一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用。

背景技术：

水稻病毒病是水稻植物重要病害之一，每年对我国水稻产量造成了严重损失。2015年，在广东省罗定市田间发现了一种新的水稻病毒病害，它的症状不同于已报道各种水稻病毒病，其为弹状病毒科细胞质弹状病毒属一个新种，命名为水稻条纹花叶病毒(ricestripemosaicvirus,rsmv)。就目前所知，该病毒是迄今为止唯一自然侵染水稻的细胞质弹状病毒，也是首个经电光叶蝉传播的细胞质弹状病毒。rsmv感染植株轻度矮缩，叶片呈条纹花叶状，且有部分病叶表现扭曲，病株可抽穗，但抽穗不完全且籽粒空瘪。3叶期稻苗经电光叶蝉传毒接种后10天，新叶出现明显黄色条纹，随后叶片表现为花叶，叶尖向内侧卷曲。

rsmv病毒粒子呈杆状，在叶肉细胞及维管束系统细胞质中聚集并形成大量的晶格状，几乎充满整个细胞质空间，而细胞核内未观察到病毒粒子。有些病毒粒子聚集在囊泡内。在rsmv基因组的互补链上预测有7个orfs，推测这7个orfs的编码蛋白与多数弹状病毒的编码蛋白相似，orf1预测编码病毒n蛋白；orf2编码病毒的p蛋白；orf3编码蛋白是一个碱性的膜蛋白，且该蛋白可能具有运动蛋白的功能；orf4推测编码m蛋白；orf5预测编码病毒g蛋白；orf6推测编码一个辅助蛋白；orf7预测编码病毒的l蛋白。rsmv的传播介体是电光叶蝉，其能以高效持久的方式传播rsmv。

目前，根据症状观察判断田间水稻条纹花叶病毒的发生情况仍然是最主要的方法，但病毒侵染前期水稻没有任何症状，且多种病毒病造成的症状极为相似，另外，常有病毒复合侵染情况，因此依靠症状观察得到的结果缺乏准确性和科学性。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且有些不同病毒粒子的大小和形态有相似性，导致其仅作为一种辅助检测手段。基于pcr方法的分子检测技术虽然灵敏，但是不适于大规模样品的检测，仅适合实验室对小样本的检测。而血清学方法简单易操作、快速、灵敏、成本较低，且适用于田间样品的大规模检测，是目前理想的植物病毒的检测技术。为此，本发明专利利用胶体金标记的申请人已申请专利申请号为201810134449.5的单抗1d4，成功建立检测该病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹检测技术及其检测试剂盒，从而为我国水稻条纹花叶病毒的检测诊断、预测预警、抗病育种及科学防控提供物质和技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术及其应用。

一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，具体为：用胶体金标记抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1d4作为检测抗体；所述的抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1d4由杂交瘤细胞株分泌，该杂交瘤细胞株于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14898。

其中，用胶体金标记抗体包括如下步骤：

1)胶体金溶液制备：将100ml0.01％氯金酸加热至沸腾，加入1.2ml1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min后氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

2)取50ml所述胶体金溶液，用0.1mk2co3将其ph值调至8.2；

3)调好ph值的胶体金溶液中边搅拌边加入2mligg浓度为2mg/ml的所述的特异性单抗1d4，搅拌30min；再逐滴加入1ml25m分子量为20000的聚乙二醇即peg溶液，再搅拌15min；

4)然后将3)中得到的混合液，于4℃20000rpm离心15min，弃上清液，加入10mlph7.4且含0.4mpeg20000的0.01mpbs缓冲液悬浮，于4℃20000rpm离心15min，去上清获得沉淀；

5)将沉淀重复用0.01mpbs缓冲液悬浮，离心；

6)用10mlph7.5且含2％bsa和0.02％叠氮化钠的pbs缓冲液溶解5)中得到的沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为胶体金标记抗体溶液，4℃保存备用。

