一种鲑鱼降钙素喷鼻剂有关物质的分析方法与流程

本发明属于医药
技术领域：
，涉及一种鲑鱼降钙素及其制剂中有关物质的检测方法。
背景技术：
：鲑鱼降钙素，又名鲑降钙素，英文名称为calcitonin(salmon)，分子式为c145h240n44o48s2，分子量为3431.89，cas号：47931-85-1。其结构式如下：h-cys-ser-asn-leu-ser-thr-cys-val-leu-gly-lys-leu-ser-gln-glu-leu-his-lys-leu-gln-thr-tyr-pro-arg-thr-asn-thr-gly-ser-gly-thr-pro-nh2鲑鱼降钙素生产工艺主要采用固相合成法，即将氨基酸的c端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，经过缩合-洗涤-去保护-中和洗涤-下一轮缩合的重复操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化处理，得到鲑鱼降钙素。因此，会产生较多杂质，如缺失一个氨基酸的多肽，缺少两个氨基酸的多肽，氨基酸消旋产生的异构体，二硫键未形成的线性多肽，天冬酰胺或者谷氨酰胺水解变成天冬氨酸或谷氨酸的水解肽等。其中包含五个杂质，结构式如下：杂质a：r1＝co-ch3，r2＝nh2，x＝l-leu；乙酰鲑降钙素；杂质b：r1＝h，r2＝nh2，x＝d-leu；[9-d-亮氨酸]-鲑降钙素；杂质c：去-22-酪氨酸鲑降钙素杂质d：氧乙酰化鲑降钙素降钙素c采用usp37鲑鱼降钙素鼻用喷雾剂标准，鲑鱼降钙素原料bp2014/ep8.3及中国药典方法，因杂质较多，杂质分离度差，检测较困难。鲑鱼降钙素为化学合成的由三十二个氨基酸组成的多肽，与天然鲑鱼降钙素i结构相同，在酸、碱、氧化、高温、光照条件下均存在一定程度的降解，杂质多为降解产生，当前方法很难进行有效检测，在一定程度上影响鲑鱼降钙素鼻用喷雾剂的质量控制，也需建立有效的分析方法实行严格控制。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种运用高效液相色谱法检测鲑鱼降钙素及其制剂中有关物质的方法，该方法可以对鲑鱼降钙素中有紫外吸收的杂质进行有效分析和定量测定，从而有效控制鲑鱼降钙素喷鼻剂产品质量，专属性强，灵敏度高，准确性良好。本发明采用如下技术方案：一种鲑鱼降钙素及其制剂中有关物质的检测方法，其采用高效液相色谱法进行检测，hplc色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；流动相a为无机盐缓冲液-有机溶剂的混合液；流动相b为无机盐缓冲液-有机溶剂的混合液；梯度洗脱条件如下：时间/分钟流动相a/％流动相b/％070-7530-253055-6045-403270-7530-255570-7530-25或者梯度洗脱条件如下：优选地，所述无机盐缓冲液中的无机盐为四甲基氢氧化铵、甲酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种，更优选为四丁基氢氧化铵。优选地，所述无机盐缓冲液中无机盐的浓度为0.01-0.05mol/l，优选为0.01-0.03mol/l，更优选为0.01-0.02mol/l，最优选为0.02mol/l；和/或，所述无机盐缓冲液的ph值得范围为2.0-5.0，优选为2.0-4.0，最优选为2.5。优选地，所述有机溶剂为甲醇、乙腈和异丙醇中的一种或多种，更优选为甲醇和或乙腈。较佳地，流动相a为0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液-乙腈的混合溶液，二者体积比为9:1，其中四甲基氢氧化铵溶液用磷酸调节ph为2.5；流动相b为0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液-乙腈的混合溶液，二者体积比为2:3，其中四甲基氢氧化铵溶液用磷酸调节ph为2.5。优选地，梯度洗脱条件如下：时间/分钟流动相a/％流动相b/％070-9030-103060-4040-603260-10040-05560-10040-0更优选地，梯度洗脱条件如下：时间/分钟流动相a/％流动相b/％07228305545327228557228优选地，所用柱温为25-70℃，优选为35-70℃，更优选为50-70℃，进一步优选为60-65℃，最优选为62℃。所用固定相可采用色谱柱为c18(4.6×250mm，5μm)。