一种肝硬化检测试剂及其在肝硬化检测中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝硬化检测试剂及其在肝硬化检测中的应用。

背景技术：

肝硬化（cirrhosis）是临床常见的慢性进行性肝病，是由于一种或者多种病因长期或者反复作用而形成的弥漫性肝损害。目前认为引起肝硬化前三位最主要的原因是酒精、乙型肝炎病毒（hepatitisbvirus，hbv）和丙型肝炎病毒感染（hepatitiscvirus，hcv）。全球范围内，57%的肝硬化是由hbv(30%)和hcv（27%）引起的，在发展中国家，肝硬化主要是由hbv引起的。

肝硬化临床诊断过程中需要考虑包括临床表现、实验室检查、组织学、影像学以及组织病理学诸多依据。肝组织活检可提供肝纤维化分期的重要信息，但肝组织活检存在一定风险，且单个肝组织活检标本不一定能全面反映肝脏整体的纤维化程度，因而，近年来发展了多项非创诊断技术用于评估肝纤维化，包括测定肝脏硬度的影像学技术、血清学标志和各类评分系统等。血清生化直接指标主要包括透明质酸（ha）、层粘连蛋白（ln）、iii型前胶原肽和iv型胶原等，间接指标主要包括血小板计数（plt）、r-球蛋白、凝血酶原时间（pt）、谷丙转氨酶、胆红素和载体蛋白a1等，但是上述指标诊断或者检测肝硬化均缺乏特异性。各种常用的影像学手段如b型超声、ct、磁共振成像(mri)等可以发现肝包膜增厚、肝表面轮廓不规则、肝实质的回声不均匀增强以及ct值增高或呈结节状、各叶比例改变、脾脏厚度增加及门静脉和脾静脉直径增宽等肝硬化和门脉高压的征象。彩色多普勒超声检查或放射性核素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流情况。

尽管不少研究发现肝脏超声半定量打分与肝组织分级具有良好的相关性，但是对早期肝硬化不够敏感，对于肝纤维化的诊断难以定量化。肝脏弹力测定主要包括瞬时弹性波扫描（fibroscanh或fibrotouch）。此类技术的优点是能够测定更大的范围甚至整个肝脏的弹性情况，在一定程度上弥补了肝活组织检查存在的取样误差；其缺点是肝脏脂肪沉积、腹水、腹腔炎等情况会一定程度影响检测结果。此类技术尚不能区分相邻的肝纤维分期，但对于诊断代偿性肝硬化有一定的临床指导意义。目前市场上无专用于检测肝硬化的试剂盒，临床上大多使用检测肝功能的一些指标以及结合影像学进行诊断。

技术实现要素：

糖蛋白聚糖的成分是通过上百种酶、转录因子、离子通道和蛋白之间复杂的相互作用而形成的，聚糖参与多种分子过程，如蛋白折叠、细胞粘附、分子转移、信号转导、调节受体活性等；因此聚糖的改变与疾病紧密相关。

经过长期的研究发现，肝硬化患者的血清与正常人的相比而言，n-寡聚糖nga2f（agalactosylated,core-a-1,6-fucosylatedbiantennaryglycan），na2（abigalactosylated,core–a-1,6-fucosylatedbiantennary）和na3（atrigalactosylated,tri-antennary）的含量有明显的变化，从而可用于检测肝硬化的标志物。

针对现有的肝硬化的检测中所存在的问题，如血液检查和影像学检测特异性和准确度不高，病理检查有创伤性，抽样有误差性，患者依存性差等；本发明提供一种应用在肝硬化检测中的肝硬化检测试剂。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的一种肝硬化检测试剂，包括c1：不高于2.0%sds，ph为7.5-8.0；c2：混合同体积的20mm的apts和1m的nacnbh3；c3：浓度2~5u/µl的糖苷酶与3~4%的np-40按体积比1:20混合配制；c4：100mm的nh4ac、1~2mu/µl唾液酸酶和双氧水按照体积5:1:14混合；c5：缓冲液。