其中，利用上述胶体金标记抗体溶液进行水稻条纹花叶病毒检测的方法具体包括如下步骤：

1)硝酸纤维素(nc)膜准备：用铅笔在nc膜外层纸上划线，使nc膜印上方格线痕迹，每格规格0.3×0.3cm，平整放于干净的滤纸上；

2)样品制备：

a)植物样品的制备：将水稻或小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加2ml的比例加入ph7.4的0.01mpbs后研钵中继续研磨匀浆1min，得到匀浆液；或者将水稻或小麦植物组织称重后按0.1g植物组织加2ml的比例加入0.01mpbs后于研钵中研磨匀浆2min，得到匀浆液；将匀浆液移至1.5ml离心管中，5000rpm离心3min，或静置5min，上清即为水稻或小麦植物组织的粗提液；

b)传毒介体电光叶蝉样品的制备：一头电光叶蝉放入一个0.5ml的离心管中后加入50-100μl0.01mpbs，用牙签粗端或200μl枪头捣烂叶蝉呈匀浆液；

3)点样：用移液器吸取水稻或小麦植物组织的粗提液以及电光叶蝉匀浆液各3μl，点样于nc膜的格子中央，室温下干燥10min；

4)封闭：使用按5g脱脂奶粉加100mlpbst缓冲液的比例配制得到5％的脱脂奶粉封闭液，所述pbst缓冲液为含0.05％tween-20的0.01mol/lpbs；nc膜在封闭液中室温下封闭0.5-1h；

5)洗涤：去封闭液，用pbst缓冲液洗膜2次，每次3min；

6)胶体金标记抗体孵育：nc膜放入用0.01mol/lpbs稀释2000倍的胶体金标记抗体溶液中，于水平摇床上缓慢摇动室温孵育1h；

7)洗涤：去胶体金标记抗体溶液，用pbst缓冲液洗膜4-5次，每次3min；

8)观察判断结果：出现红色斑点的样品为阳性，无色或绿色斑点的样品为阴性。

上述方法检测感染rsmv水稻病叶灵敏度达到1:40960倍稀释，单位为w/v,g/ml，检测单头携带rsmv电光叶蝉的灵敏度达到1:5120倍稀释，单位为单头/μl；

上述方法检测感染水稻条纹花叶病毒的水稻和电光叶蝉组织呈强阳性反应，而检测感染水稻条纹病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻锯齿矮缩病毒、水稻瘤矮病毒、水稻矮缩病毒以及健康水稻植物组织和非携毒电光叶蝉组织均呈阴性反应。

本发明还提供了一种上述斑点免疫印迹方法的应用，其特征在于利用该方法或根据该方法设计的试剂盒，对田间水稻和传毒介体电光叶蝉的带毒情况进行检测诊断，确定水稻和电光叶蝉的带毒率，预测预警水稻条纹花叶病在田间的发生流行趋势。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)本发明提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其检测试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测水稻条纹花叶病毒；2)利用本发明所提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，不需要昂贵的电子显微镜、pcr仪等设备；3)利用本发明提供的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其试剂盒，可有效地用于田间水稻及传毒介体电光叶蝉体内rsmv的检测和诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面；4)提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，不需要传统的dot-elisa和acp-elisa等免疫学方法的酶标抗体及底物显色反应，因而，检测步骤更加简单和检测时间大大缩短。

附图说明

图1是检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术的灵敏度分析；

图2是检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术的特异性分析：1、2分别为感染rsmv的水稻植物和感染rsmv的电光叶蝉；3-6分别为感染水稻条纹病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻锯齿矮缩病毒、水稻瘤矮病毒、水稻矮缩病毒的水稻病叶组织；9、10分别为健康的水稻植物组织和非携毒电光叶蝉组织。

图3是检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术检测田间样品中rsmv的结果。

具体实施方式

下面通过附图和实施例进一步对本发明进行详细说明。本发明中所用到的试剂盒材料，若没有特殊说明，均可以采用市售产品。本发明中的百分数，若没有特殊说明，均指质量百分数。

一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，该方式利用胶体金标记抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1d4作为检测抗体，进而检测水稻条纹花叶病毒。该特异性单抗1d4由分泌抗水稻条纹花叶病毒单抗杂交瘤细胞分泌，记载于专利申请号为201810134449.5的中国发明专利申请中。该分泌抗水稻条纹花叶病毒单抗杂交瘤细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日为2017年12月15日，保藏号为cgmccno.14898。

在该检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法中，胶体金标记抗体的标记步骤：

1)胶体金溶液制备：将100ml0.01％氯金酸加热至沸腾，加入1.2ml1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min后氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

