一种快速测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的方法与流程

本发明涉及药物分析掺伪或掺杂研究领域，特别是伪品或杂质中含有金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的样品的掺伪研究。本发明提供了一种快速测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的分析方法。

背景技术：

药品质量安全问题广受社会关注，中药材，特别是药材饮片的掺伪现象是其中最严重的问题之一，由于中药材的商品价格因素，部分不良商贩向正品药材中掺入异物或价格较低的另一种药材，威胁人民的用药安全。常见的药材掺伪或掺杂包括菟丝子中掺入泥沙、碎小米、藜科或禾本科的种子，以南味五味子充北五味子，山茱萸中掺入果核等。中药饮片也存在掺杂、掺伪现象，通常由于掺伪数量少、掺伪部分形似正品而难以发现。常见的饮片掺伪包括用同科属的其他植物饮片掺入正品药材中(如用平贝母充川贝母、水半夏充姜半夏等)；形似掺伪(如将吉林延龄草切片充重楼饮片、以苦楝皮充山茱萸等)；重量掺伪(如在血管中注入含铅粉的血液的紫河车等)；非药用部位掺伪(如向沉香中掺入大量不含树脂的木块或其他植物的木材)。中药材和饮片的掺伪、掺杂问题严重扰乱了中药市场的正常秩序，阻碍其健康发展，严重影响中药的安全性和有效性。

肉苁蓉在中药中应用广泛且为《中国药典》2015年版一部收载品种，为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉cistanchedeserticolay.c.ma或管花肉苁蓉cistan.chetubulosa(schrenk)wight的干燥带鳞叶的肉质茎，而市场中常有肉苁蓉属其他品种药材掺杂使用。肉苁蓉广泛分布于内蒙古、新疆、甘肃、宁夏等较广大地区，在蒙药、维吾尔药以及中药中较常使用。目前发现存在沙苁蓉切片充肉苁蓉片销售、使用的情况，

同时，由于掺伪饮片性状与正品饮片难以区分，很难挑选出伪品，同时难以较为准确的计算出样品中的掺伪量，从而进行质量评价。这也是监督检验工作中的一大难题。针对市场上存在药材或饮片(不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷)中掺有沙苁蓉，而部分切片通过性状鉴别不易区分正伪品，并且很难准确确定沙苁蓉掺伪比例的问题，我们建立了一种快速测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的分析方法，以更有效地控制药材及饮片的质量。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是针对市场上存在药材或饮片(不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷)中掺有沙苁蓉，而部分切片通过性状鉴别不易区分正伪品，并且通过现有技术很难准确确定沙苁蓉掺伪比例的问题，提供一种快速测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的分析方法，以更有效地控制药材及饮片的质量。

本发明技术方案的第一方面：提供一种快速测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的分析方法，步骤如下：

(1)首先采用四分法从混合均匀的待测药材或饮片中取样，放置于打粉机中粉碎(过4号筛)，获得混合样品粉末。

(2)基于沙苁蓉肉质茎的药材或饮片的性状特征，从四分法取样后剩下的药材或饮片中，挑选出沙苁蓉样品，放置于打粉机中粉碎(过4号筛)，获得沙苁蓉样品粉末。

所述的测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的分析方法，其特征在于，所述步骤(2)沙苁蓉肉质茎的药材或饮片的性状特征基于现有技术中有关沙苁蓉肉质茎植物或饮片的性状特征。沙苁蓉肉质茎的药材性状特征如下所述：

