痕量蛋白检测反应底物及痕量蛋白的快速检测方法与流程

本发明涉及一种痕量蛋白检测反应底物及痕量蛋白的检测方法。

背景技术：

现有方法中对痕量蛋白(0.5～20mg/l)检测常采用高压液相色谱、抗原抗体结合等方法，但是这些方法所需实验材料或设备昂贵，实验过程复杂、导致检出成本高、耗时长(至少1～2天)，因此只适合实验室研究水平检测，不适合工业化生产和质量监控中的快速检测。而且目前可用于快速蛋白检测的方法检出限高，不能满足痕量蛋白(0.5～20mg/l)检测的需要。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有蛋白快速检测方法中检出限高的技术问题，为其提供了一种痕量蛋白检测反应底物及痕量蛋白的快速检测方法。

本发明痕量蛋白检测反应底物500ml由0.05g考马斯亮蓝g250粉末、25ml浓度为95％的乙醇、65ml磷酸和余量的三蒸水制成。

本发明痕量蛋白的快速检测方法按照以下步骤进行：

一、配制梯度标准蛋白液，梯度标准蛋白液分为n个浓度，梯度标准蛋白液中蛋白的浓度最小为0mg/l、蛋白的浓度最大为20mg/l～30mg/l；

二、将痕量蛋白待测样品制成溶液；

三、将步骤一配制的各浓度的梯度标准蛋白液与痕量蛋白待测样品溶液等体积分别加入酶标板，然后加入上述痕量蛋白检测反应底物，避光静置反应10～30分钟，再将酶标板置于酶标仪中，在560nm～610nm下检测反应溶液的吸光值；

四、获得标准曲线公式：

梯度标准蛋白液中蛋白浓度为0mg/l样品测得的吸光值称为本底，其余浓度梯度标准蛋白液测得的吸光值减去本底获得各自对应的标准吸光值；以标准吸光值为纵坐标，梯度标准蛋白液浓度为横坐标，绘制标准曲线散点图，得到标准曲线公式；

五、痕量蛋白待测样品吸光值减去本底后获得相对吸光值，将相对吸光值带入标准曲线公式，计算得到痕量蛋白待测样品的蛋白含量。

本发明方法可用于浓度仅为0.5～20mg/l的痕量蛋白检测，检测过程用时短、检测数据准确、稳定性高。

附图说明

图1是本发明实验一中蛋白浓度测定标准曲线图。

图2是实施例7对比试验检测结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式痕量蛋白快速检测方法按照以下步骤进行：

一、配制梯度标准蛋白液，梯度标准蛋白液分为n个浓度，梯度标准蛋白液中蛋白的浓度最小为0mg/l、蛋白的浓度最大为20mg/l～30mg/l；

二、将痕量蛋白待测样品制成溶液；

三、将步骤一配制的各浓度的梯度标准蛋白液与痕量蛋白待测样品溶液等体积分别加入酶标板，然后加入痕量蛋白检测反应底物，避光静置反应10～30分钟，再将酶标板置于酶标仪中，在560nm～610nm下检测反应溶液的吸光值；

四、获得标准曲线公式：

梯度标准蛋白液中蛋白浓度为0mg/l样品测得的吸光值称为本底，其余浓度梯度标准蛋白液测得的吸光值减去本底获得各自对应的标准吸光值；以标准吸光值为纵坐标，梯度标准蛋白液浓度为横坐标，绘制标准曲线散点图，得到标准曲线公式；

五、痕量蛋白待测样品吸光值减去本底后获得相对吸光值，将相对吸光值带入标准曲线公式，计算得到痕量蛋白待测样品的蛋白含量。

标准曲线公式中r²>0.99。

本实施方式500ml痕量蛋白检测反应底物由0.05g考马斯亮蓝g250粉末、25ml浓度为95％的乙醇、65ml磷酸和余量的三蒸水制成。

本实施方式中梯度标准蛋白液可以由标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白制成。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中n为4～12的自然数。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤三中痕量蛋白检测反应底物与待测样品溶液的体积比为1:1。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本具体实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤三中痕量蛋白检测反应底物的体积为60～140μl。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本具体实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三中痕量蛋白检测反应底物的体积为100～130μl。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本具体实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中在595nm下检测反应溶液的吸光值。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本具体实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤三中避光静置反应15分钟。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本具体实施方式500ml痕量蛋白检测反应底物由0.05g考马斯亮蓝g250粉末、25ml浓度为95％的乙醇、65ml磷酸和余量的三蒸水制成。

