一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法与流程

本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

背景技术：

广泛分布于亚洲，尤其在日本、中国等地区爆发成灾的水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的水稻条纹病毒((ricestripevirus，rsv)引起的。该病毒在水稻苗期感染直接导致稻苗枯死，后期感染的水稻虽不枯死，但破坏水稻的生殖生长，造成抽穗不正常，并以秕谷为主，严重影响水稻产量。因此，该病毒病是威胁我国水稻生产的重要病毒病害。水稻条纹病毒是纤细病毒属的典型成员，由灰飞虱以持久性方式并经卵传播，能侵染水稻、小麦等20多种禾本科植物。水稻条纹病毒可在灰飞虱体内繁殖，灰飞虱一旦获毒，即终身带毒、高效传毒，且可经卵传播。而rsv的快速实用检测技术是该病毒诊断、抗性品种选育、病害流行规律调查、科学防控体系建立的关键。目前一般采用田间症状观察、rt-pcr检测、电镜观察和dot-elisa血清学方法来检测诊断该病毒。田间症状观察准确性低，且病毒感染前期水稻等植物没有症状表现，rt-pcr和电镜观察均需要精密仪器和专业的操作人员，只适用于实验室小样本的检测。目前只有dot-elisa血清学方法适用于田间大批量样品的检测，但其耗时还是较长，而胶体金免疫试纸条操作简单、不用任何仪器、完成样品检测在3-5min内，检测结果用肉眼观察判断，十分适于基层单位和农民田间应用。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条，其中：免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记抗水稻条纹病毒单抗的聚酯膜，硝酸纤维素膜的检测线即t线上结合抗水稻条纹病毒单抗，质控线即c线上结合有羊抗鼠igg。

该胶体金免疫试纸条，能准确、特异、灵敏地检测水稻、小麦和灰飞虱体内的水稻条纹病毒，且其检测水稻病叶组织粗提液的灵敏度达到1:20,480倍稀释，单位为克/ml，检测单头携毒灰飞虱的灵敏度达到1:5,120倍稀释，单位为头/μl。

该胶体金免疫试纸条，检测感染水稻条纹病毒的水稻、小麦和灰飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒的小麦和健康小麦、无rsv病毒的灰飞虱、携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱、携带水稻条纹花叶病毒或水稻瘤矮病毒电光叶蝉、携带水稻齿叶矮缩病毒褐飞虱均呈阴性结果。

另外，本发明还提供了一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法，其包括以下步骤：

1)胶体金溶液制备：将50ml0.01％氯金酸加热沸腾，加入0.55ml1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

2)水稻条纹病毒免疫胶体金溶液制备：取50ml所述胶体金溶液，用0.1mk2co3将其ph值调至7.8，边搅拌边加入2ml1mg/ml的抗水稻条纹病毒单抗，搅拌30min；再逐滴加入1ml25m分子量为20000的聚乙二醇即peg溶液，再搅拌15min；4℃20000rpm离心15min，弃上清液，加入10mlph7.4且含0.4mpeg20000的pbs缓冲液悬浮，4℃20000rpm离心15min，去上清，沉淀重复用pbs缓冲液悬浮、离心，再用5mlph7.4且含2％bsa的pbs缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为免疫胶体金溶液，于4℃保存备用；

3)将上述水稻条纹病毒免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释8倍，用喷金机按2.3μl/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成水稻条纹病毒免疫胶体金垫；

4)将1.0mg/ml抗水稻条纹病毒单抗用含5％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释6倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即t线上；1.2mg/ml的羊抗鼠igg用含2％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即c线上，使t线和c线相距5mm；

5)将吸水滤纸制成的样品垫、水稻条纹病毒免疫胶体金垫、点有t线和c线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到pvc胶板上，然后切割成60mm×3mm的条带后组装成试纸条。

上述方法中的水稻条纹病毒单抗可以通过如下方法制备：从感染水稻条纹病毒的水稻植物组织中提纯病毒粒子作为抗原免疫balb/c小鼠，经细胞融合、筛选、细胞克隆杂交瘤技术获得抗rsv单克隆抗体。当然，现有技术中具有水稻条纹病毒单抗的制备方法报道，可以根据其记载方法进行制备，均可以制备出胶体金免疫试纸条，但效果可能存在差异。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)本发明专利国内外首次开发成rsv的胶体金免疫试纸条，且该胶体金免疫试纸条能准确、特异、灵敏地检测水稻、小麦及灰飞虱样品中的rsv；2)利用本发明所述的胶体金免疫试纸条检测rsv，不需要任何仪器，且操作简单、快速，仅需3-5min即可完成包括样品处理在内的样品检测，且检测结果用肉眼直接观察，更适于基层单位和农民田间的应用。