2)取50ml胶体金溶液，用0.1mk2co3将其ph值调至8.2；

3)调好ph值的胶体金溶液中边搅拌边加入2mligg浓度为2mg/ml的上述抗水稻条纹花叶病毒的单抗1d4，搅拌30min；再逐滴加入1ml25m分子量为20,000的聚乙二醇即peg溶液，再搅拌15min；

4)将上一步混合液于4℃20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mlph7.4含0.4mpeg20,000的0.01mpbs缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清；

5)沉淀用0.01mpbs缓冲液悬浮、离心，并重复1次；

6)用10mlph7.5含2％bsa和0.02％叠氮化钠的pbs缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为胶体金标记抗体溶液，4℃保存备用；

检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法中，具体的检测步骤如下：

1)硝酸纤维素(nc)膜准备：用铅笔在nc膜外层纸上划线，使nc膜印上方格线痕迹，每格规格0.3×0.3cm，平整放于干净的滤纸上；

2)样品制备：

a)植物样品的制备：老的水稻、小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加2ml的比例加入ph7.4的0.01mpbs后研钵中继续研磨匀浆1min；嫩的水稻、小麦植物组织称重后按0.1g植物组织加2ml的比例加入0.01mpbs后研钵中研磨匀浆2min；匀浆液移至1.5mleppendorf离心管中，5,000rpm离心3min，或静置5min，上清即为水稻或小麦植物组织的粗提液；

b)传毒介体电光叶蝉样品的制备：一头电光叶蝉放入一个0.5ml的eppendorf离心管中后加入50-100μl0.01mpbs，用牙签粗端或200μl枪头捣烂叶蝉呈匀浆液；

3)点样：用移液器吸取水稻或小麦植物组织的粗提液，以及电光叶蝉匀浆液各3μl，点样于nc膜的格子中央，室温下干燥10min；

4)封闭：使用按5g脱脂奶粉加100mlpbst缓冲液(含0.05％tween-20的0.01mol/lpbs)的比例配制得到5％的脱脂奶粉封闭液，nc膜在封闭液中室温下封闭0.5-1h；

5)洗涤：去封闭液，用pbst缓冲液洗膜2次，每次3min；

6)胶体金标记抗体孵育：nc膜放入用0.01mol/lpbs稀释1:2000倍的胶体金标记抗体溶液中于水平摇床上缓慢摇动室温孵育1h；

7)洗涤：去胶体金标记抗体溶液，用pbst缓冲液洗膜4-5次，每次3min；

8)肉眼观察判断结果：出现红色斑点的样品为阳性，无色或绿色斑点的样品为阴性。

检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术检测感染rsmv水稻病叶灵敏度达到1:40960倍稀释，单位为w/v,g/ml，检测单头携带rsmv电光叶蝉的灵敏度达到1:5120倍稀释，单位为单头/μl；

检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术检测感染水稻条纹花叶病毒的水稻和电光叶蝉组织呈强阳性反应，而检测感染水稻条纹病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻锯齿矮缩病毒、水稻瘤矮病毒、水稻矮缩病毒以及健康水稻植物组织和非携毒电光叶蝉组织均呈阴性反应。

检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术及其试剂盒对田间水稻和传毒介体电光叶蝉的带毒情况进行检测诊断，确定水稻和电光叶蝉的带毒率，预测预警水稻条纹花叶病在田间的发生流行趋势并及时采取科学防治措施。

本发明提供的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术及其检测试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测田间水稻及传毒介体电光叶蝉体内水稻条纹花叶病毒，也可用于该病毒病的流行病学调查、预测预警、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面，且不需要昂贵的电子显微镜、pcr仪等设备，不需要传统的dot-elisa和acp-elisa等免疫学方法的酶标抗体及底物显色反应，因而检测步骤更加简单和检测时间大大缩短。从而为我国rsmv的检测诊断、预测预警和科学防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、胶体金标记抗体的制备

1.单克隆抗体腹水制备及纯化

(1)取8周龄balb/c小鼠，腹腔注射0.3ml降植烷，7-10d后腹腔注入6×10⁵个能分泌抗rsmv单抗的杂交瘤细胞(来自本专利申请人的申请中国专利201810134449.5)，注射后7-10d可见小鼠腹部明显膨大，针头采取腹水，3000rpm离心1min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。

(2)饱和硫酸铵法纯化单抗腹水(以1ml为例)

