一种检测抑制素A的试剂盒的制作方法

本发明涉及医药生物类免疫检测领域，尤其是涉及一种检测抑制素a（inhibin-a）的试剂盒。

背景技术：

抑制素是一种由α亚单位和β亚单位组成的异二聚体糖蛋白，是细胞因子中转化生长因子β(tgf－β)超家族中的一员。在外周血液循环中,抑制素有多种存在形式：32kda的二聚体、58-73kda的大二聚体、大的游离α亚单位前体以及游离的处理后α亚单位等多种存在形式。其中,32kda的二聚体为抑制素的成熟形式,主要包括抑制素a和抑制素b,两者结构上均含有α亚单位,其区别在于抑制素a的β亚单位为βa亚单位，抑制素b的β亚单位为βb亚单位。

抑制素b是男性血液循环中的主要存在形式,而抑制素a主要出现在妊娠期间的母体血清中,并有前体、成熟、处理后等多种存在形式。妊娠期间，胎盘可分泌大量的抑制素，尤其在孕晚期外周循环中所检测到的抑制素绝大部分是胎盘来源。不同的抑制素形式在组织中的分布是有很大不同的：抑制素a的浓度在通过羊膜腔穿刺技术抽取得到的羊水中的浓度较高；男性胎儿血清中，可检测到抑制素b,不能检测到抑制素a，女性胎儿血清中两种抑制素均不能检测到；而在母体血清中，有较高水平的抑制素a，而抑制素b的水平通常检测不到；非妊娠期间的母体血清中也是无法检测到抑制素a的。

在妊娠期间,母体血清中抑制素a水平根据孕周的不同而有所变化。抑制素a的浓度从妊娠早期几周的低水平开始上升，晚期显著升高,足月时可达到妊娠开始时水平的多倍。抑制素a水平的变化在妊娠10周达到高峰而后开始下降，在孕15-25周基本处于相对稳定的状态，孕25周后再次开始上升至足月时达到另一高峰。

妊娠期间母体胎盘合体滋养层细胞可分泌或生成hcg和抑制素a，且hcg可刺激抑制素a的产生，抑制素a在血清中的浓度与hcg也存在一定的相关性,尤其与intact-hcg的相关性最为明显。yunghanglam等也报道了在正常妊娠者和唐氏综合征妊娠者中,血清抑制素a浓度与hcg浓度均具有相关性，但是与afp、ue3之间并没有相关性，因此，抑制素a可用于孕中期唐氏综合征的筛查。

此外，抑制素a可在孕早期子宫内膜蜕膜化、胚胎植入、滋养细胞种植和分化中起到一定调节作用，其血清表达水平的下降与先兆流产的发生密切相关，也可用来预测先兆流产的结局，且预测价值高于β-hcg及孕酮。血清中抑制素a、ca125、β-hcg、孕酮等项目的联检也用于先兆流产的检测。

目前市场上常见的对抑制素a的方法学检测为时间分辨荧光法，其缺点主要是检测时间长。

磁微粒化学发光法是以化学发光法平台发展起来的新型检测方法，此方法是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法，该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，在生物分析领域有较大的应用前景。如果能开发出一种采用磁微粒化学发光法来检测抑制素a的试剂盒，则可使检测更加快速方便。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测抑制素a的试剂盒，该试剂盒利用磁微粒化学发光法检测快速、灵敏度高、全自动化的优势，较时间分辨荧光法具有较大的优势。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的检测抑制素a的试剂盒，其组分包括包被有第一inhibin-a抗体的磁微粒混悬液，标记有酶标的第二inhibin-a抗体或inhibin-a抗原的酶结合物，样品稀释液和校准品；其中第一、第二inhibin-a抗体的结合位点不同。第一、第二inhibin-a抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。

其中用作酶标记的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

所述磁微粒（又称磁珠）的粒径应为0.1~5um，具有良好的分散性及均一性；其表面连接有一种（如cooh-、nh2-等）或多种活性功能基团，第一inhibin-a抗体和磁珠之间可以通过化学连接、生物素连接、链霉亲和素连接等任一方式进行连接，并保存在包含有保护蛋白（一种或多种）及1‰防腐剂的封保液中，2～8℃保存待用。

