一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种纤维蛋白原检测试剂及其制备方法，具体涉及一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂及其制备方法，属于医疗器械制造技术领域。

背景技术：

纤维蛋白原(英文：fibrinogen；简称：fib)亦称凝血因子i，是一种由肝脏合成、存在于血浆中、参与血小板凝血过程的蛋白质组分。

目前认为，纤维蛋白原是血小板凝血过程中的重要因素。

纤维蛋白原可以促进血小板的聚集、平滑肌和内皮细胞的生长、增殖和收缩，增加血液粘滞性和外周阻力，引起内皮细胞损伤，促进胶原和去氧核糖核酸合成，促使单核/巨噬细胞向内膜下迁移，促进红细胞粘着，最终导致急性期冠状动脉血栓的形成，因此，成为冠心病发作的危险因素。

临床资料表明：

(1)纤维蛋白原水平升高患者中，多数可发生心肌梗塞或猝死，且纤维蛋白原水平越高，危险性亦越大；

(2)血浆纤维蛋白原升高是促进动脉粥样硬化发病的一个重要因素；

(3)纤维蛋白原升高，血液处于高凝状态，血流速度减慢，血液粘滞性增加，容易产生血栓；

(4)高血压时常伴有纤维蛋白原水平升高，它是诱发和加重高血压的一个重要原因；

(5)纤维蛋白原与脂肪代谢有着密切关系；

(6)此外，老年、吸烟、肥胖、应激、口服避孕药和糖尿病等可以促进体内纤维蛋白原水平升高。

因此，纤维蛋白原在心血管疾病的发病中具有十分重要作用。

高浓度的纤维蛋白原与冠状动脉病变程度明显相关，其作用途径在于其能够增强血小板膜上某些糖蛋白受体如cd62p的表达，从而促进血小板活化，这可能是fib导致冠状动脉病变的重要中间环节之一，因此，加强纤维蛋白原的检测，对预防和治疗心血管疾病有着非常重要的作用。

现有技术中，纤维蛋白原常用检测方法主要为血栓弹力图法。

血栓弹力图法1948年由德国人harter发明，上世纪80年代开始广泛应用于临床，指导术中输血并取得良好效果，现已成为检测凝血功能的最重要方法之一。

利用血栓弹力图法检测凝血功能时，需要使用血栓弹力图仪。

血栓弹力图仪可对一份血样进行完整的监测，包括从凝血开始至血凝块形成及纤维蛋白溶解的全过程，可对凝血因子、纤维蛋白原、血小板聚集功能以及纤维蛋白溶解等方面进行凝血全貌的检测和评估。

血栓弹力图仪检测血凝块的物理特性基于以下原理：

将一特制静止且盛有血样的圆柱形杯以4°45'的角度旋转，每次转动持续10秒。通过一根螺旋丝悬挂且浸泡在血样中的针来检测血样的运动。纤维蛋白与血小板组成的复合物将杯和针粘在一起后，杯旋转所产生的旋转力传递至血样中的针。纤维蛋白与血小板组成的复合物的强度能影响针运动的幅度，以致血凝块能使针的运动与杯的运动同步进行。因此，针的运动幅度与已形成的血凝块的强度有直接关系。当血凝块回缩或溶解时，针与血凝块的联结解除，杯的运动不再传递给针。针的旋转被传感器转换成电信号，这一电信号通过计算机转化测得血栓弹力图。

在利用血栓弹力图仪对血样中的纤维蛋白原功能进行检测时，传统做法包括：

第一步，配制纤维蛋白原的激活试剂；

第二步，将配制的纤维蛋白原激活试剂制备成冻干粉并盛装在西林瓶中；

第三步，检测时，称量出一定量的纤维蛋白原激活试剂冻干粉；

第四步，经计算加入定量的蒸馏水对冻干试剂进行复溶；

第五步，取一定量复溶后的纤维蛋白原激活试剂加入到血样中；

第六步，通过血栓弹力图仪进行检测，借助全血的动态凝固过程监测纤维蛋白原，从而定量计算出患者纤维蛋白原的功能强度。

此种检测方法在对纤维蛋白原功能强度进行检测时，因检测中受到温度、血样储存时间、临床药物、实验操作等因素的影响，血小板会提前激活。

伴随血小板形态和功能的改变，会导致在纤维蛋白原功能检测时，检测振幅中包含血小板因素，使得纤维蛋白原振幅超过实际振幅，影响实验结果的准确性和稳定性，出现纤维蛋白原假阳性结果，给临床检测造成误判，使得患者药物治疗效果不佳；