本具体实施方式痕量蛋白检测反应底物的配制方法：乙醇中加入考马斯亮蓝g250粉末磁力搅拌，待考马斯亮蓝g250粉末完全溶解后再加入磷酸搅拌溶解，最后加三蒸水定容。痕量蛋白检测反应底物用中性滤纸过滤至棕色瓶中或避光，置于4℃保藏。

实施例1

标准曲线公式的验证

一、配制梯度标准蛋白液，制成浓度分别为0mg/l、3mg/l、6mg/l、9mg/l、12mg/l、15mg/l、18mg/l、21mg/l的标准蛋白液；

二、在酶标板中分别加入0mg/l、3mg/l、6mg/l、9mg/l、12mg/l、15mg/l、18mg/l、21mg/l的标准蛋白液各100μl，然后加入痕量蛋白检测反应底物100μl，避光静置反应10分钟，再将酶标板置于酶标仪中，在595nm下检测反应溶液的吸光值；

三、获得标准曲线公式：

梯度标准蛋白液中蛋白浓度为0mg/l样品测得的吸光值称为本底，其余浓度梯度标准蛋白液测得的吸光值减去本底获得各自对应的标准吸光值；以标准吸光值为纵坐标，梯度标准蛋白液浓度为横坐标，绘制标准曲线散点图，得到标准曲线公式。

本实施例得到标准曲线方程为：y＝0.0101x+0.0092，r²＝0.9922。

实验结果如图1所示，可知在0～21mg/l范围内蛋白与痕量蛋白检测反应底物反应呈现出良好的线性关系，相关系数r²＝0.9922＞0.99，线性相关良好。

实施例2

痕量蛋白快速检测方法：

一、配制梯度标准蛋白液：梯度标准蛋白液分为8个浓度，制成浓度分别为0mg/l、3mg/l、6mg/l、9mg/l、12mg/l、15mg/l、18mg/l、21mg/l的标准蛋白液；

二、将痕量蛋白待测样品制成溶液；

三、将步骤一配制的各浓度的梯度标准蛋白液与痕量蛋白待测样品溶液等体积分别加入酶标板，然后加入痕量蛋白检测反应底物，避光静置反应15分钟，再将酶标板置于酶标仪中，在595nm下检测反应溶液的吸光值；

四、获得标准曲线公式：

梯度标准蛋白液中蛋白浓度为0mg/l样品测得的吸光值称为本底，其余浓度梯度标准蛋白液测得的吸光值减去本底获得各自对应的标准吸光值；以标准吸光值为纵坐标，梯度标准蛋白液浓度为横坐标，绘制标准曲线散点图，得到标准曲线公式：y＝0.0101x+0.0092；

五、痕量蛋白待测样品吸光值减去本底后获得相对吸光值，将相对吸光值带入标准曲线公式，计算得到痕量蛋白待测样品的蛋白含量；

其中，步骤三中痕量蛋白检测反应底物与待测样品溶液的体积比为1:1；

步骤三中痕量蛋白检测反应底物的体积为100μl；

500ml痕量蛋白检测反应底物由0.05g考马斯亮蓝g250粉末、25ml浓度为95％的乙醇、65ml磷酸和余量的三蒸水制成。

实施例3

准确度(回收率)实验：

分析天平精确称量蛋白标准品0.0102g，加1020μl三蒸水溶解，振荡混匀，得到浓度为1×10³mg/l的溶液，精确稀释得到浓度为5mg/l的痕量蛋白待测样品a。

分析天平精确称量蛋白标准品0.0124g，加1240μl三蒸水溶解，振荡混匀，得到浓度为1×10³mg/l的溶液，精确稀释得到浓度为10mg/l的痕量蛋白待测样品b。

分析天平精确称量蛋白标准品0.0132g，加1320μl三蒸水溶解，振荡混匀，得到浓度为1×10³mg/l的溶液，精确稀释得到浓度为15mg/l的痕量蛋白待测样品c。

按照实施例2的方法检测痕量蛋白待测样品a、b、c，做三个平行。检测结果如表1所示。

表1

中国药典中关于样品中待测定成分含量及回收率限度的要求如表2，本实施例实验中测定的三个浓度中5.00mg/l、10.00mg/l属于1μg/g～10μg/g之间，回收率要求在80％-115％范围内，15.00mg/l对应表2回收率要求在85％-110％范围内。本发明方法满足中国药典的要求，而且准确度更高。