附图说明

图1水稻条纹病毒胶体金免疫试纸条的结构示意图。

图中：1：样品垫，2：胶体金结合垫，3：硝酸纤维素(nc)膜，4：检测线(t线)，5：控制线(c线)，6：吸水纸，7：不干胶，8：pvc底板。

图2水稻条纹病毒胶体金免疫试纸条检测水稻和灰飞虱体内rsv的特异性分析结果。

图中a：rsv、srbsdv、rbsdv、rrsv、rgdv、rsmv、rdv和rice分别代表感染水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻瘤矮病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻矮缩病毒水稻和健康水稻；cwmv、wymv、wdv和wheat分别代表感染中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒的小麦和健康小麦。b：sbph、wbph和bph分别代表灰飞虱、白背飞虱和褐飞虱。

图3水稻条纹病毒胶体金免疫试纸条检测田间水稻和灰飞虱体内rsv的灵敏度分析结果。

图中a：建立的试纸条感染rsv水稻植物的灵敏度分析结果；b：建立的试纸条检测携带rsv单头灰飞虱的灵敏度分析结果。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

如图1所示，快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条由样品垫1、胶体金结合垫2、硝酸纤维素(nc)膜、检测线(t线)4、控制线(c线)5、吸水纸6、不干胶7和pvc底板8组成。其中，免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记抗水稻条纹病毒单抗的聚酯膜，硝酸纤维素膜的检测线即t线上结合抗水稻条纹病毒单抗，质控线即c线上结合有羊抗鼠igg。

本发明的水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条能准确、特异、灵敏地检测水稻、小麦和灰飞虱体内的水稻条纹病毒，且其检测水稻病叶组织粗提液的灵敏度可达到1:20,480倍稀释，单位为克/ml，检测单头携毒灰飞虱的灵敏度可达到1:5,120倍稀释，单位为头/μl。

本发明的水水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条检测感染水稻条纹病毒的水稻、小麦和灰飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒的小麦和健康小麦、无rsv病毒的灰飞虱、携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱、携带水稻条纹花叶病毒或水稻瘤矮病毒电光叶蝉、携带水稻齿叶矮缩病毒褐飞虱均呈阴性结果。

快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法的步骤：

1)水稻条纹病毒单抗的制备：从感染水稻条纹病毒的水稻植物组织中提纯的病毒粒子为抗原免疫balb/c小鼠，经细胞融合、筛选、细胞克隆杂交瘤技术获得抗rsv单克隆抗体；

2)胶体金溶液制备：将50ml0.01％氯金酸加热沸腾，加入0.55ml1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

3)水稻条纹病毒免疫胶体金溶液制备：取50ml胶体金溶液，用0.1mk2co3将其ph值调至7.8，边搅拌边加入2ml1mg/ml的抗水稻条纹病毒单抗，搅拌30min；再逐滴加入1ml25m分子量为20,000的聚乙二醇即peg溶液，再搅拌15min；4℃20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mlph7.4含0.4mpeg20,000的pbs缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清，沉淀用pbs缓冲液悬浮、离心，再重复1次，用5mlph7.4含2％bsa的pbs缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为免疫胶体金溶液4℃保存备用；

4)将上述水稻条纹病毒免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释8倍，用喷金机按2.3μl/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成水稻条纹病毒免疫胶体金垫；

5)将1.0mg/ml抗水稻条纹病毒单抗用含5％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释6倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即t线上；1.2mg/ml的羊抗鼠igg用含2％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即c线上，使t线和c线相距5mm；

6)将吸水滤纸制成的样品垫、水稻条纹病毒免疫胶体金垫、点有t线和c线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到pvc胶板上，然后切割成60mm×3mm的条带后组装成试纸条。

本发明提供的试纸条能准确、特异、灵敏地检测田间水稻、小麦及灰飞虱样品中的rsv，且操作简单、快速，不需要任何仪器，完成样品的检测时间仅需3-5min，且用肉眼直接观察判断结果，非常适用于基层单位和农民田间应用，从而为水稻条纹叶枯病的诊断、早期监测和预警、抗病育种、流行病学研究及科学防治提供技术和物质支撑。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、胶体金免疫试纸条的制备步骤

一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)rsv单克隆抗体的制备：rsv病毒的提纯和rsv单抗制备方法参照申请人实验室发表的论文【水稻条纹病毒单克隆抗体的制备及检测应用.植物病理学报.2004,34(4)：302-306】的方法，经细胞融合、筛选、克隆，获得2株抗rsv单抗(分别记为16e6和11c1)；