具体地，所用色谱柱可为vydac218tpc18,4.6×250mm，5μm，更优选为zorbax300sb-c18，4.6×250mm，5μm。优选地，所述流动相的流速为0.8-1.2ml/min，优选为0.9-1.1ml/min，更优选为1.0ml/min。优选地，进样量为5-30μl，优选为10-30μl，更优选为20μl。优选地，检测波长为210-254nm，更优选检测波长为220nm。进一步地，可将待测样品鲑鱼降钙素或其制剂用稀释液制成待测样品溶液，以鲑鱼降钙素的浓度为10-35μg/ml为佳。所述稀释液用本领域技术人员熟知的稀释液即可，并无特殊限制。本发明优选稀释液为水、甲醇、乙腈中的一种或多种，更优选为无机盐缓冲液-乙腈。较佳地，所述稀释液为流动相a。进一步地，可直接以鲑鱼降钙素喷鼻剂为待测样品溶液。本发明可采用紫外检测器进行定量检测。上述杂质降钙素c是降钙素鼻喷剂的主要降解产物，容易在溶液中产生，原料中不易出现；测定结果显示原料放置两年后的未检出该杂质。因此现有国内外标准中原料药未单独控制该杂质限度，但在注射液中控制限度7.0％。上述杂质a是四个已知杂质(杂质a、b、c和d)中唯一被检出的合成杂质，国内外鲑鱼降钙素喷鼻剂产品均未单独规定杂质a限度。为严格控制产品质量，本发明参考国内外药典原料药的标准，将杂质a作为已知杂质单独控制限度。为更好地对降钙素鼻喷剂进行有关物质分析检测，从而有效控制鲑鱼降钙素鼻喷剂产品的质量，提高检测专属性、灵敏度和准确度，本发明进一步进行了改进。具体而言，本发明提供一种鲑鱼降钙素喷鼻剂有关物质的分析方法，其hplc色谱条件如下：流动相a为0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液-乙腈的混合溶液，二者体积比为9:1，其中四甲基氢氧化铵溶液用磷酸调节ph为2.5；流动相b为0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液-乙腈的混合溶液，二者体积比为2:3，其中四甲基氢氧化铵溶液用磷酸调节ph为2.5；梯度洗脱条件如下：时间/分钟流动相a/％流动相b/％070-7530-253055-6045-403270-7530-255570-7530-25进一步地，柱温为60-65℃。鲑鱼降钙素喷雾剂杂质较多，检测较困难，尤其是主成分与未知杂质以及杂质a与未知杂质之间分离度差，难以区分，现有检测方法难以对其有关物质进行精确检测。本发明意外地发现，通过升高柱温和调整30分钟时流动相的比例可使杂质能够更好的分离，实现定量测定，显著提高了检测灵敏度高和准确度。优选地，梯度洗脱条件如下：时间/分钟流动相a/％流动相b/％07228305545327228557228优选地，柱温为62℃。优选地，所用色谱柱为vydac218tpc18,4.6×250mm，5μm，或为zorbax300sb-c18，4.6×250mm，5μm。优选地，所述流动相的流速为1.0ml/min。优选地，进样量为20μl。优选地，检测波长为220nm。进一步地，直接以鲑鱼降钙素喷鼻剂为供试品溶液。进一步地，以用上述流动相a稀释90-110倍优选稀释100倍的供试品溶液作为对照溶液。例如，具体配制方法包括：精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，用流动相a稀释至刻度，作为对照溶液。进一步地，还包括系统适应性试验；其中，取杂质a(即n-乙酰-半胱氨酰1-鲑鱼降钙素)对照品适量，加所述流动相a溶解并稀释制成每1ml中含杂质a0.3mg的溶液，再用供试品溶液稀释90-110倍优选稀释100倍(例如取该溶液100μl，加入供试品溶液10ml，混匀)，作为系统适用性试验溶液(1)。由于目前没有降钙素c对照品，为更好地将其定位，本发明首先以上述流动相a为溶剂配制鲑鱼降钙素对照品溶液，然后将其加热处理至降解产生杂质降钙素c后，作为系统适用性试验溶液(2)。较佳的加热处理条件是置65℃水浴中加热10小时。例如，具体方法如下：取鲑鱼降钙素对照品适量，加上述流动相a溶解并稀释制成浓度0.2-0.5mg/ml优选0.3mg/ml的鲑鱼降钙素对照品溶液，置65℃水浴中加热10小时，放冷，作为系统适用性试验溶液(2)。本发明具体分析方法包括：精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，注入色谱仪，按自身对照法以峰面积计算有关物质含量。取系统适用性试验溶液(1)和系统适用性试验溶液(2)各20μl注入色谱仪，记录色谱图。