中药材中野黄芩苷的含量检测方法与流程

本发明属于中药材药材质量控制
技术领域：
，尤其涉及一种中药材中野黄芩苷的检测方法。
背景技术：
：灯盏细辛(灯盏花)是菊科飞蓬属植物短葶飞蓬erigeronbreviscapus(vant.)hand-mazz的干燥全草，性味辛、微苦，温，具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通络止痛之功，用于感冒头痛，风湿疼痛，脑血管意外引起的瘫痪等(《全国中草药汇编》)。野黄芩苷(灯盏花乙素)是灯盏花erigeronbreviscapus(vant.)hand-mazz中分离出的黄酮类有效成分，可单独成药，现有上市的品种包括注射用灯盏花素，灯盏花素片，灯盏花素滴丸等等，因而灯盏细辛药材中野黄芩苷的含量成为了用以确定灯盏细辛草登记的中药材标志成分。《中国药典》2015版中记载的测定灯盏细辛含量的方法药材的前处理复杂费时，且用到肝毒性较强的氯仿进行回流提取，高效液相法测定含量的方法适应性不好，经过多次反复验证发现其中野黄芩苷峰纯度不够，包含了另外一个物质飞蓬酯乙的峰，以此测定出来的含量将会虚高，具体见技术实现要素：。因此需要一种前处理简单方便，毒性低，且能准确测定灯盏细辛中野黄芩含量的方法。
发明内容本发明提供了一种中药材中野黄芩苷的含量检测方法，所述含量检测方法包括所述中药材的样品预处理阶段和所述样品进样检测阶段，其中所述样品预处理阶段包括样品的乙醇溶解、超声和过滤步骤，得到样品进样液；所述样品进行检测阶段包括将所述样品进样液进行高效液相检测的步骤，所述高效液相条件为：odsc18填充柱，流动相为四氢呋喃：乙腈：0.1-0.2％磷酸溶液12％-16％：6％-8％：82％-76％，流速为0.5-2.0ml/min，检测uv波长为330nm-350nm，柱温35-45℃。野黄芩苷是灯盏细辛药材中的活性成分，为确保灯盏细辛药材的质量，保证其临床用药的安全、有效、稳定，发明人建立了一种灯盏细辛药材中野黄芩苷含量的测定方法。一、中国药典方法存在的问题：(1)标准品制备：对照品溶液的制备：取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。参照《中国药典》2015版(2)供试品溶液制备：取本品粗粉约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流至提取液无绿色，弃去三氯甲烷液；药渣挥去溶剂，连同滤纸筒移入具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，放置1小时，水浴中加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。备用。(3)液相条件：色谱柱inertsilods-35μm4.6×250mm；以甲醇-0.1％磷酸溶液(40:60)为流动相；柱温：40℃；流速为0.8ml/min，检测波长为335nm。测定得到灯盏细辛药材的液相图谱，肉眼判断其中的野黄芩苷似乎是一个分离完全的独立的峰，但该峰纯化后，其pda紫外吸收图与标准品的pda紫外吸收图图对照显示有差异，因此怀疑药典方法分离的野黄芩苷中含有其他包峰。将上述(2)液相条件中流动相由以甲醇-0.1％磷酸溶液(40:60)调节至以甲醇-0.1％磷酸溶液(35:65)，野黄芩苷后面多出一个峰a来，经计算发现，两峰面积之和与前述野黄芩苷的峰面积吻合。通过分离后，进行比对，并且分离得到的样品做了核磁共振和质谱，确定为飞蓬酯乙。实验证明用inertsilods-3柱，可以仅调节高效液相色谱的洗脱条件就能达到较好的分离，如将流动相比例由原来的甲醇-0.1％磷酸溶液(40:60)调整至甲醇-0.1％磷酸溶液(35:65)即可将包含在野黄芩苷峰里的飞蓬酯乙进行很好地分离，然而用其他类型的柱子，例如agilentzorbaxsb-c18(5μm4.6×250mm)、welchxb-c18(5μm4.6×250mm)色谱柱，调整流动相比列，柱温，流速，均未分离出化合物飞蓬酯乙。据此判断，此流动相的适应性不强。二、采用修订后的流动相申请人以流动相为：四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)(以下称新修订流动相)；柱温：40℃；流速为1.0ml/min，检测波长为335nm。用三种色谱柱进行测定结果如下：表1野黄芩苷的峰纯度及说明四、比较两种供试品制备方法对灯盏细辛药材中野黄芩苷含量1、方法一：取灯盏细辛草3个批次，按2015版药典实验：取本品粗粉约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流至提取液无绿色，弃去三氯甲烷液.药渣挥去溶剂，连同滤纸筒移入具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，放置1小时，水浴中加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。备用(样1)。2、方法二：取灯盏细辛草3个批次(与方法一同批次)，取本品粗粉约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇溶液100ml，称定重量，超声处理1小时，密塞，再称定重量，用50％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.45um滤头过滤，取续滤液，即得。备用(样2)。与药典方法不同，申请人提出用乙醇作为提取溶剂，更接近实际生产过程。因为实际生产过程不可能用甲醇提取，且实验发现相同的浓度的乙醇和甲醇，乙醇的野黄芩苷提取率更高。以四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)为流动相；柱温：40℃；流速为1.0ml/min，检测波长为335nm。表2.不同的供试品处理方法对灯盏细辛药材中野黄芩苷含量的影响批次方法一(药典方法)方法二含量相差1804-00010.99％1.61％0.62％1804-00021.18％1.87％0.69％1803-00071.24％2.34％1.10％从表2中可以看出，药典方法处理的供试品含量低于申请人提出的预处理供试品含量。