本发明涉及一种微生物鉴定方法，特别是一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法。
背景技术：
快速、准确的微生物鉴定在临床诊断、环境卫生监控、食品安全分析、生物工业过程检测以及生物医药研究中具有重要意义。特别是在临床感染性疾病的诊断中，感染微生物的快速、无误鉴别对于医生临床用药具有指导作用，与患者生命和预后息息相关。
传统的基于培养与生化分析法的微生物鉴定耗时很长，通常需要几天时间，极有可能因此延误患者治疗。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)近年被应用于临床病原微生物的菌种鉴定中，其根据不同微生物的特征性蛋白指纹图谱进行菌种鉴定。maldi-tofms分析法是通过对被测样品离子质荷比的测定来进行分析的一种分析方法，其原理如下：将样品和基质混合点在金属靶板上形成共结晶，利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质分子吸收能量使样品吸附并使其电离，生成不同质荷比的带电离子；样品离子在加速电场下获得相同动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间质谱分析器进行质量分析；离子的质荷比(m/z)与飞行时间的平方成正比，经计算机处理，绘制成质量图谱，通过软件分析比较，筛选并确定出特异性图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定。例如，公开号为cn103616434a的专利文献就公开了一种质谱鉴定微生物的方法，其对微生物的鉴定准确率达到99％以上，有效的降低了误判和误报的几率，也降低了由于微生物的误判和误报带来的安全事故。
虽然与传统生化分析法相比，质谱法鉴定病原菌的周期在很大程度上缩短了，但由于质谱法对微生物纯度要求较高，对于临床样品等包含多种微生物的检测样品来说，仍需要花费很长时间从待测试样品中培养出纯菌落，此培养过程通常需要18-24小时，对于生长缓慢的微生物甚至需要更长的时间。公开号为cn109060743a的专利文献公开了一种微生物鉴定方法，其利用功能化碳点与微生物之间产生的荧光强度变化形成特征图谱，并通过数学统计方法实现对微生物的鉴别，虽然其不需要较昂贵的仪器，但是此方法对微生物的鉴别种类及准确度有很大限制，且其在实施时同样需要对微生物进行培养，鉴别时间缩短有限。公开号为cn104136908a的专利文献也公开了一种用于鉴定培养物中微生物的光谱手段和方法，其同样需要对获得的生物样品在血琼脂板中进行12至24小时的培养，这就导致了微生物的整体鉴别时间的延长。
此外，更重要的是，对于待测试样品中某些在培养基中难以生长的微生物，就无法使用质谱等方法进行鉴定了，这严重影响了质谱技术对病原菌检测的速度和准确率。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，大大缩短了质谱样品制备所消耗的时间，极大加快了微生物的鉴定速度，且对难以培养的微生物也能进行快速准确的鉴定。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤a：获得已知包含或可能包含微生物的待测样品；
步骤b：将待测样品点样于单细胞弹射分选仪的样品芯片上；
步骤c：对样品芯片上的微生物进行识别，并将识别为同种属的一定数目的微生物弹射分选至质谱仪的靶板上；
步骤d：通过质谱法鉴定弹射分选出的微生物种属。
作为进一步的优选实施方案，所述步骤b还包括如下操作：将微生物从所述待测样品中分离和/或富集；
作为进一步的优选实施方案，所述待测样品选自血液、血浆、血清、尿液、唾液、组织液、关节液、精液、脑脊液、骨髓抽取液、胃内容物、腹腔灌洗液、痰、支气管脓性分泌物、组织匀浆、骨匀浆、阴道分泌物、抽吸物、拭子及拭子渣液。
作为进一步的优选实施方案，所述待测样品选自食品、药物、药品原料、化妆品、饮用水、非饮用水、土壤和植物材料。
作为进一步的优选实施方案，所述将微生物从所述待测样品中分离和/或富集的方法包括但不限于：过滤法、离心法、沉淀分离法、磁性分离法、磁珠法、电场分离法、免疫富集法、培养法。