在系统适用性试验溶液(1)的色谱图中，杂质a峰与鲑鱼降钙素主峰的分离度应大于5.0，杂质a峰的拖尾因子不得过2.0；在系统适用性试验溶液(2)的色谱图中，溶剂峰与主峰间的最大峰即为降钙素c峰。其中鲑鱼降钙素喷鼻剂有关物质限度标准：含降钙素c应不得超过5.0％，杂质a不得超过3.0％，其他单个杂质不得超过3.0％，除降钙素c外，其余各杂质总和不得超过5.0％。本发明方法可检测鲑鱼降钙素原料药、原料药粗品以及鲑鱼降钙素制剂；其中鲑鱼降钙素制剂包括注射液、冻干粉针以及鲑鱼降钙素鼻喷剂。本发明方法可对存在的杂质进行有效分离并定量测定，从而有效控制鲑鱼降钙素鼻喷剂产品的质量，专属性强，灵敏度高，准确度良好。本发明采用高效液相色谱法分离测定鲑鱼降钙素喷鼻剂中鲑鱼降钙素及杂质，并以紫外检测器定量检测杂质含量，可以测得杂质含量的具体数值、灵敏度高，并可以直接反映样品在放置过程中的降解趋势，为准确测定杂质含量、有效控制产品质量提供了更高保障和更确切的数字依据。附图说明图1：实施例1供试品溶液典型色谱图。图2：实施例1系统适用性试验溶液(1)典型色谱图。图3：实验例色谱条件1典型色谱图。图4：实验例色谱条件2典型色谱图。图5：实验例色谱条件3典型色谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。除非特殊说明，以下所用仪器及试剂：色谱仪：agilent1260液相色谱仪。检测器：dad检测器，检测波长220nm；流动相a：0.022mol/l四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节ph为2.5)-乙腈(9:1，v/v)；流动相b：0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节ph为2.5)-乙腈(2:3，v/v)色谱柱：vydac218tpc18,4.6×250mm，5μm。色谱柱：zorbax300sb-c18，4.6×250mm，5μm。具体方法可参照高效液相色谱法(中国药典2010年版附录vd)。以下所用供试品溶液为鲑鱼降钙素喷鼻剂，由银谷制药有限责任公司提供，批号1207011、1207021、1207031、1408021、1408031、1408041。精密量取供试品溶液(鲑鱼降钙素喷鼻剂)1.0ml，置100ml量瓶中，用流动相a稀释至刻度，作为对照溶液。鲑鱼降钙素对照品，由中国食品药品检定研究院提供，批号：140665-201103。杂质a(n-乙酰-半胱氨酰1-鲑鱼降钙素)对照品，为usp对照品，批号：fok102。取杂质a(n-乙酰-半胱氨酰1-鲑鱼降钙素)对照品适量，加流动相a溶解并稀释制成每1ml中含0.3mg的溶液，取该溶液100μl，加入供试品溶液10ml，混匀，作为系统适用性试验溶液(1)。取鲑鱼降钙素对照品适量，加流动相a溶解并稀释制成每1ml中约含0.3mg的溶液，置65℃水浴中加热10小时，放冷，作为系统适用性试验溶液(2)。实施例1鲑鱼降钙素喷鼻剂有关物质的高效液相色谱法测定hplc色谱条件：柱温62℃；dad检测器，检测波长为220nm；色谱柱：zorbax300sb-c18，4.6×250mm，5μm。梯度洗脱程序：时间/分钟流动相a/％流动相b/％07228305545327228557228精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，注入色谱仪，记录色谱图见图1，按自身对照法以峰面积计算有关物质含量。其中，含降钙素c为1.06％，杂质a为0.15％，其他单个杂质均未超过3.0％，除降钙素c外，其余各杂质总和未超过5.0％。系统适用性试验取系统适用性试验溶液(1)和系统适用性试验溶液(2)各20μl注入色谱仪，记录色谱图。在系统适用性试验溶液(1)的色谱图2中，杂质a峰与鲑鱼降钙素主峰的分离度大于5.0，杂质a峰的拖尾因子未超过2.0；溶剂峰与主峰间的最大峰即为降钙素c峰。具体结果见下表：结论：在上述色谱条件下，降钙素c、杂质a与主峰之间均达到良好分离，满足系统适用性试验要求。实验例经查阅usp、bp、ep、cp，各国药典标准中采用的色谱条件除梯度洗脱时间略有差异外，其余基本相同。梯度洗脱时间主要有两种，一种是用于原料有关物质检查的条件，梯度洗脱时间为55分钟，另一种用于制剂的有关物质检查，洗脱时间为30分钟。