一种芍药染色体的全年制片方法与流程

本发明涉及植物的染色体制片方法，更具体地，涉及一种芍药染色体的全年制片方法。

背景技术：

芍药为芍药科芍药属多年生草本植物，芍药属分为三个组：牡丹组、芍药组和北美芍药组，本发明中芍药即指芍药组内的野生种或组内及组间的品种。芍药是我国传统名花，亦是我国传统的爱情之花，具有悠久的栽培历史和文化底蕴。栽培芍药品种花大、色艳且花型十分丰富，并具有庭院栽培、园林绿化、鲜切花、药用等多种应用形式，受到我国人民和世界其他国家的喜爱和关注。到目前为止，全世界在美国牡丹芍药协会(americanpeonysociety，aps)共登录有芍药品种逾5000多个，品种资源非常丰富。随着我国经济快速发展和人们生活水平的提高，近年来芍药鲜切花越来越受到我国人们的欢迎和追捧，在我国鲜切花市场所占比重正在大幅度的提升。

植物染色体制片是进行核型分析、带型分析和染色体原位杂交等细胞遗传学研究的基础。近年来随着细胞遗传学研究在植物分类和育种中的应用，染色体制片技术尤为重要。芍药染色体属于大型染色体，长度约10-20μm，染色体基数为5。在芍药属的三个组里，仅芍药组内出现了二倍体和四倍体的倍性分化(其他两个组均为二倍体)。因此，在芍药栽培品种中，出现了二、三、四倍体的分化，但很多育种家并未重视这一现象，严重影响了育种效率。通过染色体制片技术可以研究芍药品种的倍性，制定合适的杂交计划，提高杂交育种的效率，同时也可以作为杂种鉴定的一种方法，培育更多的属于我国自主知识产权的芍药新品种。

过去在芍药染色体制片的预处理上主要采用的化学试剂是秋水仙素、8-羟基喹啉和放线菌酮等，这些试剂基本都具有毒性，价格较贵或不易获得。细胞解离中使用酶解的方法，纤维素酶和果胶酶价格过于昂贵，且实验步骤较复杂。传统取材时间是在每年3-4月和10-11月，取材的时间较短。染色体显带、荧光原位杂交等技术需要大量的重复实验材料，虽然传统取材可获得分散均匀、清晰的染色体图像，但是无法对材料进行长久的保存，不利于芍药染色体的深入研究。