作为进一步的优选实施方案，所述对样品芯片上的微生物进行识别的方法包括但不限于：拉曼光谱法、荧光信号检测法、形态学分析法、显微成像法、生化分析法、免疫分析法、核酸探针法。。
作为进一步的优选实施方案，所述步骤d具体包括：加入基质液；获取所述分选出的微生物的质谱图；通过与标准参比质谱图进行比较，得到所检测微生物的种属信息。
本发明的积极效果：本发明采用细胞弹射分选方法获取纯微生物群，以此取代在质谱检测中耗时最长的微生物培养步骤，使得质谱法鉴定时间从至少一天缩短至12小时之内，极大的缩短了从待测试样品送达到出具鉴定结果报告的整体周期，且本发明对难以培养的微生物也能进行快速准确的鉴定，对临床病原菌诊断具有重要意义，同时本发明也适用于兽医检测以及实时监测工业环境中的污染水平、品质控制等领域。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细说明。
本发明提供一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤1：获得已知包含或可能包含微生物的待测样品；
步骤2：将微生物从所述待测样品中分离，并将分离出的微生物进行富集；
步骤3：将富集的微生物点样于单细胞弹射分选仪的样品芯片上；
步骤4：对样品芯片上的微生物进行同种类识别，并将识别为同种属的一定数目的微生物弹射分选至质谱仪的靶板上；
步骤5：通过质谱法鉴定弹射分选出的微生物种属。
其中，步骤2中将微生物进行分离和/或富集的操作，是指通过实施分离和/或富集步骤，使检测样品中的微生物与样品中的其他组分(如非微生物或其组分)分离，并将微生物富集为鉴定与表征所需的密度。其中，分离可以不达到100％，只要微生物所占比例不干扰微生物检测即可。所述的分离富集方法包括所有适用于各种形式待测样品中微生物的分离和/或富集方法，包括但不限于离心法、过滤法等。另外，对于本身就能达到鉴定要求的待测样品，也可以不经分离和/或富集步骤(即步骤2可省略)，直接用于后续鉴定步骤。
步骤4中对微生物进行同种类识别的方法(表征微生物是否为同一种类的方法)，包括但不限于现有方法中的拉曼光谱法、荧光信号检测、形态学分析等，优选拉曼光谱法。
步骤4中所述弹射分选(单细胞弹射分选)，是指将一定数目的识别为同一种类的微生物弹射至质谱仪的靶板上，具体可弹射至靶板中心为原点的一个指定大小的区域内，例如一个直径为0.01mm-10mm的圆形区域范围内。
所述待测样品可以为存在或可能存在微生物的临床样品、非临床样品，以及对微生物的存在和/或种属进行常规或不定期检测的物质样品。
所述临床样品可以为通常在临床或研究实验室中测试的任何类型样品，包括但不限于血液、血浆、血清、血液部分、尿液、唾液、组织液、关节液、精液、脑脊液、骨髓抽取液、胃内容物、腹腔灌洗液、痰、支气管脓性分泌物、组织匀浆、骨匀浆、阴道分泌物、抽吸物、拭子及拭子渣液、其他体液等。
所述非临床样品可以为各种物质，包括但不限于可食用物质、食品(包括饮品)、药物、药品原料、化妆品、饮用水、非饮用水、废水、污水、环境水样(例如，海水、河水、湖水、井水等)、空气、土壤、植物材料(例如，根、茎、叶、花、果实、种子等)、血液制品(例如血清、血浆、血小板、白血细胞组分等)、捐赠器官或组织样品、生物战样品等。
实施例1
本发明优选实施例1提供一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤1：获得已知包含或可能包含微生物的待测样品；
步骤2：将待测样品点样于单细胞弹射分选仪的样品芯片上；
步骤3：利用拉曼光谱法对样品芯片上的微生物进行同种属识别，具体步骤包括：
1)获得微生物单细胞的拉曼图谱；
2)应用相应算法进行聚类分析；
3)标记同种类微生物单细胞的位置，为细胞弹射分选做准备。
步骤4：将识别为同种属的一定数目的微生物弹射分选至质谱仪的靶板上，具体可弹射至以金属靶板的中心为原点的圆形区域内；
步骤5：通过质谱法鉴定弹射分选出的微生物种属，具体操作包括：
1)向所述中心区域加入一定量基质液；
2)获取待测微生物的质谱图；
3)通过与标准参比质谱图进行比较，得到所检测微生物的种属信息。
