使用索拉非尼治疗后，总的生存时间差异。所有患者均使用拜耳公司生产的甲苯磺酸索拉非尼进行治疗，给药剂量按照药品说明书进行。

如图2所示，在cohort1293例肝癌病人中，139例vetc⁺肝癌病人中索拉非尼治疗后病人总生存时间显著提高(p＝0.005，hr＝0.567)，而在154例vetc^-肝癌病人中索拉非尼治疗组与对照组病人总生存时间并无显著差异(p＝0.205，hr＝0.761)；在cohort2164例肝癌病人中，83例vetc⁺肝癌病人中索拉非尼治疗后病人总生存时间显著提高(p＝0.007，hr＝0.408)，而在81例vetc^-肝癌病人中索拉非尼治疗组与对照组病人总生存时间并无显著差异(p＝0.550，hr＝1.221)。以上结果均表明，索拉非尼在vetc⁺肝癌病人具有更好的治疗效果。

以上结果表明，索拉非尼在vetc⁺肝癌病人具有良好的治疗效果，而对于vetc^-肝癌患者则无显著疗效。这一方面直接表明索拉非尼可用于治疗vetc⁺肝癌患者；另一方面表明可通过肝癌患者的vetc血管类型判断索拉非尼治疗肝癌患者的预后情况。

实施例2：人组织标本ang2表达指示肝癌组织血管类型

2.1免疫组化检测

人肝癌组织的切片由中山大学附属肿瘤医院标本库提供。制成石蜡切片4℃保存。后续检测步骤为：

(1)预处理：取出55℃烤片1h，放于二甲苯中脱蜡两次，每次10min；依次用100％、95％、90％、80％、70％的乙醇洗一次，每步3min，后用双蒸水洗3min；0.3％的双氧水处理10min，双蒸水再洗3次，每次3min；浸泡于修复液中，用微波炉进行热修复，室温冷却半小时；用1×pbs洗三次，每次3min；

(2)杂交染色：用ang2抗体进行孵育，4℃过夜；恢复室温，弃去抗体液，用1×pbs洗三次，每次5min；加入二抗，37℃半小时；用1×pbs洗三次，每次5min；加入dab显色液进行显色，然后用苏木精复染；

(3)计数：ang2染色后400倍镜下随机拍10个视野，通过imagineproplus软件计数ang2阳性面积。

2.2elisa检测

人肝癌血浆样品由中山大学附属肿瘤医院标本库提供。后续检测步骤为试剂盒提供，具体如下：

(1)加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤；其中，空白对照组为空白孔，仅加入显色液；阴性对照组为样品稀释液；实验组为经样品稀释液稀释的样品检测液；

(2)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的一抗0.1ml，37℃孵育2小时后洗涤，加入二抗工作液0.1ml，37℃孵育1小时后，洗涤；

(3)加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的tmb底物溶液0.1ml，室温15-30分钟。

(4)结果判定：在elisa检测仪上，于450nm处测定各个样品孔的od值。

2.3结果分析

实验a，如图3所示，我们共检测了140份肝癌组织标本，通过用cd34染色血管内皮细胞，观察血管形态并分型，发现所检测的肝癌组织中有53份(38％)为vetc⁺血管类型，有87份(62％)为vetc^-血管类型。通过imagineproplus软件计数ang2阳性值，与血管类型进行相关性分析，我们发现形成vetc⁺血管的肝癌组织ang2的平均表达值0.073，而形成vetc^-血管的肝癌组织其平均表达值为0.022，vetc⁺组织显著高表达ang2(p<0.001，t检验)。

实验b，如图4所示，我们共检测了69份肝癌病人的血浆标本，通过用cd34染色血管内皮细胞，观察血管形态并分型，发现所检测的肝癌组织中有32份(46％)为vetc⁺血管类型，有37(54％)为vetc^-血管类型。通过酶标仪读取ang2的光密度值，与血管类型进行相关性分析，我们发现形成vetc⁺血管的肝癌组织ang2的平均光密度值为0.22，而形成vetc^-血管的肝癌组织其平均光密度值为0.14，vetc⁺肝癌病人的血浆中显著高表达ang2(p<0.01，t检验)。

上述结果显示，vetc血管类型肝癌病人组织或血浆中，ang2的表达量(即表达水平)高。因此，ang2的水平可以作为vetc血管类型肝癌的指示分子，即ang2可作为鉴定vetc血管的标记分子，预测肝癌索拉非尼治疗的效果。

实施例3

本发明提供的一种用于检测vetc血管类型肝癌的试剂，该试剂含有ang2的特异抗体或探针。使用该试剂检测肝癌类型时，抽取患者的血液，将该试剂运用于患者的血浆或血清中，然后检测患者血浆或血清中ang2的表达量。

若ang2的表达量高于某一值，则可以初步判断，患者可能患有vetc血管类型肝癌，为了确诊，可以进行进一步检测；若ang2的表达量低于某一值，则可以初步判断，患者所患肝癌可能不是vetc血管类型肝癌；为了确诊，可以进行进一步检测。

实施例4

本发明提供的一种预测索拉非尼治疗肝癌效果的试剂盒，该试剂盒含有ang2的特异抗体或探针。使用该试剂盒预测索拉非尼治疗肝癌效果时，抽取患者的血液，将ang2的特异抗体或探针运用于患者的血浆或血清中，然后检测患者血浆或血清中ang2的表达量。

若ang2的表达量高达某一值，则可以初步判断，患者所患肝癌可能为vetc血管类型肝癌，由于索拉非尼对vetc血管类型肝癌主要良好的治疗作用，因此，可以预测索拉非尼对肝癌的治疗效果好，患者还具有相对较长的生命时间；若ang2的表达量低于某一值，则可以初步判断，患者所患肝癌可能不是vetc血管类型肝癌，可以预测索拉非尼对肝癌的治疗效果相对较弱，患者具有相对较短的生命时间。