技术实现要素：

本发明涉及一种芍药染色体的全年制片方法，包括如下步骤：

(1)预处理：将用于制片的材料置于饱和对二氯苯溶液中，在3～5℃的条件下预处理9-11h；

(2)固定：将预处理后的材料转移至卡诺固定液中，在3～5℃条件下固定24h以上；

(3)酸解：将固定后的材料转移至0.95-1.05mol/l的盐酸溶液中，在温度55～65℃下解离9-11min；

(4)染色压片：将解离后的材料进行常规压片法制片。

本发明提出了适用于芍药染色体全年制片的更为简单安全的方法，这种方法通过对各步骤参数的具体调整，可适用于芍药的大部分制片材料。

优选的，本发明中使用的用于制片的材料为：

a、3月-4月，芍药植株早春萌动的新根的根尖，或者芍药未出土的芽；

b、4月-6月，芍药出土后的茎尖，或者芍药的幼嫩心皮；

c、6月-9月，芍药茎插所产生不定根的根尖；

d、9月-11月，芍药植株秋季萌发的新根的根尖；

e、11月-次年2月，芍药根插后所得不定根的根尖。

在本发明的方法下，本发明提出了在全年周期内可进行制片的材料，这大大延长了芍药可进行制片的时间长度，有利于芍药染色体的深入研究。

优选的，所述的芍药植株早春萌动新根的根尖，为早春芍药肉质根自然萌动长出的幼嫩根系的根尖1-2cm处；

优选的，所述的芍药未出土的芽尖为芍药早春萌动后的混合芽剥去外围较大的鳞片后所得的芽尖。

优选的，所述的芍药出土后的茎尖，为芍药植株萌发出土且未显蕾时剥去外围鳞片所得的顶端的茎尖；

优选的，所述的芍药的幼嫩心皮为芍药植株显蕾至柱头授粉前的10天内，剥去花蕾的花瓣后留下的幼嫩心皮。

优选的，所述的芍药茎插所产生不定根的根尖为以芍药茎秆为插穗扦插后所生不定根的根尖1-2cm处。

优选的，所述的芍药植株秋季萌发新根的根尖为芍药肉质根上幼嫩新根的根尖1-2cm处。

优选的，所述的芍药根插后所得不定根的根尖，为芍药肉质根扦插所得到的不定根的根尖1-2cm处。

优选的，所述染色制片的过程中以卡宝品红为染色剂，染色5～6min。

优选的，所述步骤1)中将用于制片的材料置于饱和对二氯苯溶液中，在4℃的条件下预处理10h。

优选的，将固定后的材料转移至1mol/l的盐酸溶液中，在温60℃下解离10min。

本发明中的制片采用常规的制片方法均可实现，主要包括如下步骤：

用解剖针取解离后的材料，并用解剖针捣碎，加卡宝品红溶液1-2滴，再将其搅拌均匀，染色5min后，盖上盖玻片，用滤纸夹住玻片，再用解剖针的另一头轻轻的砸盖玻片，使细胞和染色体分布均匀。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明的染色制片方法适用范围，针对芍药全年范围内分生能力强的组织，均可实现成功的制片。

2)该方法根据时间直接选取芍药不同分生组织或者间接通过对芍药不同器官进行处理后所获得的分生组织作为染色体制片材料，可获得较多分裂相、分散良好、清晰的染色体图像，适用于后期的核型分析。

总之本发明不仅克服了芍药染色体研究中染色体制片取材周期较短、时间受限的问题，而且制片技术成本低廉，简单方便。

附图说明

图1：早春萌动芍药植株根系(箭头所指为新生根尖)。

图2：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间10h，解离时间10min，染色时间5min)。

图3：芍药未出土的混合芽(箭头所指为当年生新芽)。

图4：芍药未出土的芽尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图5：芍药出土后未展叶植株。

图6：芍药出土后的茎尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图7：芍药的幼嫩心皮。

图8：芍药的幼嫩心皮染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图9：芍药茎插后产生不定根(箭头所指为不定根)。

图10：芍药茎插所产生不定根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图11：秋季萌发新根的芍药植株。

图12：芍药植株秋季萌发新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图13：芍药根插后产生不定根。

图14：芍药根插后所得不定根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图15：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间6h，解离时间5min，染色时间3min)。

图16：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间8h，解离时间10min，染色时间5min)。

图17：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间10h，解离时间5min，染色时间5min)。

图18：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(预处理时间10h，解离时间10min，染色时间3min)。

图19：芍药植株早春萌动新根的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像(1mol/l冰醋酸解离时间10min)。

图20：芍药植株春季嫩茎的染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图21：芍药植株夏季未出土地下芽的染色体63倍光学显微镜镜检图像。

图22：芍药植株初冬时期的根尖染色体63倍光学显微镜镜检图像。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例仅用于进一步说明本发明的内容，不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例涉及一种芍药染色体的制片方法，包括如下步骤：

1)取材：于2017年3月中旬早上9:00-11:00，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃挖出中国芍药品种植株，取得早春已萌动的肉质根上幼嫩根系的根尖1-2cm(图1)。

2)预处理：将取得的根尖材料置于装有饱和对二氯苯溶液的离心管中，低温(4℃)预处理10h后，待固定使用。

3)固定：将预处理后的材料从离心管取出，用蒸馏水清洗3遍，再将材料置于滤纸上吸干水分，最后转移至装有卡诺固定液的离心管中，在4℃条件下固定24h以上。固定后不立即使用的材料转移至70％乙醇溶液中保存备用。

4)解离：将固定后的材料用蒸馏水清洗三遍，滤纸吸干水分，转移至装有1mol/l的盐酸溶液的离心管中，在恒温水浴锅中60℃下解离10min后，立即用蒸馏水清洗材料三遍，滤纸吸干水分，待用。

5)染色制片，用解剖针在载玻片上截取根尖顶端乳白色的部位2-3mm压片，并用解剖针捣碎，加卡宝品红溶液1-2滴，再将其搅拌均匀，染色5min后，盖上盖玻片，用滤纸夹住玻片，再用解剖针的另一头轻轻的砸盖玻片，使细胞和染色体分布均匀。待镜检用。