表2

实施例4

检测方法精密度实验：

按照实施例2的方法检测浓度为0mg/l、4mg/l、9mg/l、12mg/l、21mg/l的标准蛋白液，每个浓度各做6个平行。检测结果如表3所示。

表3

中国药典中关于样品中待测定成分含量及精密度rld的可接受范围如表4。实验选取的浓度分别为0、4、9、12、21mg/l，其中，0、4、9mg/l三个浓度处于1μg/g-10μg/g之间，中国药典精密度rld小于6即可满足要求，重复性良好。12mg/l、21mg/l两个浓度处于10μg/g-0.01％之间，中国药典精密度rld小于4即可满足要求。实验数据证实本发明方法重复性良好，精密度更高。

表4

实施例5

检出限实验：操作过程与实施例1相同。

方法的检出限的计算基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法，按照lod＝3.3δ/l公式计算。式中：lod—检测限

δ—响应值的偏差

l—标准曲线的斜率

δ通过下列方法测得：

①测定空白值的标准偏差；②标准曲线的剩余标准偏差或截距的标准偏差来代替

本实施例得出的标准曲线公式为y＝0.0132x+0.0174相关系数r²＝0.991，经计算空白值的标准偏差δ为0.002388，得检测限lod值为0.597mg/l。

实施例6

痕量蛋白快速检测方法：

一、配制梯度标准蛋白液：梯度标准蛋白液分为8个浓度，制成浓度分别为0mg/l、3mg/l、6mg/l、9mg/l、12mg/l、15mg/l、18mg/l、21mg/l的标准蛋白液；

二、将痕量蛋白待测样品用三蒸水溶解制成溶液；

三、将步骤一配制的各浓度的梯度标准蛋白液与痕量蛋白待测样品溶液等体积分别加入酶标板，然后加入痕量蛋白检测反应底物，避光静置反应10分钟，再将酶标板置于酶标仪中，在595nm下检测反应溶液的吸光值；

四、获得标准曲线公式：

梯度标准蛋白液中蛋白浓度为0mg/l样品测得的吸光值称为本底，其余浓度梯度标准蛋白液测得的吸光值减去本底获得各自对应的标准吸光值；以标准吸光值为纵坐标，梯度标准蛋白液浓度为横坐标，绘制标准曲线散点图，得到标准曲线公式：y＝0.0101x+0.0092；

五、痕量蛋白待测样品吸光值减去本底后获得相对吸光值，将相对吸光值带入标准曲线公式，计算得到痕量蛋白待测样品的蛋白含量；

其中，步骤三中痕量蛋白检测反应底物与待测样品溶液的体积比为1:1；

步骤三中痕量蛋白检测反应底物的体积为100μl；

500ml痕量蛋白检测反应底物由0.05g考马斯亮蓝g250粉末、25ml浓度为95％的乙醇、65ml磷酸和余量的三蒸水制成。

痕量蛋白待测样品及检测结果如表5所示。

表5

实施例7

对比试验：

底物1——g250-乙醇-10ml磷酸染液

取考马斯亮蓝g2500.lg，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。应用此方法配制出的染液每100ml中含有10ml磷酸，简称为g250-乙醇-10ml磷酸染液。(摘自中国药典2015年版)

底物2——g250-乙醇-11ml磷酸染液

取考马斯亮蓝g2500.lg，加乙醇50ml溶解后，加磷酸110ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。应用此方法配制出的染液每100ml中含有11ml磷酸，称之为g250-乙醇-11ml磷酸染液。

底物3——g250-乙醇-12ml磷酸染液

取考马斯亮蓝g2500.lg，加乙醇50ml溶解后，加磷酸120ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。应用此方法配制出的染液每100ml中含有12ml磷酸，称之为g250-乙醇-12ml磷酸染液。

底物4——g250-乙醇-14ml磷酸染液

取考马斯亮蓝g2500.lg，加乙醇50ml溶解后，加磷酸140ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。应用此方法配制出的染液每100ml中含有14ml磷酸，称之为g250-乙醇-14ml磷酸染液。

底物5——g250-乙醇-15ml磷酸染液

取考马斯亮蓝g2500.lg，加乙醇50ml溶解后，加磷酸150ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。应用此方法配制出的染液每100ml中含有15ml磷酸，称之为g250-乙醇-15ml磷酸染液。

底物6——保质期外伯乐试剂；

底物7——保质期内伯乐试剂；

底物8——本发明痕量蛋白检测反应底物。

分别选用底物1～8采用实施例2记载的方法对同一梯度标准蛋白液进行检测。检测结果如图2所示。

在同时进行的八种检测反应底物对比试验中，本发明痕量蛋白检测反应底物测得的溶液吸光度数值比其他几种底物高，数值变化稳定，最终本发明痕量蛋白检测反应底物标准曲线公式为y＝0.019x+0.202，相关系数r²＝0.9914>0.99，说明本发明痕量蛋白检测反应底物线性相关程度在八种底物中最高。