用于成像生物分子的装置和方法与流程
本申请要求于2017年1月26日提交的美国临时专利申请序列号第62/450,699号和于2018年1月26日提交的美国专利申请序列号第15/880,531号的优先权，其中每个申请的内容通过引用并入本文并且本文依赖其内容。
背景技术：
在基片上以两个维度来空间分辨生物分子是分子生物学中的重要工具。可以在凝胶或印迹上空间分辨生物分子的复杂混合物的组分，并成像或扫描以测量所感兴趣的特定生物分子的水平。同样地，生物分子可以结合到阵列，或者空间隔离在微量滴定板的孔中，并且可以再次通过成像或扫描来测量。标记生物分子的不同方法需要不同的测量技术来读出分析。
一种成像荧光分子的方法是使用光学扫描头，其中物镜通过设计成能够检测某种荧光团或荧光体的一系列分束器和滤光器连接到光源和检测器。这引导特定波长范围的光以激发荧光团或荧光体，并引导发射的光选择性地通过至检测器。该扫描头可以沿着基片的二维轴线移动，以便获得整个基片的高分辨率荧光读出。或者在某些情况中，基片可以面对物镜以二维方式移动。
将荧光和磷光检测结合到单个装置中并不罕见。购得并维护用于每种技术的专用仪器可能很昂贵，并且会占用实验室的宝贵空间。具有多个读出则创建出灵便的仪器，还同时允许多生物分子的查询。然而，能够检测多“色”的荧光和磷光体可能增加扫描头的数量，增加仪器的复杂性和成本，并且，如果用同一光学扫描头测量的2个荧光团的激发波长和发射波长之间存在重叠，则可能导致灵敏度降低。
扫描通常涉及将基片放置于比基片大得多的扫描床上。扫描整个扫描床导致用于扫描基片周围区域的时间和数据存储的浪费。
因此，仍然存在改进的生物基片分析仪和分析生物基片的方法的需求。本公开满足了这种需求。
技术实现要素：
本公开提供了能够分析生物分子的装置和方法。特别地，本文中公开的仪器能够使用多个波长的光(例如，荧光、化学发光、比色和磷光中的两种或更多种)来便捷有效地扫描和成像生物基片。在一些实施方案中，所述生物分子可以是dna、rna、蛋白质、肽、小分子、催化剂、前体、核苷酸、抗体或其他所感兴趣的生物分子。
在一些实施方案中，所述生物分子将被包含在基片上或基片中。在一些实施方案中，这些生物分子将被分离并包裹在凝胶中。该凝胶可由任何聚合物制成，诸如，琼脂糖、聚丙烯酰胺、淀粉或可用作筛分基质或作为支撑体的任何其它聚合物，用于分离生物分子。在一些实施方案中，在成像步骤之前，所述生物分子将从凝胶转移至由硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯(pvdf)或能够非特异性结合所感兴趣的生物分子的其他材料制成的膜。在一些实施方案中，所述生物分子将在二维阵列中、结合至表面、或在微量滴定板内。
在一些实施方案中，所感兴趣的生物分子将用荧光部分标记。在一些实施方案中，酶将连接至所述生物分子，可以产生化学发光、荧光或产色/比色标记。在一些实施方案中，生物分子将直接用放射性原子标记。在一些实施方案中，将含有放射性标记的生物分子的基片放置于光激发光板或磷光成像屏上，然后可以对其进行扫描。在一些实施方案中，标记的抗体将用于选择性标记所感兴趣的生物分子。
在一些实施方案中，一个以上的扫描或成像技术将能够在单个装置中。在一些实施方案中，单个装置将能够实现扫描荧光染料、磷光体成像、光密度测定、化学发光和比色分析。在一些实施方案中，单个装置将能够实现用2个扫描头同时扫描四种不同的荧光染料、磷光体成像、光密度测定、化学发光和比色分析。
在一些实施方案中，一个光学扫描头将用于检测基片上的多个标记物。在一些实施方案中，双频带发射滤光器(filter，滤波器)将能够检测从基片发射的多个波长的光。在一些实施方案中，可以用一个扫描头同时扫描两个荧光波长。在一些实施方案中，双频带发射滤光器将允许利用同一光路和组件检测磷光体发射和荧光发射。在一些实施方案中，将使用一个以上的光学扫描头。
在一些实施方案中，多个扫描头将允许一次扫描若干波长。在一些实施方案中，2个扫描头将用于一次扫描多达4个通道(例如，四个不同波长)。
在一些实施方案中，基片会被放置于比基片大的扫描床上。在一些实施方案中，在用光学扫描头扫描之前，将会拍摄所述扫描床的数字图像并经分析以限定基片的边界。在一些实施方案中，将使用电荷耦合器件(ccd)、互补金属氧化物半导体(cmos)、数字相机或其他适当的数字成像技术来获取数字图像。
在一些实施方案中，将使用多种类型的检测器来优化灵敏度。在一些实施方案中，光电倍增管(pmt)将用于300-700nm的波长范围，雪崩光电二极管(apd)用于650-900nm，以及ccd用于在400-900nm的面积、比色、化学发光。
在一些实施方案中，将使用多种类型的光源。在一些实施方案中，激光器和led将用于照射基片。
在一些实施方案中，本公开提供了一种能够区分在单个基片中的至少两类分子的检测仪器，所述检测仪器包括：第一光路，包括激光光源和用于利用具有第一波长的光来扫描基片的第一检测器；和第二光路，包括led光源和用于捕获所述基片在可见波长下的图像的第二检测器。
附图说明
图1示出了根据本公开的一个实施方案的用于同时激发和检测两个荧光标记物的扫描头光路。
图2示出了符合本公开的一个实施方案的扫描装置的示意图。
图3示出了根据本公开的一个实施方案的、能够同时扫描2种荧光染料的扫描头光学设置(setup)和波长分布。
图4示出了根据本公开的一个实施方案的、能够同时对2种荧光染料进行磷光成像或扫描的扫描头光学设置和波长分布。
图5示出了根据本公开的一个实施方案的用于同时激发和检测两个荧光标记物的扫描头光路。
图6示出了根据本公开的一个实施方案的用于由led照射并由ccd相机检测放置在玻璃床上的基片的扫描头光路。
图7a示出了符合本公开的一个实施方案的扫描仪器的示意图，该扫描仪器包括led照射的ccd相机和至少一个激光照射的扫描头。
图7b示出了图7a的扫描仪器的示意图，其中至少一个激光照射的扫描头已缩回，以便能够由led照射的ccd相机来成像。
图8a示出了符合本公开的一个实施方案的从二维电泳凝胶中同时检测两种荧光染料(cy3和cy5)来获得的图像。
图8b示出了符合本公开的一个实施方案的从电泳凝胶中同时检测化学发光和标志物来获得的图像。
图8c示出了符合本公开的一个实施方案的从western印迹中同时检测两种nir染料而获得的图像，一种染料在700nm处可检测到，而另一种在800nm处可检测到。
图8d示出了符合本公开的一个实施方案的从电泳凝胶中检测考马斯染料获得的图像。
图8e示出了符合本公开的一个实施方案的从dna凝胶中检测溴化乙锭染料获得的图像。
图8f示出了符合本公开的一个实施方案的从电泳凝胶中检测磷光成像染料获得的图像。
图8g示出了符合本公开一个实施方案的从细胞内western凝胶中同时检测三种荧光染料获得的图像，一种染料在520nm处可检测到，一种在658nm处可检测，且一种在785nm处可检测。
图8h示出了符合本公开的一个实施方案的从western印迹凝胶中同时检测四种荧光染料获得的图像。
图8i示出了符合本公开的一个实施方案的从微阵列中同时检测两种荧光染料获得的图像，一种染料在520nm处可检测，而一种在658nm处可检测。
图8j示出了符合本公开的一个实施方案的从大鼠脑横截面样品中同时检测三种组织染料获得的图像。
图8k示出了符合本公开的一个实施方案的从天竺葵属植物(pelagorium)茎横截面样品中同时检测两种组织染料获得的图像。
图8l示出了根据本公开的一个实施方案的从蜂头样品中同时检测两种荧光染料获得的图像，一种在488nm处可检测，而另一种在785nm处可检测到。