所述磁微粒上包被的第一inhibin-a抗体的浓度为15~40ug/ml。

所述酶结合物中含有的酶标第二inhibin-a抗体的浓度为200~1000ug/l，酶标inhibin-a抗原的浓度为100~1500ug/l。

所述样品稀释液中含有可以抵消嗜异性抗体干扰的清洁抗体（清洁抗体又名阻断剂、干扰消除剂，主要用来消除嗜异性抗体引起的非特异性吸附，具体表现为可以提升试剂盒的灵敏度，或者降低本底，减少试剂盒假阳性产生几率。本发明试剂盒中采用的清洁抗体可以是市售的清洁抗体如mak33系列、hrr系列等，也可以是通过筛选得到的具有以上作用的其它种类的抗体）。实际制备时，将清洁抗体添加到含有保护蛋白（一种或多种）及1‰防腐剂的缓冲液中，混合均匀后2～8℃保存待用。

本试剂盒中的校准品按照抑制素a抗原的浓度排列进行命名。在夹心法试剂盒中，校准品浓度由低到高分别命名为s0、s1、s2、s3、s4、s5的六个不同浓度的校准品，其中s0中只含有校准品稀释液，其余校准品是将不同浓度的抑制剂a抗原分别添加到校准品稀释液中制成；在竞争法试剂盒中，校准品浓度由高到低分别命名为s0、s1、s2、s3、s4、s5的六个不同浓度的校准品，其中s5中只含有校准品稀释液，其余校准品是将不同浓度的抑制剂a抗原分别添加到校准品稀释液中制成。其中校准品稀释液由包含保护蛋白和防腐剂的缓冲液制成。

其缓冲液可以是tris-nacl缓冲液，tris-hcl缓冲液，由nah2po4.2h2o、na2hpo4.12h2o和nacl组成的pbs缓冲液，mes缓冲液等任一种缓冲液。

所用的保护蛋白可以是小牛血清、牛血清白蛋白、去激素血清、casein等中任意一种或两种搭配，小牛血清、去激素血清的使用浓度在10~50%之间，牛血清白蛋白、casein的使用浓度在5‰~5%之间。所用的防腐剂可采用两种不同类型的进行搭配使用，如可采用proclin300、nan3、mit等常用的防腐剂。

本发明试剂盒的检测原理为双抗体夹心法或竞争法，操作简单方便，利用抗原抗体的特异性反应以及磁珠的强吸附性，通过elisa技术测定inhibin-a抗原，灵敏度高，特异性强，同时检测成本较低，省时省力，可在分子水平将血清中的抑制素a（inhibin-a）含量快速、定量的检测出来。

附图说明

图1是本发明试剂盒与比对试剂盒临床相关性比较。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明中所用试剂（如清洗液等一些必要的缓冲液）及仪器均为本领域常规产品，本发明所用操作方法均为本领域常规操作方法。

实施例1制备抑制素a检测试剂盒

本发明所用的第一inhibin-a抗体、酶标记第二inhibin-a抗体、酶标记inhibin-a抗原、inhibin-a抗原均来源于郑州伊美诺生物技术有限公司。

1、制备包被有第一inhibin-a抗体的磁微粒混悬液

首先将选用的磁珠原液经过10倍原液体积的pbs缓冲液冲洗2-5遍，然后使用edc、nhs或戊二醛进行活化，活化后的磁珠与浓度为15~40ug/ml的第一inhibin-a抗体连接（连接方法可采用化学连接、物理吸附、生物素连接、链霉亲和素连接等任一方法）进行包被，包被后的磁珠经过封保液封闭后，定容并分装后在2～8℃环境保存待用。

2、制备含有酶标第二inhibin-a抗体的酶结合物

取1000ml纯化水，加入所需量的9.00gnacl、0.592gnah2po4.2h2o、5.80gna2hpo4.12h2o，充分搅拌溶解后，加入10.00gcasein、1‰proclin300及1‰的10%nan3，所有物质混匀后作为酶结合物缓冲液备用；加入200~1000ug/l的酶标第二inhibin-a抗体，混合均匀后2～8℃保存待用。

3、制备含有酶标inhibin-a抗原的酶结合物

取1000ml纯化水，加入所需量的9.00gnacl、0.592gnah2po4.2h2o、5.80gna2hpo4.12h2o，充分搅拌溶解后，加入10.00gcasein、1‰proclin300及1‰的10%nan3，所有物质混匀后作为酶结合物缓冲液备用，加入浓度100~1500ug/l的酶标inhibin-a抗原，混合均匀后2～8℃保存待用。

4、制备样品稀释液

将每升含有6.05gtris和8.20gnacl、10.00g的casein及1‰proclin300的稀释液作为样品稀释液，混合均匀后加入浓度为100ug/ml~500ug/ml的清洁抗体，2～8℃保存待用。