1)取1ml腹水5000rpm4℃离心5min，取上清，加入2ml生理盐水稀释；

2)逐滴加入ph值在7.0-7.4的饱和硫酸铵溶液3ml，边加边搅拌，全部加入后室温继续搅拌10min；4℃静止2-3h；

3)12000rpm4℃离心10min，弃上清，沉淀用2ml生理盐水溶解；

4)将抗体装入透析袋，并于0.01mpbs中4℃透析24h，期间每2h换一次pbs溶液；

5)取出透析袋中抗体，12000rpm4℃离心10min，上清即为纯化的抗体；取1μl上清用nanodrop紫外分光仪测定igg含量，测定完毕后抗体于-80℃冰箱保存。

2.胶体金溶液制备

将100ml0.01％氯金酸加热至沸腾，加入1.2ml1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min后氯金酸还原成胶体金颗粒溶液。

3.胶体金标记抗体的制备

1)取50ml胶体金溶液，用0.1mk2co3将其ph值调至8.2；

2)调好ph值的胶体金溶液中边搅拌边加入2mligg浓度为2mg/ml的上述抗水稻条纹花叶病毒的单抗1d4，搅拌30min；再逐滴加入1ml25m分子量为20,000的聚乙二醇即peg溶液，再搅拌15min；

3)将上一步混合液于4℃20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mlph7.4含0.4mpeg20,000的0.01mpbs缓冲液悬浮，4℃20,000rpm离心15min，去上清；

4)沉淀用0.01mpbs缓冲液悬浮、离心，并重复1次；

5)用10mlph7.5含2％bsa和0.02％叠氮化钠的pbs缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为胶体金标记抗体溶液，4℃保存备用；

二、检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术的建立

1.检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术的操作步骤1)硝酸纤维素(nc)膜准备：用铅笔在nc膜外层纸上划线，使nc膜印上方格线痕迹，每格规格0.3×0.3cm，平整放于干净的滤纸上；

2)样品制备：

a)植物样品的制备：老的水稻、小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加2ml的比例加入ph7.4的0.01mpbs后研钵中继续研磨匀浆1min；嫩的水稻、小麦植物组织称重后按0.1g植物组织加2ml的比例加入0.01mpbs后研钵中研磨匀浆2min；匀浆液移至1.5mleppendorf离心管中，5,000rpm离心3min，或静置5min，上清即为水稻或小麦植物组织的粗提液；

b)传毒介体电光叶蝉样品的制备：一头电光叶蝉放入一个0.5ml的eppendorf离心管中后加入50-100μl0.01mpbs，用牙签粗端或200μl枪头捣烂叶蝉呈匀浆液；

3)点样：用移液器吸取水稻或小麦植物组织的粗提液，以及电光叶蝉匀浆液各3μl，点样于nc膜的格子中央，室温下干燥10min；

4)封闭：使用按5g脱脂奶粉加100mlpbst缓冲液(含0.05％tween-20的0.01mol/lpbs)的比例配制得到5％的脱脂奶粉封闭液，nc膜在封闭液中室温下封闭0.5-1h；

5)洗涤：去封闭液，用pbst缓冲液洗膜2次，每次3min；

6)胶体金标记抗体孵育：nc膜放入用0.01mol/lpbs适当稀释的胶体金标记抗体溶液中于水平摇床上缓慢摇动室温孵育1-3h；

7)洗涤：去胶体金标记抗体溶液，用pbst缓冲液洗膜4-5次，每次3min；

8)肉眼观察判断结果：出现红色斑点的样品为阳性，无色或绿色斑点的样品为阴性。

2.胶体金抗体工作浓度的确定

以感染rsmv的水稻和电光叶蝉为阳性对照，无毒水稻和无病毒电光叶蝉为阴性对照，利用0.01mol/lpbs对胶体金抗体进行从1:500-1:128000倍倍比稀释，取每个稀释度的胶体金抗体进行斑点免疫印迹检测，确定检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术中胶体金抗体的最佳工作浓度，3次重复实验结果表明，当胶体金抗体的稀释度为1:2000倍时，该技术的检测效果最佳，因此，以此浓度为该技术胶体金抗体的工作浓度。