图8m示出了符合本公开的一个实施方案的从鸡肝组织样品同时检测三种荧光染料获得的图像，一种在488nm处可检测，一种在520nm处可检测，且一种在658nm处可检测。
图8n示出了符合本公开的一个实施方案的从混合组织样品同时检测两种荧光染料获得的图像，一种在658nm处可检测，而另一种在785nm处可检测。
附图仅出于说明的目的描绘了本公开的各种实施方案。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到，在不脱离本文中描述的实施方案的原理的情况下，可以采用本文中所描绘的结构和方法的替代实施方案。
具体实施方式
本文中公开的生物分子成像仪器提供了便捷的生物基片的多重成像，这在迄今为止使用常规基片成像技术是不可能实现的。在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器包括扫描仪和大面积成像器，两者共同能够扫描和成像包含多个不同标记的生物分子的生物基片。在一些实施方案中，生物分子成像仪器包括用于查看合成图像的显示器，该合成图像包括基片的多个单独图像，其中每个单独图像包含对应于单一类型的标记的生物分子的视觉信息。
在其他实施方案中，该仪器致使独立的显示装置显示包括基片的多个单独图像的合成图像，其中每个单独图像包含对应于单一类型的标记的生物分子的视觉信息。在一些实施方案中，在显示的合成图像中每个单独图像以单一独特颜色显示。
本文中公开的生物分子成像仪器能够区分多种类型的标记的生物分子。例如，在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器可以区分用两种、三种或四种类型的生物分子标记的分子，其中每种类型的生物分子用不同的荧光标记来进行标记。
在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器可以区分基片中的第一类分子与该基片中的第二类分子。在一些实施方案中，基片中的第一类分子用荧光标记物标记，并且基片中的第二类分子选自由以下组成的组：用第二不同荧光标记物标记的分子、化学发光分子、比色分子(colorimetricmolecule，显色分子)和磷光分子。在一些实施方案中，基片中的第一类分子是化学发光分子，并且基片中的第二类分子是比色分子或磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子是比色分子，并且第二类分子是磷光分子。
在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器可以区分基片中的第一类分子、基片中的第二类分子以及基片中的第三类分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，并且第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，并且第三类分子是化学发光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，并且第三类分子是比色分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，并且第三类分子是磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用荧光标记物标记的分子，第二类分子是化学发光分子，并且第三类分子是比色分子。在一些实施方案中，第一类分子是用荧光标记物标记的分子，第二类分子是化学发光分子，并且第三类分子是磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用荧光标记物标记的分子，第二类分子是比色分子，并且第三类分子是磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子是化学发光分子，第二类分子是比色分子，并且第三类分子是磷光分子。
在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器可以区分基片中的第一类分子、基片中的第二类分子、基片中的第三类分子以及基片中的第四类分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，并且第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，并且第四类分子是化学发光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，并且第四类分子是比色分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，并且第四类分子是磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是化学发光分子，并且第四类分子是比色分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是化学发光分子，并且第四类分子是磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用荧光标记物标记的分子，第二类分子是化学发光分子，第三类分子是比色分子，并且第四类分子是磷光分子。
在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器可以区分基片中的第一类分子、基片中的第二类分子、基片中的第三类分子、基片中的第四类分子以及基片中的第五类分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子，并且第五类分子是化学发光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子，并且第五类分子是比色分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子，并且第五类分子是磷光分子。
在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器可以区分基片中的第一类分子、基片中的第二类分子、基片中的第三类分子、基片中的第四类分子、基片中的第五类分子以及基片中的第六类分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子，第五类分子是化学发光分子，并且第六类分子是比色分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子，第五类分子是化学发光分子，并且第六类分子是磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子，第五类分子是比色分子，并且第六类分子是磷光分子。
在一些实施方案中，本文中公开的生物分子成像仪器可以区分基片中的第一类分子、基片中的第二类分子、基片中的第三类分子、基片中的第四类分子、基片中的第五类分子、基片中的第六类分子以及基片中的第七类分子。在一些实施方案中，第一类分子是用第一荧光标记物标记的分子，第二类分子是用第二不同荧光标记物标记的分子，第三类分子是用第三不同荧光标记物标记的分子，第四类分子是用第四不同荧光标记物标记的分子，第五类分子是化学发光分子，第六类分子是比色分子，并且第七类分子是磷光分子。