为了解上述两种色谱条件的差异，本发明采用不同色谱柱对上述两种条件进行了考察，结果如下：a、色谱条件1：色谱仪：agilent1260液相色谱仪检测器：dad检测器，检测波长220nm流动相a：0.022mol/l四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节ph为2.5)-乙腈(9:1)流动相b：0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节ph为2.5)-乙腈(2:3)色谱柱：vydac218tpc18,4.6×250mm，5μm柱温：40℃梯度程序：时间/分钟流动相a/％流动相b/％0653521435721.016535306535典型色谱图见图3。b、色谱条件2：与色谱条件1的区别仅在于：柱温为62℃且采用以下条件进行梯度洗脱：时间/分钟流动相a/％流动相b/％07228304852327228557228典型色谱图见图4。c、色谱条件3与色谱条件1的区别仅在于：柱温为62℃且采用色谱柱zorbax300sb-c18，4.6×250mm，5μm，以下条件进行梯度洗脱：时间(分钟)a％b％07228304852327228557228典型色谱图见图5。由图3-5可见，两种不同的色谱柱的分离能力无本质区别，相比而言，采用zorbax300sb-c18的分离能力略好，故拟采用该型号柱子进行后续研究。图3降钙素c理论塔板数为4807，图4降钙素c理论塔板数为16488，图5降钙素c理论塔板数为21225；此外，色谱条件1初始梯度变化为(65-43)/21；色谱条件2初始梯度变化(72-48)/30，变化基本类似，因此可看出柱温对理论塔板数具有显著影响。从两种柱温所得结果看，较高柱温能够很好的改善降钙素c的理论塔板数，故拟采用高柱温进行后续研究。从两种梯度洗脱方式所得结果看，原料药有关物质检查色谱条件，主峰保留时间要长一点，但各杂质的分离情况要远优于用于制剂的梯度条件，两种色谱条件均能良好分离鲑鱼降钙素c，但对其他相关肽检测，两种条件差异较大，故在本研究中采用洗脱时间较长的条件进行后续研究。令人意外地发现，调整30分钟时流动相的比例可使杂质能够更好的分离。具体色谱条件如下：色谱仪：agilent1260液相色谱仪检测器：dad检测器，检测波长220nm流动相a：0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节ph为2.5)-乙腈(9:1)流动相b：0.02mol/l四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节ph为2.5)-乙腈(2:3)色谱柱：zorbax300sb-c18，4.6×250mm，5μm柱温：62℃梯度洗脱程序：时间/分钟流动相a/％流动相b/％07228305545327228557228所得供试品溶液典型色谱图见图1。由以上检测结果可知，本发明方法对鲑鱼降钙素喷鼻剂可能存在的杂质进行有效分析并定量测定，从而有效控制产品质量，专属性强，灵敏度高，准确度良好。标准限度设定说明欧洲药典和美国药典鲑鱼降钙素标准项下列出的已知杂质有4个，分别为杂质a、b、c、d，同时标准正文中还引入了一个已知杂质鲑鱼降钙素c。各杂质具体结构等信息参见上文。参考国内外药典鲑鱼降钙素原料及注射剂、鲑鱼降钙素鼻喷雾剂国内新药转正标准及同产品进口注册标准有关物质限度要求，将杂质限度设定为含降钙素c应不得过5.0％，杂质a不得过3.0％，其他单个杂质不得过3.0％，各杂质总和不得过5.0％，各限度的设定说明如下：降钙素c：该杂质为本品的主要降解产物，容易在溶液中产生，原料中不易出现，测定结果显示原料放置两年后的未检出该杂质，因此现有国内外标准中原料药未单独控制该杂质限度，但在注射液中控制限度7.0％。鲑鱼降钙素喷鼻剂进口产品仅控制该杂质，限度为5.0％，国内鼻喷剂转正标准未单独规定该限度。根据上述限度，同时根据样品实测结果，拟定标准规定降钙素c限度为不得过5.0％。杂质a：四个已知杂质(杂质a、b、c和d)中唯一被检出的合成杂质，国内外鲑鱼降钙素喷鼻剂产品均未单独规定杂质a限度。为严格控制产品质量，拟定标准参考国内外药典原料药的标准，将该杂质作为已知杂质单独控制限度，规定为不得过3.0％。其他单个杂质：与各原料、注射剂标准规定一致，限度为不得过3.0％。其余总杂质：本品除降钙素c外，还存在其他的降解产物和合成杂质，参考鲑鱼降钙素注射剂的国内外药典标准，将其余总杂质限度设定为不得过5.0％。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12