3.检测rsmv斑点免疫印迹技术的灵敏度和特异性分析

感染rsmv的水稻植物组织粗提液用0.01mpbs从1:160-81920倍倍比稀释(w/v,g/ml)，单头电光叶蝉匀浆液从1:160-20480倍倍比稀释(头/μl)，取每个稀释度粗提液或匀浆液分别进行建立的斑点免疫印迹技术检测，检测结果发现，该斑点免疫印迹技术检测感染rsmv水稻病叶灵敏度达到1:40960倍稀释，单位为w/v,g/ml，检测单头携带rsmv电光叶蝉的灵敏度达到1:5120倍稀释，单位为单头/μl(图1)。

用分别感染水稻条纹病毒(rsv)、水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)、南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)、水稻锯齿矮缩病毒(rrsv)、水稻瘤矮病毒(rgdv)、水稻矮缩病毒(rdv)的病叶粗提液为检测样品，以感染rsmv的水稻植物组织粗提液和感染rsmv电光叶蝉匀浆液为阳性对照，以健康水稻植物组织粗提液和无病毒电光叶蝉匀浆液为阴性对照，分别包被elisa板，以水稻的健康叶片粗提液、非携毒电光叶蝉的匀浆液为阴性对照进行斑点免疫印迹检测，结果发现，该建立的技术检测感染水稻条纹花叶病毒的水稻和电光叶蝉组织呈强阳性反应，而检测感染水稻条纹病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻锯齿矮缩病毒、水稻瘤矮病毒、水稻矮缩病毒以及健康水稻植物组织和非携毒电光叶蝉组织均呈阴性反应(图2)。

4.检测rsmv斑点免疫印迹技术的田间应用

利用建立的斑点免疫印迹技术对2018年8月在广东省罗定市的水稻田间采集的水稻和电光叶蝉共27个样品进行检测，检测结果发现，有16个样品感染rsmv(图3)。同时用rt-pcr检测和pcr产物的核酸测序及序列比对验证了该斑点免疫印迹技术检测结果完全准确。

二、水稻条纹花叶病毒斑点免疫印迹检测试剂盒

1.水稻条纹花叶病毒斑点免疫印检测试剂盒主要成分：

以上试剂均保存于4℃

2.检测水稻样品的操作步骤：

1)硝酸纤维素(nc)膜准备：用铅笔在nc膜外层纸上划线，使nc膜印上方格线痕迹，每格规格0.3×0.3cm，平整放于干净的滤纸上；

2)样品制备：

a)植物样品的制备：老的水稻、小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加2ml的比例加入ph7.4的0.01mpbs后研钵中继续研磨匀浆1min；嫩的水稻、小麦植物组织称重后按0.1g植物组织加2ml的比例加入0.01mpbs后研钵中研磨匀浆2min；匀浆液移至1.5mleppendorf离心管中，5,000rpm离心3min，或静置5min，上清即为水稻植物组织的粗提液；

b)传毒介体电光叶蝉样品的制备：一头电光叶蝉放入一个0.5ml的eppendorf离心管中后加入50-100μl0.01mpbs，用牙签粗端或200μl枪头捣烂叶蝉呈匀浆液；

3)点样：用移液器吸取水稻植物组织的粗提液或电光叶蝉匀浆液3μl，点样于nc膜的格子中央，室温下干燥10min；

4)封闭：使用按5g脱脂奶粉加100mlpbst缓冲液(含0.05％tween-20的0.01mol/lpbs)的比例配制得到5％的脱脂奶粉封闭液，nc膜在封闭液中室温下封闭0.5-1h；

5)洗涤：去封闭液，用pbst缓冲液洗膜2次，每次3min；

6)胶体金标记抗体孵育：nc膜放入用0.01mol/lpbs稀释1:2000倍的胶体金标记抗体溶液中于水平摇床上缓慢摇动室温孵育1h；

7)洗涤：去胶体金标记抗体溶液，用pbst缓冲液洗膜4-5次，每次3min；

8)肉眼观察判断结果：出现红色斑点的样品为阳性，无色或绿色斑点的样品为阴性。

3)保存及有效期：

于2-8℃避光保存，有效期12个月。

4)缓冲液配方：

a.磷酸盐缓冲液(pbs，0.01mol/l，ph7.4)：nacl8g,kcl0.2g,kh2po40.2g,na2hpo4·12h2o3g，加蒸馏水950ml溶解后调ph至7.4，定容至1000ml。

b.elisa洗涤液(0.01mpbst)：1000ml0.01mpbs中加0.5mltween-20。

c.elisa封闭液：0.01mpbst中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v,g/ml)。