图1公开了用于通过扫描头检测生物分子的光路的代表性示意图。在使用扫描头的典型模式中，使用光学扫描头100扫描基片s。来自光源118的光被分束器114反射出，随后被分束器112反射出，然后通过物镜102而被聚焦在基片101上。在用荧光分子标记基片的情况中，荧光分子由激光激发并发出荧光，发射与激光不同波长的光。该光可以穿过物镜102，由分束器112反射，然后穿过分束器114，该分束器114经选择以反射激光波长的光并允许荧光发射波长的光穿过。发射滤光器108用于消除不来自于预期荧光团的光。在一些实施方案中，发射滤光器108是双频带发射滤光器，其消除不来自于两个预期荧光团中的任一个的光。最后，荧光发射光(例如，一个或两个荧光波长的光)通过聚焦透镜104聚焦到检测器122上。
同样地，可以通过来自第二光源120的光用同一扫描头来读取第二荧光团，该光反射出分束器116，并穿过分束器112，然后通过物镜102被聚焦并激发基片101上的第二荧光团。从该第二荧光团发射的光将穿过物镜102，穿过分束器112和分束器116，最终穿过发射滤光器110、聚焦透镜106并到达检测器124上。
通过选择合适的分束器112、114和116，可使用一个扫描头同时读取两个荧光团。在一些实施方案中，用于两个荧光团的光路在发射光谱中具有最小重叠，由此发射的荧光波长之间的串扰被最小化。
图2公开了生物分子扫描仪200的代表性示意图。基片202放置于扫描床204上。可以以几种不同的方式询问基片。ccd206可用于使用特定颜色的led210(比色/光密度测定法)、以暗色(化学发光)或白色或彩色光对基片成像，以在扫描之前在床上建立基片位置。所示的双扫描头208可以同时扫描4种不同的荧光染料，或者可以用于扫描磷光成像屏。在一些实施方案中，ccd206用于在需要扫描的扫描床204的面积内识别所感兴趣的区域。例如，在一些实施方案中，ccd206捕获整个扫描床204的图像(例如，低分辨率图像)，并且相关联的处理器识别扫描床204的发射光或反射来自led210光的较小区域。然后，双扫描头208执行经识别的扫描床204的较小区域的扫描。
图3提供了选择滤光器、分束器、光源和检测器的代表性示例，以能够以单个光学扫描头实现两种颜色扫描。在这种情况下，选择组件扫描“绿色可激发”染料和近红外染料(“nir可激发”)，“绿色可激发”染料可以由525nm光源激发并发射波长在555至585nm之间的光，近红外染料可以由780nm光源激发并发射波长在805到855nm之间的光。当然可以选择光学组件以允许检测在激发或发射波长上不重叠的任何两个荧光团。
图4提供了选择滤光器、分束器、光源和检测器的代表性示例，以能够以单个光学扫描头实现磷光体成像和两种颜色扫描。在这种情况下，选择组件以扫描“红色可激发”染料和“蓝色可激发”染料，“红色可激发”染料可以由635nm光源激发并发射波长在675到735nm之间的光，“蓝色可激发”染料可以由473nm光源激发并发射波长在495到525nm之间的光。通过选择合适的滤光器和分束器，可以使用该同一光学头来读取磷光成像板，其可以使用635nm光源激发并发射波长在370和410nm之间的光。
图5公开了用于由扫描头550检测生物分子的光路的代表性示意图。在使用扫描头550的典型模式中，基片s由来自光源518的光扫描，该光可以穿过清除滤光器528、反射离开分束器514、随后反射离开分束器512，然后通过物镜502被聚焦到基片s上。在基片用荧光分子标记的情况中，荧光分子被激光激发并发出荧光，发射与激光不同波长的光。该光可以穿过物镜502，由分束器512反射，然后穿过分束器514，选择该分束器514以反射激光波长的光并允许荧光发射波长的光穿过。发射滤光器508用于消除不来自于预期荧光团的光。最后，荧光发射光通过聚焦透镜504聚焦到检测器522上。
同样地，可以通过来自第二光源520的光用同一扫描头读取第二荧光团，该光穿过清除滤光器526，反射出分束器516，并穿过分束器512，然后通过物镜502聚焦并激发基片501上第二荧光团。从该第二荧光团发射的光将穿过物镜502，穿过分束器512和分束器516，最后穿过发射滤光器510、聚焦透镜506并到达检测器524上。
通过选择合适的分束器512、514和516，可以使用一个扫描头同时读取两个荧光团。通过设计用于在发射光谱中具有最小重叠的两个荧光团的光路，将使串扰最小化。
在一些实施方案中，光源518是发射520nm光的激光器(例如，pl-520，osramoptosemiconductorsgmbh)，并且光源520是发射784nm光的激光器(例如，gh0781ra2c，sharp)。在这样的实施方案中，物镜502可以具有20mm的焦距(例如，gcl-010612，daheng)。在这样的实施方案中，二向色分束器516可以是单边缘激光平面二向色分束器(例如，di02-r785，semrock)，二向色分束器514可以是单边缘激光平面二向色分束器(例如，ff552-di02，semrock)并且二向色分束器512可以是单边缘激光平面二向色分束器(例如，ff757-di01，semrock)。清除滤光器528可以是单频带带通滤光器(例如，ff01-514/30，semrock)，而清除滤光器526可以是单频带带通滤光器(例如，ff01-769/41，semrock)。发射滤光器508可以是单频带带通滤光器(例如，ff01-565/24，semrock)，而发射滤光器510可以是单频带带通滤光器(例如，ff01-832/37，semrock)。在这样的实施方案中，检测器522可以是雪崩光电二极管(例如，s12023-10，hamamatsu)，而检测器524可以是与检测器522相同或不同的雪崩光电二极管(例如，s12023-10，hamamatsu)。聚焦透镜504、506可以是具有50mm的焦距的平凸透镜(例如，gcl-010107，daheng)。扫描床599可以是合适厚度(诸如，5mm)的玻璃扫描床(例如，bk7glass，glassdynamicsllc)。
在一些实施方案中，光源518是发射520nm光的激光器(例如，pl-520，osramoptosemiconductorsgmbh)，并且光源520是发射658nm光的激光器(例如，ml101j25，mitsubishi)。在这样的实施方案中，物镜502可以具有20mm的焦距(例如，gcl-010612，daheng)。在这样的实施方案中，二向色分束器516可以是单边缘激光平面二向色分束器(例如，ff677-di01，semrock)，二向色分束器514可以是单边缘激光平面二向色分束器(例如，bcome-d15，semrock)，并且二向色分束器512可以是单边缘激光平面二向色分束器(例如，ff593-di03，semrock)。清除滤光器528可以是单频带带通滤光器(例如，ff01-475/28，semrock)，而清除滤光器526可以是单频带带通滤光器(例如，658nmshortpass，filtechphotonics)。发射滤光器508可以是单频带带通滤光器(例如，bcome-0016，semrock)，而发射滤光器510可以是单频带带通滤光器(例如，ff01-710/40，semrock)。在这样的实施方案中，检测器522可以是光电倍增管(例如，h10721-110，hamamatsu)，而检测器524可以是雪崩光电二极管(例如，s12023-10，hamamatsu)。聚焦透镜504、506可以是具有50mm焦距的平凸透镜(例如，gcl-010107，daheng)。扫描床599可以是合适厚度(诸如5mm)的玻璃扫描床(例如，bk7glass，glassdynamicsllc)。