所述c1的体积为2µl，c2的体积为2µl，c3体积为2µl，c4体积为2µl，c5体积为200µl。

试剂制备：

c1：配制成含有不高于2%sds、ph为7.5~8.0的溶液。

c2：混合同体积的20mm的apts和1m的nacnbh3。

c3：浓度2~5u/µl的糖苷酶与3~4%的np-40按体积比1:20混合配制。

c4：100mm的nh4ac、唾液酸酶（neuraminidase，1~2mu/µl）以及双氧水按照体积5:1:14混合。

c5：缓冲液。

本发明还提供一种组合物在肝硬化检测试剂中的应用，所述组合物由nga2f、na2和na3组成，所述组合物通过nga2f/（na2+na3）的比值来检测肝硬化。

n-糖组图谱检测：

①寡糖链的制备以及标记：取在90~95℃下灭活的血清2µl，加入2µl的c1，混匀放置5min，加入2µl的c2进行标记，37℃反应3h后进行干燥。

②寡糖链的标记后处理：在干燥后的样品中加入2µl的c3，不低于65℃下反应3h后，加入200µl的c5终止反应。

③后续处理：取上述的样品2µl，加入2µl的c4，45℃下反应3h，最后再加入200µl的c5终止反应。

④寡糖链分离分析：取③的液体样品10µl，在abi3500dx仪器下进行n-寡糖链分离，从而得到n-糖组图谱。

⑤数据处理分析：将所得到的n-糖组图谱进行峰值量化，通过函数nga2f/（na2+na3）进行进一步的统计学分析，来检测肝硬化。

本发明的有益效果：

（1）本发明采用具有灵敏度高、操作简单、重复性好、稳定性好以及高通量的n-寡糖链检测方法，根据建立的受试者血清的n-寡糖链图谱，得到受试者血清中的聚糖nga2f，na2，na3峰值，通过函数nga2f/（na2+na3）对959例样本（其中肝硬化样本480例，非肝硬化样本479例）进行检测。结果显示，本检测方法准确度达到84.7%，与现有技术相比，具有更高的准确度。

（2）采用本检测方法，能够让众多肝硬化患者接受常规、无创检测，从而帮助医生以及患者及时检测肝硬化的发生和病情的进展，有望在临床中推广使用。

附图说明

图1为肝硬化血清样本的n-寡糖链图谱；

图2为健康对照组血清样本的n-寡糖链图谱；

图3为检测样本通过nga2f/（na2+na3）所作出的roc特征曲线；检测样本总数为959例，其中肝硬化样本480例，健康对照组样本479例；曲线下面积auc=0.847。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本试剂盒进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件，试剂都为细胞培养专用。

实施例一：

（1）实验设备：

abi3500dx分析仪（appliedbiosystems），pcr，离心机

（2）试剂制备：

c1：配制成含有不高于2%sds、ph为7.5~8.0的溶液。

c2：混合同体积的20mm的apts和1m的nacnbh3。

c3：浓度2~5u/µl的糖苷酶与3~4%的np-40按体积比1:20混合配制。

c4：100mm的nh4ac、唾液酸酶（neuraminidase，1~2mu/µl）以及双氧水

按照体积5:1:14混合。

c5：缓冲液。

（3）n-糖组图谱检测

①寡糖链的制备以及标记：取在90~95℃下灭活的血清2µl，加入2µl的c1，混匀放置5min，加入2µl的c2进行标记，37℃反应3h后进行干燥。

②寡糖链的标记后处理：在干燥后的样品中加入2µl的c3，不低于65℃下反应3h后，加入200µl的c5终止反应。

③后续处理：取上述的样品2µl，加入2µl的c4，45℃下反应3h，最后再加入200µl的c5终止反应。

④寡糖链分离分析：取③的液体样品10µl，在abi3500dx仪器下进行n-寡糖链分离，从而得到n-糖组图谱。

检测样本通过nga2f/（na2+na3）所作出的roc特征曲线；检测样本总数为959例，其中肝硬化样本480例，健康对照组样本479例；曲线下面积auc=0.847。

结果显示，本检测方法准确度达到84.7%，与现有技术相比，具有更高的准确度。采用本发明检测方法，能够让众多肝硬化患者接受常规、无创检测，从而帮助医生以及患者及时检测肝硬化的发生和病情的进展，有望在临床中推广使用。

以上结合附图所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，凡在本发明的精神和原则之内，不需要付出创造性劳动即可做出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。