光学显微镜检测效果表明(图2)：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

实施例2

本实施例涉及一种芍药染色体的制片方法，包括如下步骤：

1)取材：于2017年3月底早上9:00-11:00，在小汤山基地挖出中国芍药品种未出土且已萌动的混合芽，剥去外围较大的鳞片，获得刚萌动的芽尖(图3)。

2)预处理：将芽尖置于饱和对二氯苯溶液中，低温(4℃)预处理10h。

3)固定：将预处理后的芽尖用蒸馏水清洗3遍，再将材料置于滤纸上吸干水分，最后转移至卡诺固定液中固定24h(4℃)以上。固定后不立即使用的材料转移至70％乙醇溶液中保存备用。

4)解离：将固定后的芽尖用蒸馏水清洗三遍，滤纸吸干水分，转移至1mol/l的盐酸溶液中，在恒温水浴锅中解离10min(60℃)后，立即用蒸馏水清洗材料三遍，滤纸吸干水分，待用。

5)染色制片：用刀片将解离后的芽尖切成小块进行常规压片法制片。用解剖针将材料进一步捣碎，加卡宝品红溶液1-2滴，再将其搅拌均匀，染色5min后，盖上盖玻片，用滤纸夹住玻片，再用解剖针的另一头那头，轻轻的砸盖玻片，使细胞和染色体分布均匀。待镜检用。

光学显微镜检测效果表明(图4)：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

实施例3

出土后的茎尖染色体制片，具体过程与实施例2类似，区别在于：在2017年4月初早上9:00-11:00取中国芍药品种萌发出土后且未显蕾的顶端茎尖，剥去外围鳞片(图5)。

光学显微镜检测效果表明(图6)：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

实施例4

幼嫩心皮染色体制片，具体过程与实施例2类似，区别在于：在2017年5月初早上9:00-11:00取已显蕾的中国芍药品种花蕾，剥开，除去花瓣，获得幼嫩心皮(图7)。

光学显微镜检测效果表明(图8)：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

实施例5

茎插所产生不定根的根尖染色体制片，具体包括：

1)取材：于2017年5月初上午9:00，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃剪取中国芍药品种茎秆为插穗，并用浓度为300mg/l的iba浸泡4h后扦插于小汤山基地扦插棚内，45d后开始生根(图9)。

于2017年6月底上午9:00-11:00在小汤山基地扦插棚拔出已生出不定根的插穗，用镊子夹取根尖1-2cm。

2)后续的预处理、固定、酸解和染色压片步骤与实施例2完全相同。

光学显微镜检测效果表明(图10)：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

实施例6

秋季萌发新根的根尖染色体制片，具体过程与实施例2类似，区别在于：在2017年10月初早上9:00-11:00从地里挖出中国芍药品种，取肉质根上幼嫩新根的根尖1-2cm(图11)。

光学显微镜检测效果表明(图12)：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

实施例7

根插后所得不定根的根尖染色体制片，具体包括：

2017年10月初分株时，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃剪取中国芍药品种的肉质根为插穗，长为10cm左右，并用浓度为200mg/l的iba浸泡4h后扦插于装有河沙的花盆中，放置在北林科技温室内，冬季温室内温度保持在15℃以上，48d后开始产生不定根(图13)。

于2017年11月底上午9:00-11:00在北林科技温室拔出已生出不定根的插穗，用镊子夹取幼嫩根尖1-2mm。

后续的预处理、固定、酸解和染色压片步骤与实施例2完全一样。光学显微镜检测效果表明(图14)：63倍镜检，染色体清晰可见，长度适合，染色效果好，细胞分散均匀，可计数，且可用做核型分析。经计数，中国芍药品种染色体2n＝10。

对比例1

早春萌动新根的根尖染色体制片，与实施例1相比，其区别在于，预处理的时间，酸解的时间等参数不同，具体包括：

1)取材料：于2017年3月中旬早上9:00-11:00，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃挖出中国芍药品种植株，取得早春已萌动的肉质根上幼嫩根系的根尖1-2cm。

2)预处理：将取得的根尖材料置于装有饱和对二氯苯溶液的离心管中，低温(4℃)预处理6h后，待固定使用。

3)固定：将预处理后的材料从离心管取出，用蒸馏水清洗3遍，再将材料置于滤纸上吸干水分，最后转移至装有卡诺固定液的离心管中，在4℃条件下固定24h以上。固定后不立即使用的材料转移至70％乙醇溶液中保存备用。