现在参考图6，符合本公开的生物分子扫描仪600包括扫描床699、led光源610、反射镜602、透镜604和ccd相机606。基片s放置于扫描床699上。由led光源610发射的led光穿透扫描床699以照射基片s。然后，从基片s反射的led光从反射镜602反射出。透镜604将反射的光聚焦到ccd相机606用以捕获。生物分子扫描仪600可用于使用特定颜色的led610(比色/光密度测定法)、以暗色(化学发光)或白色或彩色光对基片s成像，以在扫描之前在床上建立基片位置。在一些实施方案中，透镜604具有25mm的焦距和f/0.95的最大孔径(例如，nokton25mm，f/0.95，voigtlander)，并且相机606被配置为每次扫描捕获至少400万像素，诸如，每个图像至少400万像素、至少500万像素或至少600万像素。在一些实施方案中，ccd相机606用于识别需要扫描的扫描床699面积内的所感兴趣的区域。例如，在一些实施方案中，ccd相机606捕获整个扫描床699的图像(例如，低分辨率图像)，并且相关联的处理器识别扫描床699的发射光或反射来自led610的光的较小区域。然后，生物分子扫描仪600对经识别的扫描床699的较小区域进行扫描。
如图7a-7b中代表性所示的，本公开提供了一种扫描仪器700，包括一个或多个激光照射扫描头100/550、led照射的相机750、透明扫描床799和外壳780。在一些实施方案中，一个或多个激光照射扫描头100/550与上述的且代表性地示于图1中的光学扫描头100一致。在其他实施方案中，一个或多个激光照射扫描头100/550与上述的且代表性地示于图5中的光学扫描头550一致。
在一些实施方案中，led照射的相机头750包括led光源710、反射镜702、相机透镜704和相机706。在操作中，如图7a中所示，一个或多个激光照射的扫描头100/550与基片s成一直线移动。然后如上述关于图1或图5所描述的，用一个或多个激光照射的扫描头100/500扫描基片s。一旦一个或多个激光扫描头100/550完成扫描基片s，一个或多个激光扫描头100/550就如图7b中所示地从与基片s成一直线处移出，以使得来自led光源710的led光不会被一个或多个激光照射扫描头100/550阻挡。
然后，继续由led相机头750扫描基片s。led光源710发射的led光穿透扫描床799以照射基片s。然后，从基片s反射的led光从反射镜702反射出。透镜704将反射的光聚焦到ccd相机706用以捕获。在该模式中，扫描仪器700可用于使用特定颜色的led710(比色/光密度测定法)、以暗色(化学发光)或白色或彩色光对基片s成像，以在扫描之前在床上建立基片位置。在一些实施方案中，透镜704具有25mm的焦距和f/0.95的最大孔径(例如，nokton25mm，f/0.95，voigtlander)，并且相机706被配置为每次扫描捕获至少400万像素，诸如每次扫描至少400万像素、至少500万像素或描至少600万像素。
在其他实施方案中，首先由led扫描头750扫描基片s，随后由一个或多个激光照射扫描头100/550进行扫描。在这样的实施方案中，一个或多个激光照射的扫描头100/550如图7b中所示地从与基片s成一直线处移出，以使得来自led光源710的led光不会被一个或多个激光照射扫描头100/550阻挡。由led光源710发射的led光穿透扫描床799以照射基片s。然后，从基片s反射的led光从反射镜702反射出。透镜704将反射的光聚焦到ccd相机706用以捕获。在该模式中，扫描仪器700可用于使用特定颜色的led710(比色/光密度测定法)以暗色(化学发光)或白色或彩色光对基片s成像，以在扫描之前在床上建立基片位置。在一些实施方案中，透镜704具有25mm的焦距和f/0.95的最大孔径(例如，nokton25mm，f/0.95，voigtlander)，并且相机706被配置为每次扫描捕获至少400万像素，诸如每次扫描至少400万像素、至少500万像素或至少600万像素。
此后，关闭led光源710，并且继续由一个或多个激光照射扫描头100/550扫描基片s。如图7a中所示，一个或多个激光照射扫描头100/550与基片s成一直线移动。然后如上述关于图1或图5所描述的，用一个或多个激光照射的扫描头100/500扫描基片s。
在一些实施方案中，一种对生物样品成像的方法，包括将样品放置于符合本公开的成像仪器的扫描床上，用具有第一波长的第一光照射生物样品，捕获从生物样品发射的第一光，用具有第二波长的第二光照射生物样品，并捕获从生物样品发射的第二光，其中在捕获从生物样品发射的第一光之后且在用第二光照射生物样品之前不移动该生物样品。在一些实施方案中，该方法还包括将来自第一捕获光的图案与来自第二捕获光的图案组合以形成合成图像。
在一些实施方案中，对生物样品成像的方法包括：将该样品放置于符合本公开的成像仪器的扫描床上，用具有第一波长的第一光照射生物样品，捕获从生物样品发射的第一光，用具有第二波长的第二光照射生物样品，捕获从生物样品发射的第二光，用具有第三波长的第三光照射生物样品，并捕获从生物样品发射的第三光，其中在捕获从生物样品发射的第一光之后且在用第二光照射生物样品之前不移动生物样品，并且其中在捕获从生物样品发射的第二光之后且在用第三光照射生物样品之前不移动生物样品。在一些实施方案中，该方法还包括将来自第一捕获光的图案与来自第二捕获光的图案以及来自第三捕获光的图案组合以形成合成图像。
在一些实施方案中，对生物样品成像的方法包括：将该样品放置于符合本公开的成像仪器的扫描床上，用具有第一波长的第一光照射生物样品，捕获从生物样品发射的第一光，用具有第二波长的第二光照射生物样品，捕获从生物样品发射的第二光，用具有第三波长的第三光照射生物样品，捕获从生物样品发射的第三光，用具有第四波长的第四光照射生物样品，并捕获从生物样品发射的第四光，其中在捕获从生物样品发射的第一光之后且在用第二光照射生物样品之前不移动生物样品，其中在捕获从生物样品发射的第二光之后且在用第三光照射生物样品之前不移动生物样品，并且其中在捕获从生物样品发射的第三光之后且在用第四光照射生物样品之前不移动生物样品。在一些实施方案中，该方法还包括将来自第一捕获光的图案与来自第二捕获光的图案、来自第三捕获光的图案以及来自第四捕获光的图案组合以形成合成图像。
在一些实施方案中，本公开提供了合成图像，其包括具有第一颜色的第一图案和具有第二颜色的第二图案，其中第一图案相当于2d或3d生物样品中存在的第一标记的生物分子的图案，并且其中第二图案相当于2d或3d生物样品中存在的第二标记的生物分子的图案，其中第一标记的生物分子和第二标记的生物分子是不同的。在一些实施方案中，第一标记的生物分子在第一波长的光下是可激发的，而第二标记的生物分子在第二不同波长的光下是可激发的。图8a、8b、8c、8i、8k、8l和8n中所示的图像各自符合这样的实施方案。
在一些实施方案中，本公开提供了合成图像，其包括具有第一颜色的第一图案、具有第二颜色的第二图案和具有第三颜色的第三图案，其中第一图案相当于2d或3d生物样品中存在的第一标记的生物分子的图案，第二图案相当于2d或3d生物样品中存在的第二标记的生物分子的图案，并且其中第三图案相当于2d或3d生物样品中存在的第三标记的生物分子的图案，其中第一标记的生物分子、第二标记的生物分子和第三标记的生物分子各自彼此不同。在一些实施方案中，第一标记的生物分子在第一波长的光下是可激发的，第二标记的生物分子在第二不同波长的光下是可激发的，并且第三标记的生物分子在第三不同波长的光下是可激发的。图8g、8j和8m中所示的图像各自符合这样的实施方案。