5、制备校准品

以牛血清白蛋白为溶剂，配制inhibin-a抗原浓度分别为0、25、100、500、1000、2000pg/ml的系列梯度校准品。如果采用双抗体夹心法检测原理时，六个校准品按照抑制素a的浓度由低到高分别命名为s0、s1、s2、s3、s4、s5，其中s0浓度为0，只含有校准品稀释液；如果采用竞争法检测原理时，六个校准品按照抑制素a的浓度由高到低分别命名为s0、s1、s2、s3、s4、s5，其中s5浓度为0，只含有校准品稀释液。

6、制备发光底物

辣根过氧化物酶对应的发光底物a为鲁米诺，发光底物b为过氧化氢；碱性磷酸酶对应的底物为amppd或cspd或adp-star或cdp-star等。

实施例2本发明试剂盒的检测方法

使用本发明试剂盒，通过磁微粒化学发光法检测待测样本中的抑制素a浓度，可采用以下三种方法：

1、使用双抗体夹心一步法测定抑制素a时，具体加样步骤为：

a，加入10~50ul的待测样本（血清/血浆），同时添加40~50ul样品稀释液、20ul磁微粒混悬液、100ul含有酶标记第二inhibin-a抗体的酶结合物；

b，将上述组分混合均匀，于37℃条件下反应15min~30min后洗涤；

c，加入50~120ul混合后的发光底物，避光1分钟内测发光值，通过发光值拟合出待测样本中inhibin-a的浓度。

2、使用双抗体夹心两步法测定抑制素a时，具体加样步骤为：

a，加入10~50ul的待测样本（血清/血浆），同时添加40~50ul样品稀释液、20ul磁微粒混悬液，混合均匀后于37℃条件下反应15min后洗涤；

b，加入50~120ul含有酶标记第二inhibin-a抗体的酶结合物，37℃条件下反应17min后洗涤；

c，最后加入100ul混合后的发光底物，避光1分钟内测发光值，通过发光值拟合出待测样本中inhibin-a的浓度。

3、使用竞争法测定抑制素a时，具体加样步骤为：

a，加入10~50ul的待测样本（血清/血浆），同时添加40~50ul样品稀释液、20ul磁微粒混悬液、50~120ul含有酶标记inhibin-a抗原的酶结合物；

b，混合均匀后于37℃条件下反应15min~30min后洗涤；

c，加入100ul混合后的发光底物，避光1分钟内测发光值，通过发光值拟合出待测样本中inhibin-a的浓度。

化学发光标准曲线的绘制方法为：

采用六点定标法，首先取6个不同浓度梯度的inhibin-a校准品，复孔测定不同浓度梯度的校准品的发光值，求均值，分别以浓度值为x轴，发光值的log值为y轴，根据（lin-log）四参数方法进行曲线拟合。

实施例3本发明试剂盒的性能检测

1、灵敏度检测

lob：准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；lod：准备5份浓度范围为1~4倍lob的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；fs：采用lod实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、sd和cv%，最接近20%的浓度为功能灵敏度；检测结果见下表1：

表1

从表1检测结果可以看出：三批试剂的lob分别为：0.52、0.37、0.57pg/ml；lod分别为1.59、1.36、1.84pg/ml；fs分别为：2.12、2.25、2.41pg/ml；因此本发明试剂盒的lob为1.0pg/ml，lod为2.0pg/ml，fs为2.5pg/ml，能够满足临床需求。

2、特异性检测

检测10⁸pg/ml的促甲状腺激素（htsh）、10⁸pg/ml的黄体生成素（hlh）、2000miu/l的β-hcg、1000ug/l的afp，均≤1.0pg/ml，不存在交叉。

3、hook风险检测

检测数据如表2所示：

表2

结论：考核50000pg/ml的高值，未出现hook。

实施例4本发明试剂盒临床验证

为了判断本发明试剂盒inhibin-a检测结果与对比厂家检测结果的一致性，收集175例孕早及孕中期血清样本进行平行检测，结果见附图1所示。

从图1显示的比对结果表明，本发明试剂盒与比对试剂盒的线性相关r为0.9924，r2为0.9849，相关方程为：y=0.9113x+1.7514，证明本发明试剂盒与比对试剂盒间相关性较好。

注：本申请中所用的全自动化学发光免疫分析测定仪（autolumoa2000plus）由郑州安图生物工程股份有限公司提供；此次临床比对使用的对比厂家试剂盒为贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司生产的抑制素a检测试剂盒（化学发光法）。