原因是药典方法的处理步骤较申请人方法步骤多。且药典方法处理时间长，用到肝毒性较强的氯仿。而相比而言国家标准方法处理简单，用时短，处理过程在相对密封的容器中，对操作人员的身体危害较小。用高效液相色谱法测定药材中有效成分的含量，是个整体的过程，包括前处理方法及后续测定方法。只有组合在一起，才能较为客观、准确地测定出药材中有效成分的含量。优选地，在上述的含量检测方法中，所述中药材为灯盏细辛。优选地，在上述的含量检测方法中，所述乙醇为50％乙醇溶液。优选地，在上述的含量检测方法中，所述样品为灯盏细辛粗粉，所述样品为灯盏细辛粗粉，所述样品的预处理具体步骤为：取灯盏细辛草粗粉1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇溶液100ml，称定重量，超声处理1小时，密塞，再称定重量，用50％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.45um滤头过滤，取续滤液，得到所述样品进样液。优选地，在上述的含量检测方法中，所述odsc18填充柱优选inertsilods-35μm4.6×250mm、welchxb-c18色谱柱5μm4.6×250mm和agilentzorbaxsb-c18色谱柱5μm4.6×250mm。优选地，在上述的含量检测方法中，所述流动相为四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液的体积比为14％：7％：79％。优选地，在上述的含量检测方法中，所述流速为1.0ml/min。优选地，在上述的含量检测方法中，所述检测uv波长为335nm。优选地，在上述的含量检测方法中，所述柱温为40℃。优选地，在上述的含量检测方法中，所述方法的理论板数不低于5000。与文献报道方法相比有如下优点：(a)本方法是一种测定灯盏细辛药材中野黄芩苷含量的方法。(b)供试品处理简单方便，提取完全，中间转移步骤少，造成的过程损失小，毒性小。(c)本方法适应性强，药典方法和其他方法对大多数色谱柱容易形成包峰。(d)本方法通过多种实验比较获得，并且证明了用药典方法不同的色谱柱都不能将其中飞蓬酯乙从野黄芩苷中分离出来，形成包峰，而导致测定结果中野黄芩苷的含量虚高。(e)本方法通过实验比较发现，即使调整洗脱剂的比例，除inertsilods-3色谱柱外，其他几种色谱柱也不能使野黄芩苷与飞蓬酯乙得到很好地分离。(f)本方法由于用三种溶剂作为流动相，尤其是加入了四氢呋喃，对温度的敏感度高于仅用甲醇，乙腈和水，而柱温在35-45℃间适应性高，申请人还采用过甲醇等混合流动相进行尝试，从方法适应性、稳定性或理论塔板数均会差于本方法。(g)通过方法学验证发现，本
发明内容中的液相条件具有很好的适应性，可以很好地分离野黄芩苷，能够准确地对灯盏细辛药材进行其中野黄芩苷含量的测定。附图说明：图1：实施例1的液相色谱图；图2：实施例2的液相色谱图；图3：实施例3的液相色谱图。具体实施方式以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。方法学研究部分：一、灯盏细辛药材中野黄芩苷含量的测定方法研究1.仪器与试药waterse2965型高效液相色谱仪(waters2489紫外检测器)，十万分之一电子天平xs-205型1/10万电子分析天平(梅特勒)，as系列超声波清洗机(250w，50hz/40hz双频)(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。inertsilods-3(5μm，4.6×250mm)色谱柱，agilentzorbaxsb-c18(5μm4.6×250mm)色谱柱、welchxb-c18(5μm4.6×250mm)色谱柱。灯盏细辛药材；野黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110842-201709，纯度：91.7％)，甲醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，其他试剂为分析纯。2.色谱条件的选择在进行灯盏细辛药材中野黄芩苷的色谱条件的选择时，尤其对流动相系统进行了选择。最后确定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)为流动相；检测波长为335nm。理论板数按野黄芩苷计算应不低于5000，流速为1ml/min：柱温为柱温：40℃。考察了不同比例的甲醇：磷酸水，乙腈：四氢呋喃：磷酸水对分离效果的影响。结果表明四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)较合适，可使样品中的目标峰与杂质达到分离，且适用于多款色谱柱，峰型较好，故选为流动相。3.供试品提取条件的选择(1)提取方法的选择考察了三氯甲烷提取后，弃去三氯甲烷液体，再用乙醇提取，及10％、30％、50％、95％(乙醇)通过回流提取、超声提取等进行比较，结果发现用50％-75％乙醇溶液超声提取测定野黄芩苷含量较高且操作较为简便，所以最终选定50％乙醇溶液超声提取。(2)提取时间的选择超声提取30min，45min，60min，90min对三者的提取率进行比较，发现30min，45min提取率稍低，60min与90min提取率基本一致。最终选择供试品提取方法为加入50％乙醇溶液，超声提取60min。4.线性关系考察精密称取野黄芩苷对照品12.3446mg至50ml容量瓶中，用乙醇(或甲醇)溶解稀释至刻度，摇匀，即得226.44μg.ml-1对照品母液；精密吸取对照品母液0.25、1、2、3、4ml，分别置于5个5ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀，和母液即得各系列浓度对照溶液；分别精密吸取各系列浓度对照溶液10μl；注入液相色谱仪，测定峰面积，以各对照品质量浓度(μg.ml-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到野黄芩苷的回归方程(n＝6)：y＝35133x-161855r＝0.9999。