在一些实施方案中，本公开提供了合成图像，其包括具有第一颜色的第一图案、具有第二颜色的第二图案、具有第三颜色的第三图案、以及具有第四颜色的第四图案，其中第一图案相当于2d或3d生物样品中存在的第一标记的生物分子的图案，第二图案相当于2d或3d生物样品中存在的第二标记的生物分子的图案，第三图案相当于2d或3d生物样品中存在的第三标记的生物分子的图案，并且第四图案相当于2d或3d生物样品中存在的第四标记的生物分子的图案，其中第一标记的生物分子、第二标记的生物分子、第三标记的生物分子和第四标记的生物分子各自彼此不同。在一些实施方案中，第一标记的生物分子在第一波长的光下是可激发的，第二标记的生物分子在第二不同波长的光下是可激发的，第三标记的生物分子在第三不同波长的光下是可激发的，而第四标记的生物分子在第四不同波长的光下是可激发的。图8h中所示的图像符合这样的实施方案。
在一些实施方案中，本公开提供了一种检测仪器，其包括：用于照射基片的第一激发光源；用于照射基片的第二激发光源；第一检测器，用于检测来自第一激发光源的由基片反射或发射的光；以及，第二检测器，用于检测来自第二激发光源的由基片反射或发射的光。在一些实施方案中，检测仪器还包括物镜，来自第一激发光源和第二激发光源的光在照射基片之前通过该物镜。在一些实施方案中，检测仪器还包括第一对二向色分束器，来自第一激发光源的光在照射基片之前穿过该第一对二向色分束器。在一些实施方案中，检测仪器还包括第二对二向色分束器，来自第二激发光源的光在照射基片之前穿过该第二对二向色分束器。在一些实施方案中，检测仪器还包括第一聚焦透镜，从基片反射的光在到达第一检测器之前穿过该第一聚焦透镜。在一些实施方案中，检测仪器还包括第二聚焦透镜，从基片反射的光在到达第二检测器之前穿过该第二聚焦透镜。在一些实施方案中，检测仪器还包括第一发射滤光器，从基片反射的光在到达第一检测器之前穿过该第一发射滤光器。在一些实施方案中，检测仪器还包括第二发射滤光器，从基片反射的光在到达第二检测器之前穿过该第二发射滤光器。在一些实施方案中，检测仪器还包括第一清除滤光器，来自第一激发光源的光在照射基片之前穿过该第一清除滤光器。在一些实施方案中，检测仪器还包括第二清除滤光器，来自第二激发光源的光在照射基片之前穿过该第二清除滤光器。
在一些实施方案中，本公开提供了一种同时检测生物基片中的多种荧光染料的方法，该方法包括：将基片与一种以上的荧光染料接触；用包括至少两个波长的激光同时照射基片；并且，检测从基片反射的至少两个波长的光的强度。在一些实施方案中，该方法还包括在照射基片之前使激光穿过至少两个二向色分束器。在一些实施方案中，该方法还包括在照射基片之前使激光穿过物镜。在一些实施方案中，从基片反射的光在到达至少两个检测器之前穿过至少两个发射滤光器。在一些实施方案中，该方法还包括在照射基片之前使激光穿过至少两个清除滤光器。在一些实施方案中，从基片反射的光在到达至少两个检测器之前穿过至少两个聚焦透镜。在一些实施方案中，接触基片的步骤包括将基片与选自由以下染料组成的组中的至少两种染料接触：花菁3(cy3)、花菁5(cy5)、近红外(nir)染料、考马斯蓝染料、溴化乙锭和磷光成像染料。在一些实施方案中，基片是电泳凝胶。在一些实施方案中，该方法包括：用包括两个波长的激光同时照射基片；并且检测从基片反射的两个波长的光的强度。在一些实施方案中，该方法包括用包括：用包括三个波长的激光同时照射基片；并检测从基片反射的三个波长的光的强度。在一些实施方案中，该方法包括：用包括四个波长的激光同时照射基片；并且检测从基片反射的四个波长的光的强度。在一些实施方案中，检测从基片反射的至少两个波长的光的强度的步骤包括检测从基片表面上的多个点反射的至少两个波长的光的强度。在一些实施方案中，该方法还包括将检测到的至少两个波长的光的强度的第一视觉表示显示为第一二维图像。在一些实施方案中，该方法还包括：用来自led光源的光照射基片；并检测从基片反射或发射出的至少一个波长的光的强度。在一些实施方案中，检测从基片反射的至少一个波长的光的强度的步骤包括检测从基片表面上的多个点反射的至少一个波长的光的强度。在一些实施方案中，该方法还包括将检测到的至少一个波长的光的强度的第二视觉表示显示为第二二维图像。在一些实施方案中，该方法还包括组合第一视觉表示和第二视觉表示以形成合成的二维图像。在一些实施方案中，该方法还包括：将基片放置于与激光光学连通的扫描床上；用来自led光源的光照射基片；并使用ccd相机检测基片的边界。在一些实施方案中，检测基片边界的步骤发生在用包括至少两个波长的激光同时照射基片的步骤之前，其中用包括至少两个波长的激光同时照射基片的步骤包括用激光仅照射基片的经检测的边界内的面积。
在一些实施方案中，本公开提供了一种能够区分单个基片中至少两种类型的分子的检测仪器，该检测仪器包括：第一光路，包括激光光源和用于利用具有第一波长的光扫描基片的第一检测器；和，第二光路，包括led光源和用于捕获可见波长下的基片图像的第二检测器。在一些实施方案中，第一光路还包括双频带发射滤光器，用于区分荧光发射光和磷光发射光。在一些实施方案中，检测仪器还包括第三光路，第三光路包括第二激光光源和用于利用具有第二不同波长的光扫描基片的第二检测器。在一些实施方案中，检测仪器还包括第四光路，第四光路包括第三激光光源和用于利用具有第三不同波长的光扫描基片的第三检测器。在一些实施方案中，检测仪器还包括第五光路，第五光路包括第四激光光源和用于利用具有第四不同波长的光扫描基片的第四检测器。在一些实施方案中，第一波长选自由以下组成的组：488nm、520nm、658nm和784nm。在一些实施方案中，第一波长和第二波长是不同的并且独立地选自由以下组成的组：488nm、520nm、658nm和784nm。在一些实施方案中，第一波长、第二波长和第三波长是不同的并且独立地选自由以下组成的组：488nm、520nm、658nm和784nm。在一些实施方案中，第一波长、第二波长、第三波长和第四波长是不同的并且独立地选自由以下组成的组：488nm、520nm、658nm和784nm。在一些实施方案中，第一波长和第二波长是不同的并且独立地选自由以下组成的组：658nm和784nm。在一些实施方案中，第一波长、第二波长和第三波长是不同的并且独立地选自由以下组成的组：488nm、520nm和658nm。在一些实施方案中，如果光路中的任何一者包括发射488nm或520nm的光的激光光源，则检测仪器还包括光电倍增管。在一些实施方案中，如果任何光路包括发射658nm或784nm的光的激光光源，则检测仪器还包括雪崩光电二极管。在一些实施方案中，第一光路和第三光路容置于第一扫描头内，并且其中第四光路和第五光路容置于光学上不同于第一扫描头的第二扫描头内。在一些实施方案中，第二检测器是ccd相机。