植株高15-70厘米。茎鲜黄色，不分枝或自基部分2-4(-6)枝，直径1.5-2.2厘米，基部稍增粗，生于茎下部的叶紧密，卵状三角形，长0.6-1厘米，宽4-8毫米，两面近无毛，上部的较稀疏，卵状披针形，长0.5-2厘米，宽5-6毫米。穗状花序顶生，长5-1，厘米，直径4-6厘米；苞片卵状披针形或线状披针形，长1.6-2厘米，宽3-7毫米，连同小苞片和花萼裂片外面及边缘被白色或黄白色的蛛丝状长柔毛，边缘甚密，外面毛常脱落；小苞片2枚，比花萼稍短，线形或狭长圆状披针形，基部渐狭；花近无梗。花萼近钟状，长1.2-2.2厘米，顶端4裂至中部或中部以下；裂片线形或长圆状披针形，长1-1.2厘米，基部宽0.2-0.3厘米，常具3脉。花冠筒状钟形，淡黄色，极稀裂片带淡红色，干后常变墨蓝色，极稀不变色，长2.2-3厘米，在花丝着生处密生一圈长柔毛，顶端5裂，裂片近圆形或半圆形，长6-8毫米，宽0.6-1.2厘米，全缘，外面及边缘无毛，内面被稀疏柔毛。雄蕊4枚，花丝着生于距筒基部4-7毫米处，长1.4-1.6厘米，基部密被一小簇黄白色长柔毛，向上渐变无毛，花药长卵形，密被皱曲长柔毛，长3-4毫米，基部具小尖头。子房卵形，长6-7毫米，宽3毫米，侧膜胎座2，花柱比花丝稍长，近无毛，柱头近球形。蒴果长卵状球形或长圆形，长1-1.5厘米，直径约1厘米，具宿存的花柱基部。种子多数，长圆状球形，长约0.4毫米，干后褐色，外面网状。花期5-6月，果期6-8月。

(3)建立沙苁蓉中金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的高效液相色谱分析方法，具体实施方式为：色谱柱为c18柱，以乙腈为流动相a，以0.08％三氟乙酸水溶液为流动相b；流速0.3ml·min^-1，进样量10μl，柱温为40℃，检测波长330nm，梯度洗脱程序如下：

采用上述高效液相色谱分析方法，金石蚕苷和2’-乙酰基金石蚕苷峰形良好，与邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均在6000以上，肉苁蓉与沙苁蓉混合样品主要成分如附图6中所示，经与标准品比对，确认混合样品中主要成分中1号峰为松果菊苷、2号峰为毛蕊花糖苷、3号峰为金石蚕苷、4号峰为异毛蕊花糖苷、5号峰为2’-乙酰毛蕊花糖苷、6号峰为2’-乙酰基金石蚕苷、7号峰为管花苷b。

(4)进一步考察金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的峰面积与掺伪量二者之间的关系，建立沙苁蓉掺伪量计算公式。

本发明专利建立的沙苁蓉掺伪计算公式推导过程如下：

其中金石蚕苷都可以用2’-乙酰基金石蚕苷代替。

(5)采用高效液相色谱法测定混合样品粉末和沙苁蓉样品粉末中的金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的峰面积，通过本发明专利建立的沙苁蓉掺伪计算公式，即可计算出混合样品中沙苁蓉的掺伪比例。

本发明技术方案的第二方面：提供上述测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的分析方法在涉及中药材及饮片掺伪及含量测定等领域中的应用，具体而言，应用于掺杂沙苁蓉的药材或饮片的掺杂量测定中。

有益技术效果：

中药材和饮片的掺伪、掺杂问题严重扰乱了中药市场的正常秩序，阻碍其健康发展，严重影响中药的安全性和有效性，针对中药材及饮片的掺伪问题，我们提供了一种快速测定不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量的方法，可以较为准确地评价不含金石蚕苷或2’-乙酰基金石蚕苷的药材或饮片中沙苁蓉掺伪量，有助于中药材及饮片质量控制，为打击中药材及饮片的掺伪等严重影响中药安全性、有效性的问题提供有力数据支持。

附图说明

图1为市场上收集到的肉苁蓉混合饮片样品。

图2为挑选出的肉苁蓉饮片样品。

图3为挑选出的沙苁蓉切片样品。

图4为金石蚕苷标准品hplc色谱图。

图5为沙苁蓉测定的hplc色谱图。

图6为混合样品测定的hplc色谱图。

图7为金石蚕苷线性方程。

图8为含60％沙苁蓉掺伪混合样品液相色谱图。

图9为掺伪样品呈线性关系。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，但本实施例不以任何方式限定本发明。