结果表明野黄芩苷浓度在11.32μg.ml-1～226.4μg.ml-1范围内线性关系良好。5.精密度实验精密吸取对照品溶液10μl，以c18键合硅胶为填充剂；以四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)为流动相；流速为1.0ml/min：柱温40℃；检测波长为335nm：理论板数应不低于5000。连续进样6次，记录野黄芩苷峰面积的rsd％(n＝6)为0.4％，表明仪器精密性良好。6.稳定性试验取同一份供试品溶液及对照品溶液，分别于0、4、8、12、24h进样测定，记录野黄芩苷峰面积，计算供试品和对照品溶液rsd％分别为1.21％、0.78％；结果表明供试品溶液和对照品溶液在24h内稳定。7.耐用性取灯盏细辛药材供试品溶液，按四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)(分别使用岛津inertsilods-3、agilentzorbaxsb-c18、welchxb-c18(均为5μm4.6×250mm)色谱柱，野黄芩苷含量rsd％＝0.7％；调整柱温为35℃、40℃、45℃，野黄芩苷含量rsd％＝0.3％，结果表明该方法耐用性良好。8.重复性试验取国家标准处理的供试品溶液，按修订的色谱条件测定6次，记录野黄芩苷峰面积，计算含量，rsd％为0.7％，表明该方法重复性良好。9.回收率试验取已知含量灯盏细辛样品粉末9份，每份约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入野黄芩苷对照品(相当于0.5g供试品野黄芩苷50％、100％、120％)，每个梯度各3份；分别按上述方法制备供试溶液，按上述色谱条件测定记录峰面积，计算回收率，结果见表3。表3.灯盏细辛药材中野黄芩含量测定加样回收率实验结果(n＝9)9.样品测定按前述制备供试品和对照品溶液，分别进样，记录色谱图，计算野黄芩苷的含量，结果见表4。表4样品中野黄芩苷含量实施例1试验步骤：(1)对照品溶液制备：取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液(2)供试品溶液制备：取灯盏细辛草粗粉1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇溶液100ml，称定重量，超声处理1小时，密塞，再称定重量，用50％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.45um滤头过滤，取续滤液(3)色谱条件及系统适用性试验：色谱柱inertsilods-35μm4.6×250mm；以流动相为：四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)；柱温：30℃；流速为0.8ml/min，检测波长为335nm；理论板数不低于5000。(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(5)结果：本例灯盏细辛药材中野黄芩苷含量为1.61％。(保留时间＝17.963min；峰面积＝9230929；理论塔板数：6648，见图1)。实施例2试验步骤：(1)对照品溶液制备：取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液(2)供试品溶液制备：取灯盏细辛草粗粉1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇溶液100ml，称定重量，超声处理1小时，密塞，再称定重量，用75％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.45um滤头过滤，取续滤液(3)色谱条件及系统适用性试验：welchxb-c18色谱柱5μm4.6×250mm；以流动相为：四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)；柱温：35℃；流速为1.0ml/min，检测波长为335nm；理论板数不低于5000。(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(5)结果：本例灯盏细辛药材中野黄芩苷含量为1.88％。(rt＝13.623min；峰面积＝9109905；理论塔板数：6541，见图2)。实施例3试验步骤：(1)对照品溶液制备：取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液。(2)供试品溶液制备：取灯盏细辛草粗粉1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇溶液100ml，称定重量，超声处理1小时，密塞，再称定重量，用50％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，用0.45um滤头过滤，取续滤液(3)色谱条件及系统适用性试验：agilentzorbaxsb-c18色谱柱5μm4.6×250mm；以流动相为：四氢呋喃：乙腈：0.2％磷酸溶液：(14：7：79)；柱温：45℃；流速为1.0ml/min，检测波长为335nm；理论板数不低于5000。(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(5)结果：本例灯盏细辛药材中野黄芩苷含量为2.33％。(rt＝10.061min；峰面积＝9319567；理论塔板数：5213，见图3)。灯盏细辛粗粉为本领域普通技术人员公知技术，通常限制为中国药典规定的3号筛。所述精密称定规定在中国药典规定的千分之一。如果称个位数对照品，例如几毫克，就要在百万分之一天平上称，以此类推。以上所有溶液均为常温配置使用，所有xx溶液未特别指出，均为水溶液(例如50％乙醇溶液)。当前第1页12