在一些实施方案中，本公开提供了从基片得到的合成图像，该合成图像包括：第一图案，具有第一颜色并相当于基片中的第一类分子的第一图案；第二图案，具有第二颜色并相当于基片中的第二类分子的第二图案；第三图案，具有第三颜色并相当于基片中的第三类分子的第三图案，其中第一颜色、第二颜色和第三颜色各自不同，其中第一类分子选自由以下组成的组：包含荧光标记物的分子、化学发光分子、比色分子和磷光分子，其中，第二类分子不同于第一类分子并选自由以下组成的组：包含荧光标记物的分子、化学发光分子、比色分子和磷光分子，带有的第一条件是，如果第一类分子是化学发光分子，则第二类分子不是化学发光分子且第三类分子不是化学发光分子，第二条件是，如果第一类分子是比色分子，则第二类分子不是比色分子且第三类分子不是比色分子，并且，第三条件是，如果第一类分子是磷光分子，则第二类分子不是磷光分子且第三类分子是不是磷光分子。在一些实施方案中，第一图案、第二图案和第三图案各自从基片得到、而不需移动基片。在一些实施方案中，第一类分子、第二类分子和第三类分子中的至少两者包括荧光标记物。在一些实施方案中，第一类分子包含第一荧光标记物，第二类分子包含第二荧光标记物，且第三类分子包含第三荧光标记物。在一些实施方案中，合成图像还包括第四图案，具有第四颜色并相当于基片中的第四类分子的第四图案，其中第四类分子选自由以下组成的组：包含荧光标记物的分子、化学发光分子、比色分子和磷光分子，第四条件是，如果第一、第二或第三类分子中的任何一者是化学发光分子，那么第四类分子不是化学发光分子，第五条件是，如果第一、第二或第三类分子中的任何一者是比色分子，那么第四类分子不是比色分子，并且第六条件是，如果第一、第二或第三类分子中的任何一者是磷光分子，那么第四类分子不是磷光分子。在一些实施方案中，第一类分子包含第一荧光标记物，第二类分子包含第二荧光标记物，第三类分子包含第三荧光标记物，且第四类分子包含第四荧光标记物。在一些实施方案中，第一图案、第二图案和第三图案中的至少一个由包括激光光源和光电倍增管或雪崩光电二极管的光路捕获。在一些实施方案中，光路还包括双频带发射滤光器。在一些实施方案中，第一图案、第二图案和第三图案中的至少一个由包括led光源和ccd相机的光路捕获。在一些实施方案中，第一图案、第二图案和第三图案中的至少一个具有10μm或更小的分辨率。在一些实施方案中，基片是电泳凝胶。在一些实施方案中，基片是pvdf膜。在一些实施方案中，基片是多孔板。在一些实施方案中，基片是植物、动物或植物或动物的一部分。
实施例
根据以下实施例可以进一步理解实施方案的方面，这些实施例不应被解释为以任何方式进行限制。
实施例1.使用双扫描头同时扫描4种荧光染料。将由在标准条件下生长并用500ng/ml胰岛素处理的ht-29细胞培养物制备的细胞裂解物在含有laemmle缓冲液的十二烷基硫酸钠(sds)中裂解，并且在10％聚丙烯酰胺凝胶上以1000v进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)1小时。然后，通过电印迹将分离的蛋白质从凝胶转移到pvdf膜上。使用标准程序洗涤和封闭该膜，并且与4种不同细胞蛋白的抗体在室温下一起孵育2小时，每种用不同的荧光染料(alexa
双扫描头208的扫描头1中的光学组件在图2中概述。在该实施例中，将使用525nm的二极管激光器作为光源118来激发alexa
扫描头2使用图4中的组件构建，以激发并测量alexa
ccd检测器206拍摄整个扫描床的图像，并且嵌入的软件处理图像以在扫描床上找到印迹的位置。然后光学扫描头移动到印迹的位置并开始沿着印迹的长度移动以测量整个印迹上的荧光。将生成的扫描图像提供给操作员进行分析。
实施例2.使用图2的光学设置的rna结合测定。通过标准方法在琼脂糖凝胶上分离的rna样品根据标准方法转移到硝酸纤维素膜上并封闭，然后用由α32p标记的核苷酸标记的dna进行探测。然后将膜洗涤，用塑料包裹物包裹并放置于磷光成像屏上120分钟，以使板上的磷光体吸收来自放射性标记的能量。然后将磷光成像屏加载到实施例1中描述的仪器的扫描床上。
光学扫描头2具有图4中概述的组件。此设置用于前述的实施例中，以读取红色和蓝色染料，但也可用于扫描磷光成像屏。这里，使用在光源位置120中的625nm二极管激光器激发屏上的磷光体。磷光体在激发后发射400nm的光，其通过物镜被捕获、被分束器112反射、穿过分束器114、并穿过双频带发射滤光器108、通过聚焦透镜104到达pmt检测器122上。
ccd检测器206拍摄整个扫描床的图像，以用于在扫描床上找到印迹的位置。然后光学扫描头移动到印迹的位置并开始沿印迹的两个轴线扫描以测量整个印迹上的荧光。将生成的扫描图像提供给操作员进行分析。
实施例3.用考马斯蓝染色凝胶的光密度测定法进行蛋白质凝胶成像。根据标准方案在sds-page凝胶上分离蛋白质样品，并使用25％异丙醇、10％乙酸的混合物将蛋白质固定在凝胶中60分钟。然后将凝胶在60mg/l的coomassiebluer-250的10％乙酸溶液中染色，并在10％乙酸中脱色以除去非特异性结合的考马斯蓝。
然后将该凝胶放置于与用于实施方案1、2和3相同的仪器中的扫描仪床上。蓝色led用于照射凝胶，并且凝胶下方的ccd测量通过凝胶透射的光。然后所得图像可用来确定凝胶上不同位置的蛋白质密度。
实施例4.化学发光凝胶成像。将由在标准条件下生长并用500ng/ml胰岛素处理的ht-29细胞培养物制备的细胞裂解物在含有laemmle缓冲液的十二烷基硫酸钠(sds)中裂解，并在10％聚丙烯酰胺凝胶上以1000v进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)1小时。然后，通过电印迹将分离的蛋白质从凝胶转移到pvdf膜上。用标准程序洗涤并封闭膜，并与抗erk一抗(millipore06-182)在室温下一起孵育2小时。洗涤膜，然后与辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗兔二抗(thermofisher81-6120)以1：10,000的稀释度在室温下孵育30分钟。然后用缓冲液漂洗膜并准备加载到检测仪器200中。
将膜放置于扫描床204上，并用鲁米诺和过氧化物混合物(cat#34075，thermofisherscientificinc.，pittsburgh，pa)覆盖以引发化学发光。ccd206用于捕获化学发光的图像。然后所得图像可以用来确定凝胶上不同位置的蛋白质密度。
实施例5.使用双扫描头同时扫描4种荧光染料。将由在标准条件下生长并用500ng/ml胰岛素处理的ht-29细胞培养物制备的细胞裂解物在含有laemmle缓冲液的十二烷基硫酸钠(sds)中裂解，并在10％聚丙烯酰胺凝胶上以1000v进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)1小时。然后，通过电印迹将分离的蛋白质从凝胶转移到pvdf膜上。使用标准程序洗涤和封闭膜，并与4种不同细胞蛋白的抗体在室温下一起孵育2小时，每种用不同的荧光染料(alexa
双扫描头208的扫描头1中的光学组件在图2中概述。在该实施例中，将使用525nm二极管激光器作为光源518激发alexa
扫描头2使用图4中的组件构建以激发并测量alexa
ccd检测器206拍摄整个扫描床的图像，并且嵌入的软件处理图像以在扫描床上找到印迹的位置。然后光学扫描头移动到印迹的位置并开始沿着印迹的长度移动以测量整个印迹上的荧光。将生成的扫描图像提供给操作员进行分析。
实施例6.使用图2的光学设置的rna结合测定。通过标准方法在琼脂糖凝胶上分离的rna样品根据标准方法转移到硝酸纤维素膜上并封闭，然后用由α32p标记的核苷酸标记的dna进行探测。然后将膜洗涤，用塑料包裹物包裹并放置于磷光成像屏上120分钟，以使板上的磷光体吸收来自放射性标记的能量。然后将磷光成像屏加载到实施例5中所述仪器的扫描床上。