(2)胶体金溶液制备：将50ml0.01％氯金酸加热沸腾，加入0.55ml1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

(3)水稻条纹病毒免疫胶体金溶液制备：取50ml胶体金溶液，用0.1mk2co3将其ph值调至7.8，边搅拌边加入2ml1mg/ml的抗水稻条纹病毒16e6单抗，搅拌30min；再逐滴加入1ml25m分子量为20,000的聚乙二醇即peg溶液，再搅拌15min；4℃20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mlph7.4含0.4mpeg20,000的pbs缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清，沉淀用pbs缓冲液悬浮、离心，再重复1次后，用5mlph7.4含2％bsa的pbs缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为免疫胶体金溶液4℃保存备用；

(4)将上述水稻条纹病毒免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释8倍，用喷金机按2.3μl/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成水稻条纹病毒免疫胶体金垫；

(5)将1.0mg/ml抗水稻条纹病毒11c1单抗用含5％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释6倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即t线上；1.2mg/ml的羊抗鼠igg用含2％蔗糖的0.01mph7.4pbs缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即c线上，使t线和c线相距5mm；

(6)将吸水滤纸制成的样品垫、水稻条纹病毒免疫胶体金垫、点有t线和c线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到pvc胶板上，然后切割成60mm×3mm的条带后组装成图1所示试纸条。

二、水稻条纹病毒胶体金免疫试纸条检测rsv的步骤及其特异性和灵敏度分析

1、水稻条纹病毒胶体金免疫试纸条检测rsv的步骤：

1.样品制备：

1)植物样品的制备：老的水稻、小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加4ml的比例加入0.01mpbs(ph7.4)后研钵中继续研磨匀浆1min；嫩的水稻、小麦植物组织称重后按0.1g植物组织加4ml的比例加入0.01mpbs(ph7.4)后研钵中研磨匀浆2min；匀浆液移至1.5mleppendorf离心管中，5,000rpm离心3min，或静置5min；

2)灰飞虱样品的制备：一头灰飞虱放入一个0.5ml的eppendorf离心管中后加入150-200μl0.01mpbs，用牙签粗端或200μl枪头捣烂飞虱呈匀浆液；

2.点样：取1根胶体金免疫试纸条平放，用吸管吸取植物样品上清液或灰飞虱匀浆液滴3滴(约150-300μl)于加样孔中；

3.肉眼观察判断结果：3-5min内肉眼观察判断结果，即t线和c线同时出现红色条带的样品为阳性，c线出现红色条带而t线未出现红色条带样品为阴性。若c线和t线均未出现红色条带，或仅在t线出现红色条带而对c线不出现红色条带时说明试纸条失效。

2、水稻条纹病毒胶体金免疫试纸条检测水稻和灰飞虱体内rsv的特异性分析

以感染rsv的水稻和健康水稻植物组织的粗提液分别为阳性和阴性对照，用试纸条检测感染水稻条纹病毒的小麦和灰飞虱、感染水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒的小麦和健康小麦、无rsv病毒的灰飞虱、白背飞虱、电光叶蝉、褐飞虱。检测结果显示，水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条检测感染水稻条纹病毒的水稻、小麦和灰飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒小麦和健康小麦、无rsv病毒的灰飞虱、携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱、携带水稻条纹花叶病毒或水稻瘤矮病毒电光叶蝉、携带水稻齿叶矮缩病毒褐飞虱均呈阴性结果，结果如图2所示。

3、水稻条纹病毒胶体金免疫试纸条检测水稻和灰飞虱体内rsv的灵敏度分析将感染rsv的水稻植物组织粗提液上清按1:20-1:40,960倍比稀释(w/v,g/ml),以对应稀释度的水稻健康植物粗提液上清为阴性对照；或将携带rsv的灰飞虱按1:160-1:40,960(头/μl)倍比稀释,以对应稀释度的无毒灰飞虱为阴性对照，用吸管吸取植物样品提取液上清和灰飞虱匀浆液，滴3滴于试纸条加样孔中，结果显示当水稻病叶稀释至1:20,480(w/v,g/ml)、单头带毒灰飞虱稀释到1:5,120μl时，该试纸条检测t线仍能出现红色的条带，即该检测试纸条对于水稻病组织的检测灵敏度达1:20480倍稀释(w/v,g/ml)，对于带毒灰飞虱的检测灵敏度达1:5,120μl倍稀释(头/ml)，结果如图3所示，表明本发明的检测试纸条具有高度的灵敏性和可靠性。