1.样品

市场上收集到的肉苁蓉饮片样品，经性状鉴定为肉苁蓉饮片中混有沙苁蓉切片样品。市场上收集到的肉苁蓉混合饮片样品如图1所示，挑选出的肉苁蓉饮片样品如图2所示，挑选出的沙苁蓉切片样品如图3所示。

2.仪器和材料

仪器：watersacquityuplc型高效液相色谱仪，紫外检测器，elmap120h型超声波清洗器(德国elma公司)，milli-q纯水系统，mettlerxs105du十万分之一天平，mettlerae240万分之一天平。

试药：金石蚕苷(成都普菲德生物技术有限公司，纯度97％)

试剂：甲醇(色谱纯，lot.152023,fisher公司)和乙腈(色谱纯，lot.150942,fisher公司)，三氟乙酸(lot.153060，fisher公司)，水为milli-q制超纯水。

3.方法与结果

色谱条件：watersacquityuplchsst3色谱柱(2.1*100mm,1.8μm)；以乙腈为流动相a，以0.08％三氟乙酸水溶液为流动相b；流速0.3ml·min^-1，进样量10μl，柱温为40℃，检测波长330nm，梯度洗脱程序如下：

对照品溶液的制备：精密称取金石蚕苷对照品适量于10ml容量瓶中，以甲醇-水(1:1)混合溶液定容至刻度，即得各对照品储备液。取对照品储备液适量于容量瓶中，甲醇-水(1:1)混合溶液定容至刻度，即得对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡30分钟，超声处理40分钟(功率250w，频率35khz)，放冷，再称定重量，加50％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

3.1测定肉苁蓉饮片中沙苁蓉掺伪量方法的建立

首先采用四分法从混合均匀的待测药材或饮片中取样，放置于打粉机中粉碎，过4号筛，获得混合样品粉末。再基于沙苁蓉肉质茎的性状特征，从四分法取样后剩下的药材或饮片中，挑选出沙苁蓉样品，放置于打粉机中粉碎，过4号筛，获得沙苁蓉样品粉末。分别取沙苁蓉样品、混合样品粉末，精密称定，按3项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μl，分别进样测定，记录28min的hplc色谱图。金石蚕苷标准品hplc色谱图如图4所示。沙苁蓉hplc色谱图如图5所示。混合样品hplc色谱图如图6所示。

3.2金石蚕苷标准曲线的建立

精密吸取系列浓度金石蚕苷对照品溶液分别置于液相小瓶中。分别精密吸取系列浓度混标溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以各对照品质量浓度(μg·ml^-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到金石蚕苷的回归方程(n＝6)：y＝15470x+336676(r＝0.9997)(图7)。检出限为180ng/ml，定量限为580ng/ml，线性范围为0.58ug/ml～5.82mg/ml。

3.3沙苁蓉掺伪量计算公式的建立

将沙苁蓉与肉苁蓉按比例混合，制成含沙苁蓉的百分比为0％、10％、20％、30％、40％、50％、70％、80％、100％共九份混合样品进行测定，考察掺伪样品是否呈线性关系。含60％沙苁蓉掺伪混合样品液相色谱图如图8所示。实验结果表明，掺伪样品呈线性关系，如图9所示。

由此，推导出肉苁蓉饮片中沙苁蓉掺伪量的计算公式为：

其中，各参数如下：p掺％为沙苁蓉的掺伪比例，a1为沙苁蓉样品的金石蚕苷的峰面积，a2为混合样品的金石蚕苷的峰面积，m为混合样品的取样量，m沙1为沙苁蓉样品的取样量。

3.42702号肉苁蓉饮片样品沙苁蓉掺伪量计算结果

采用本实验建立的测定肉苁蓉饮片中沙苁蓉掺伪量方法对2702号肉苁蓉饮片样品中沙苁蓉的掺伪量进行测定，结果沙苁蓉掺伪量为18.6％。采用性状鉴别法进行区分，再称定重量计算沙苁蓉掺伪量为18％，由此可见，采用本方法计算的实验结果较为准确。