光学扫描头2具有图4中概述的组件。此设置用于前述的实施例中，以读取红色和蓝色染料，但也可用于扫描磷光成像屏。这里，使用在光源位置520的625nm二极管激光器激发屏上的磷光体。磷光体在激发后发射400nm的光，其通过物镜捕获、由分束器512反射、穿过分束器514，并且穿过双频带发射滤光器508、通过聚焦透镜504到达pmt检测器522上。
ccd检测器206拍摄整个扫描床的图像，用于在扫描床上找到印迹的位置。然后光学扫描头移动到印迹的位置并开始沿印迹的两个轴线扫描以测量整个印迹上的荧光。将生成的扫描图像提供给操作员进行分析。
实施例7.在2d凝胶中同时显色cy3和cy5标记的裂解物组分。根据染料制造商的说明书，用cyaninedye3(“cy3”)标记未处理的hela裂解物。然后根据染料制造商的说明书，用cyaninedye5(“cy5”)标记处理过的hela裂解物。然后将双标记的hela裂解物加载到凝胶中，并使用一维的等电聚焦(“ief”)和在第二正交维度上的sds-page进行分离。使用符合本公开的生物分子扫描仪对经处理的凝胶成像，所述生物分子扫描仪包括发射520nm光的第一激光器和发射658nm光的第二激光器。扫描的凝胶在图8a中再现。较短波长的光致使cy3标记的hela裂解物组分发出第一绿色的荧光，而较长波长的光则致使cy5标记的hela裂解物组分发出第二橙色的荧光。
实施例8.化学发光和荧光标记的蛋白质的同时显色。通过使用sds-page和标准laemmli运行缓冲液进行凝胶电泳来制备蛋白质印迹，然后使用转移缓冲液(azuretransferbuffer#ac2127，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)转移至pvdf膜。使用印迹封闭缓冲液(azurechemiblotblockingbuffer#ac2148，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)在室温下将膜封闭30分钟。然后将印迹在室温下与鸡抗转铁蛋白抗体在印迹封闭缓冲液(azurechemiblotblockingbuffer#ac2148，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)中伴随温和搅拌一起孵育一小时。然后用至少0.5ml/cm2的膜印迹洗涤缓冲液(azureblotwashingbuffer#ac2113，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)，快速洗涤印迹两次，然后再洗涤三次，每次5分钟。然后在室温下将印迹与抗鸡二抗在印迹封闭缓冲液(azurechemiblotblockingbuffer#ac2148，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)中伴随温和搅拌一起孵育一小时，然后按如上所述地快速洗涤两次并再洗涤三次，每次5分钟。根据制造商的说明书制备化学发光hrp基片(radiancechemiluminescenthrpsubstrate#ac2101，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)，并以0.1ml/cm2放置于印迹上2分钟。排出过量的化学发光hrp基片，然后在符合本公开的生物分子扫描仪上对印迹成像，包括具有16位、2688-2200分辨率的16×13cm化学发光成像面积。该图像在本文中的图8b中再现。
实施例9.同时检测两种近红外荧光标记物。通过使用sds-page和标准laemmli运行缓冲液进行凝胶电泳来制备蛋白质印迹，然后使用转移缓冲液(azuretransferbuffer#ac2127，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)转移至pvdf膜。使用印迹封闭缓冲液(azurefluorescentblotblockingbuffer#ac2190，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)在室温下将膜封闭30分钟。然后在室温下将印迹与小鼠抗stat1抗体和兔抗磷酸化stat1抗体在荧光印迹封闭缓冲液(azurefluorescentblotblockingbuffer#ac2190，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)中伴随温和搅拌一起孵育一小时。然后用至少0.5ml/cm2的膜荧光印迹洗涤缓冲液(azurefluorescentblotwashingbuffer#ac2145，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)将印迹快速洗涤两次，然后再洗涤三次，每次5分钟。随后在室温下将印迹与抗小鼠二抗(azurespectraanti-mouse700secondaryantibody#ac2129，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)和抗兔二抗(azurespectraanti-rabbit800secondaryantibody#ac2134，azurebiosystems)在荧光封闭缓冲液(azurefluorescentblotblocking#ac2190，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)中伴随温和搅拌一起孵育一小时。然后如上所述地快速洗涤印迹两次，并再洗涤三次，每次五分钟，然后在具有至少0.5ml/cm2膜的pbs中漂洗五分钟。干燥后，使用符合本公开的生物分子扫描仪对膜进行成像，该仪器包括发射658nm光的第一激光器和发射784nm光的第二激光器。扫描图像在此如图8c再现，其中抗小鼠二抗标记的组分显示为红橙色条带，而用抗兔二抗标记的组分显示为绿色条带。
实施例10.可见光和化学发光凝胶条带的同时显色。根据本领域熟知的标准方案，在laemmli运行缓冲液中使用sds-page在凝胶上分离蛋白质标志物和含蛋白质的测试样品。然后凝胶从电泳盒中移除，并在托盘中与25ml快速考马斯染色剂(generonquickcoomassiestain，cat#gen-qc-stain-1l，generonltd，sloughuk)在室温下孵育一小时。然后将凝胶重新定位到超纯水中以脱色。脱色的凝胶在符合本公开的生物分子扫描仪上成像，该生物分子扫描仪包括led灯和配置为捕获可见光的ccd相机，以及发射波长658nm的光的激光源。图像在此如图8d再现。
实施例11.在琼脂糖凝胶中显色少量核酸材料。根据本领域熟知的标准方案制备水中分子量梯度的1：1稀释系列。根据本领域熟知的标准方案，将琼脂糖凝胶(0.8％)在1×tae中与溴化乙锭(“etbr”)以1：10,000的比例铸型。将10μl的每种稀释液加载到琼脂糖凝胶的孔中。分子量梯状样品的分离在70v下在1×tae中发生120-150分钟。一旦电泳分离完成，使用符合本公开的生物分子扫描仪对凝胶成像，该生物分子扫描仪包括发射520nm光的激光器。代表性的扫描图像在此如图8e再现，其中左泳道的质量为1250pg(箭头)，最右泳道的质量为20pg(箭头)。