4)解离：将固定后的材料用蒸馏水清洗三遍，滤纸吸干水分，转移至装有1mol/l的盐酸溶液的离心管中，在恒温水浴锅中60℃下解离5min后，立即用蒸馏水清洗材料三遍，滤纸吸干水分，待用。

5)染色制片：将解离后的材料进行常规压片法制片。用解剖针在载玻片上截取根尖顶端乳白色的部位2-3mm压片，并用解剖针捣碎，加卡宝品红溶液1-2滴，再将其搅拌均匀，染色3min后，盖上盖玻片，用滤纸夹住玻片，再用解剖针的另一头轻轻的砸盖玻片，使细胞和染色体分布均匀。待镜检用。

光学显微镜检测效果表明(图15)：63倍镜检，染色体长度过长，染色效果较差，细胞未完全解离开，分散不均匀，不可计数。

对比例2

早春萌动新根的根尖染色体制片，具体过程与实施例1类似，区别在于：用饱和对二氯苯溶液预处理根尖材料的时间为8h。

光学显微镜检测效果表明(图16)：63倍镜检，细胞分散均匀，解离效果较好，但是染色体长度仍较长，计数较困难，不可用做核型分析。

对比例3

早春萌动新根的根尖染色体制片，具体过程与实施例1类似，区别在于：在恒温水浴锅中60℃下解离时间控制为5min。

光学显微镜检测效果表明(图17)：63倍镜检，染色效果较差，细胞未完全解离开，分散不均匀，不可计数，不可用做核型分析。

对比例4

早春萌动新根的根尖染色体制片，具体过程与实施例1类似，区别在于，其区别在于，所述步骤5)中，卡宝品红染色时间为3min。

光学显微镜检测效果表明(图18)：63倍镜检，染色体长度适合，细胞分散均匀，可计数，但染色较浅，效果不佳，不可用做核型分析。

对比例5

与实施例1～7相比，其区别在于，所述步骤4)中，采用浓度为1mol/l的冰醋酸在恒温水浴锅中60℃下解离，时间控制为10min。

光学显微镜检测效果表明(图19)：63倍镜检，细胞未解离开，分散不均，无法计数，不可用做核型分析。

对比例6

与实施例1相比，其区别在于，所采用的实验材料为2017年4月中旬至5月上旬的早上9:00-11:00，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃取得芍药植株出土后的嫩茎。

光学显微镜检测效果表明(图20)：63倍镜检，细胞较难解离开，且较少发现分裂相，染色较浅，染色体重叠，无法计数，不可用做核型分析。

对比例7

与实施例1相比，其区别在于，所采用的实验材料为2017年6月中旬至8月上旬的早上9:00-11:00，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃取得芍药植株未出土的地下芽。

光学显微镜检测效果表明(图21)：63倍镜检，发现较少的分裂相，细胞解离较困难，且染色体易重叠，无法计数，不可用做核型分析。

对比例8

与实施例1相比，其区别在于，所采用的实验材料为2017年11月中旬至12月初的早上9:00-11:00，在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山基地芍药种质资源圃取得芍药植株肉质根上的根尖1-2cm。光学显微镜检测效果表明(图22)：63倍镜检，基本上没有观测到分裂相，图像模糊，无法识别细胞与染色体，无法计数，不可用做核型分析。

从实施例1～7和对比例1～8的结果可以看出，用饱和对二氯苯溶液预处理根尖材料的时间为10h，同时在恒温水浴锅中60℃下解离时间为10min，卡宝品红染色时间为5min效果最佳。同时，此方法也适用于芍药未出土的芽尖、出土后的芽尖、幼嫩心皮、茎插所生不定根根尖、秋季萌发新根根尖、根插产生的不定根根尖的染色体制片，从而达到芍药染色体全年制片的效果。

本发明实施例所提供的芍药染色体全年制片技术，成本低廉，操作简单易行，易于掌握，可获得较多分裂相、分散良好、清晰的染色体图像，适用于后期的核型分析和染色体原位杂交等技术。本发明不仅克服了芍药染色体研究中染色体制片取材周期较短、时间受限的问题，同时对制片技术进行了优化，有利于芍药染色体进行深入研究，对多倍体芍药的起源进化、品种分类、不同倍性芍药品种杂交子代的倍性鉴定等研究也具有十分重要的理论和实践意义。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。