实施例2
本发明优选实施例2提供一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤1：获得已知包含或可能包含微生物的待测样品；
步骤2：将微生物从所述待测样品中分离，并利用离心法将分离出的微生物进行富集；
步骤3：将富集的微生物点样于单细胞弹射分选仪的样品芯片上；
步骤4：利用荧光信号检测法对样品芯片上的微生物进行同种属识别，具体步骤包括：
1)在将富集的微生物点样于样品芯片之前，使用荧光染料对富集的微生物进行标记，荧光染料可以为所有能够与微生物中某一或某些组分特异性或非特异性结合，并带有和/或产生荧光的染料，包括但不限于nilered、sypro、pyroniny、sybrgreen、hoechst、dapi、redoxsensor、pi、2-nbdg、cfda、dibac4、ethidiumbromide、gfp、yfp或自身荧光蛋白等；
2)将自带荧光蛋白的微生物样品或荧光标记后的微生物样品点样于样品芯片上；
3)通过图像识别对单细胞进行定位；
4)根据自身荧光蛋白或荧光染料的性质，选择合适的激发波长和发射波长探测待测微生物的荧光信号，可选择的激发波长包括但不限于350-400nm、460-500nm、520-580nm，可选择的发射波长包括但不限于400-500nm、500-560nm、580-650nm；
5)应用相应算法进行聚类分析；
6)标记同种类微生物单细胞的位置，为细胞弹射分选做准备。
步骤5：将识别为同种属的一定数目的微生物弹射分选至质谱仪的靶板上，具体可弹射至以金属靶板的中心为原点的圆形区域内；
步骤6：通过质谱法鉴定弹射分选出的微生物种属，具体操作包括：
1)向所述中心区域加入一定量基质液；
2)获取待测微生物的质谱图；
3)通过与标准参比质谱图进行比较，得到所检测微生物的种属信息。
实施例3
本发明优选实施例3提供一种细胞弹射分选与质谱联用的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤1：获得已知包含或可能包含微生物的待测样品；
步骤2：将微生物从所述待测样品中分离，并利用过滤法将分离出的微生物进行富集；
步骤3：将富集的微生物点样于单细胞弹射分选仪的样品芯片上；
步骤4：利用形态学分析法对样品芯片上的微生物进行同种类识别，具体步骤包括：
1)可选步骤：在将富集的微生物点样于样品芯片之前，使用染料对待检测微生物进行染色，可选择染料包括但不限于：美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿、蕃红、伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸、酸性复红、瑞脱氏(wright)染料、基姆萨氏(gimsa)染料、紫丹类染料等等；
2)将未染色或染色后的待检测微生物样品点样于样品芯片上；
3)通过图像识别算法，根据性状、颜色等参数对微生物单细胞形态进行分类分析；
4)标记同种属微生物单细胞的位置，为细胞弹射分选做准备。
步骤5：将识别为同种类的一定数目的微生物弹射分选至质谱仪的靶板上，具体可弹射至以金属靶板的中心为原点的区域内；
步骤6：通过质谱法鉴定弹射分选出的微生物种属，具体操作包括：
1)向所述中心区域加入一定量基质液；
2)获取待测微生物的质谱图；
3)通过与标准参比质谱图进行比较，得到所检测微生物的种属信息。
本发明创新性的将细胞弹射分选与质谱进行联用，可用于对微生物进行快速鉴别。与现有技术相比，本发明使用速度很快的细胞弹射分选方法获取纯微生物群，以此取代在质谱检测中耗时最长的微生物培养步骤，从而极大缩短了从待测试样品送达到出具鉴定结果报告的整体鉴定周期，可从目前的至少1天缩短至12小时之内。另外，对于测试样品中由于难以培养而无法进行质谱检测的微生物，本发明也能够对其进行快速准确鉴别。
本发明的应用领域包括但不限于临床诊断、兽医检测、工业污染检测、食品品质控制等领域。
以上所述的仅为本发明的优选实施例，所应理解的是，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等，均应包含在本发明的保护范围之内。