实施例12.磷光体-放射性标记的生物分子的无膜(flimless)放射自显影。将包含范围在0.004μci/g至1,000μci/g的切片的市售可得的碳-14标准品(cat#arc0146f，americanradiolabeledchemicals，inc.，st.louis，mo)暴露于具有0.9dpm/mm2/hr的灵敏度的bas-ms存储磷光体屏(cat#is1011，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)三小时。然后使用符合本公开的生物分子扫描仪对存储磷光体屏进行成像，该生物分子扫描仪包括发射658nm光的激光器和光电倍增管检测器。确定检测极限仅为0.036μci/g，且检测线性(r2＝0.99)超过5.4个数量级。扫描图像在此再现如图8f。
实施例13.通过细胞内western印迹的原位检测蛋白质。将hela细胞连续稀释并以0.2ml/孔的体积接种到无菌96孔组织培养板中，并生长至约80％融合。然后将所有孔固定并在室温下使用100％甲醇渗透15分钟。然后用pbs漂洗细胞，并用pbs中的1％鱼明胶在室温下封闭一小时。然后在4℃下用小鼠α-微管蛋白和兔β-肌动蛋白探测封闭的细胞过夜。然后用pbs洗涤孔三次，然后与抗兔缀合二抗(azurespectraanti-rabbit550，cat#ac2158，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)和抗小鼠缀合二抗(azurespectraanti-mouse800conjugatedsecondaryantibody，cat#ac2135，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)在室温下一起孵育60分钟。然后将所有孔中的细胞用远红细胞膜可渗透的核染料(reddottm1，cat#40060-1，biotium，inc.，fremont，ca)染色，符合制造商的说明书作为标准化对照。然后用pbs洗涤孔三次。使用符合本公开的生物分子扫描仪在多个波长下扫描孔，该生物分子扫描仪包括发射520nm光的led、发射658nm光的第一激光器和发射785nm光的第二激光器、光电倍增管检测器和雪崩光电二极管检测器。将三个激发波长中的每一个的捕获图像组合成单个合成图像，其在此如图8g再现。
实施例14.同时检测四种不同的荧光探针。使用sds-page和标准laemmli运行缓冲液，通过4-15％的三甘氨酸凝胶电泳从hela细胞样品或掺入转铁蛋白的hela细胞样品制备蛋白质印迹，然后使用转移缓冲液(azuretransferbuffer#ac2127，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)转移至低荧光pvdf膜(cat#ac2105，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)。使用印迹封闭缓冲液(azurefluorescentblotblockingbuffer#ac2190，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)在室温下将膜封闭30分钟。然后在室温下将印迹与抗转铁蛋白抗体(cat#ac2185，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)、山羊抗大鼠微管蛋白(cat#ac2162，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)、山羊抗兔肌动蛋白(cat#ac2128，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)和山羊抗鸡gaphd(cat#ac2137，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)在印迹封闭缓冲液(azurefluorescentblotblockingbuffer#ac2190，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)中伴随温和搅拌一起孵育一小时，其中抗转铁蛋白抗体用在约490nm处可激发以发射约515nm的荧光染料(azurespectra490，cat#ac2185，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)标记。用至少0.5ml/cm2的膜荧光印迹洗涤缓冲液(azurefluorescentblotwashingbuffer，cat#ac2190，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)将印迹快速洗涤两次，并再洗涤三次，每次5分钟。然后在室温下将经洗涤的印迹与抗大鼠、抗兔和抗鸡二抗(分别为catno.ac2162、ac2128和ac2137，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)在荧光印迹封闭缓冲液(azurefluorescentblotblockingbuffer，cat#ac2190，azurebiosystemsinc.，dublin，ca)中伴随温和搅拌一起孵育一小时。然后如上所述地将标记的印迹快速洗涤两次，并再洗涤三次，每次5分钟，然后用至少0.5ml/cm2的pbs漂洗五分钟。然后将膜干燥并使用符合本公开的生物分子扫描仪成像，该生物分子扫描仪成像包括发射488nm光的第一激光器和发射520nm光的第二激光器、发射658nm光的第三激光器和发射784nm光的第四激光器；光电倍增管检测器和雪崩光电二极管检测器。扫描图像在此如图8h再现，其中gadph组分显示为绿色条带，肌动蛋白组分显示为红色条带，微管蛋白条带显示为蓝色条带，并且转铁蛋白组分显示为白色条带(从下至上)。
实施例15.多个荧光标记的同时高分辨率成像。扫描仪校准载玻片，包含cy3荧光染料的两倍稀释系列中的第一个斑点阵列和cy5荧光染料的两倍稀释系列中的第二个斑点阵列，斑点中心距为350μm(cat#ds01，fullmoonbiosystems，inc.，sunnyvale，ca)，使用符合本公开的生物分子扫描仪通过在520nm和658nm下同时激发、以10μm的分辨率进行扫描，该生物分子扫描仪包括发射520nm光的第一激光器和发射658nm光的第二激光器。将两个激发波长中的每一个的捕获图像组合成单个合成图像，在此如图8i再现。
已经出于说明和描述的目的呈现了本发明的特定实施方案的前述描述。它们并非旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式，并且显然根据上述教导可以进行许多修饰和变化。选择和描述实施方案是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使得本领域的其他技术人员能够最好地利用本发明和具有各种修饰的各种实施方案以适合于预期的特定用途。本发明的范围旨在由所附权利要求及其等同物限定。
应当理解，前面的描述都只是示例性和说明性的，并不限制本文中所述的方法和装置。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。此外，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。类似地，“包括(comprise)”、“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”不是限制性的。
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