此外，此种检测方法步骤繁琐，需要称量、计算、复溶、多次加样等繁琐操作，容易造成误差，导致纤维蛋白原激活试剂的稳定性差、测试结果不够准确；

由于此种方法冻干的纤维蛋白原激活试剂为固体粉末状，在使用和运输过程中容易接触空气中的水分和养分导致试剂失效，造成不必要的浪费。

现有技术中，纤维蛋白原的另一种检测方法是：

在纤维蛋白原基础激活试剂中依次加入固相试剂和血小板抑制剂如阿西单抗、埃替非巴肽和替罗非班，形成纤维蛋白原激活试剂；

将纤维蛋白原激活试剂定量分装在样品杯中，并将分装后的样品杯置于西林瓶内，将西林瓶进行冻干，使纤维蛋白原激活试剂粘附在样品杯底；

将冻干后的西林瓶在真空条件下压盖密封，使样品杯处于真空环境；

在肝素抗凝环境下采集全血样本；

将样品杯从西林瓶中取出，置于血栓弹力图仪的杯槽中；

通过加样枪将采集后的全血样本加入样品杯内，启动血栓弹力图仪对全血样本做纤维蛋白原功能检测。

上述检测方法中，需要将完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂与纤维蛋白原激活试剂一起配合后才能完成检测。由于检测试剂中的血小板抑制剂如阿西单抗、埃替非巴肽和替罗非班等抑制血小板的过程为可逆过程，且不能抑制所有的血小板，因此，检测结果假性增高，临床检测中会出现纤维蛋白原假阳性结果。

技术实现要素：

为解决现有技术的上述缺陷，本发明提供一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂及其制备方法，通过血栓弹力图检测法，无需额外添加纤维蛋白原激活剂，就能在完全抑制血小板功能的基础上进行纤维蛋白原功能强度的检测，既能简化检验流程、提高检测效率，又能节约试剂成本，在保证不出现纤维蛋白原假阳性结果的基础上，保证实验结果的准确和可靠。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂，其特征在于，包括：

缓冲液、支持剂、兔脑凝脂、组织因子、血小板抑制剂、血小板抑制增强剂、有机溶剂、生物防腐剂。

进一步的，所述缓冲液由三(羟甲基)氨基甲烷(英文简称：tris)加水溶解并经盐酸调节酸度后制成。

所述缓冲液其ph值为7.0～8.0，所述缓冲液中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为30～100mmol/l。

进一步的，所述支持剂包括nacl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖。

进一步的，所述包括nacl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖的支持剂配制成支持液后，其nacl浓度为50～250mmol/l、甘氨酸浓度为1～6g/l、牛血清白蛋白浓度为10～30g/l、海藻糖浓度为12～40g/l。

进一步的，所述兔脑凝脂在所述检测试剂中的最终浓度为2～10mg/l。

进一步的，所述组织因子在所述检测试剂中的最终浓度为0.2～1mg/l。

进一步的，所述血小板抑制剂为血小板糖蛋白iib/iiia受体抑制剂。

所述血小板糖蛋白iib/iiia受体抑制剂为替罗非班、依替巴肽或阿昔单抗中的一种或多种的组合。

进一步的，在所述检测试剂中，所述替罗非班的最终浓度为50～100mg/l，所述依替巴肽的最终浓度为20～60mg/l，所述阿昔单抗的最终浓度为1～10mg/l。

进一步的，所述血小板抑制增强剂为微管蛋白抑制剂。

所述微管蛋白抑制剂在所述检测试剂中的最终浓度为10～20mg/l。

进一步的，所述有机溶剂为二甲基亚砜。

进一步的，所述生物防腐剂为液体proclin300。

所述液体proclin300在所述检测试剂中的最终体积百分浓度为0.03～0.05％。

一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：

f1)取配制缓冲液的固体缓冲试剂加纯水溶解并经盐酸调节酸度后，配制成缓冲液；

f2)取支持剂，加缓冲液配制成支持液；

f3)取兔脑凝脂加入缓冲液研磨至乳状，再加入缓冲液配制成兔脑凝脂液；

f4)取组织因子再加缓冲液，配制成组织因子液；

f5)取血小板抑制剂加缓冲液，配制成血小板抑制液；

f6)取血小板抑制增强剂加有机溶剂，配制成血小板抑制增强液；

f7)吸取兔脑凝脂液、组织因子液、血小板抑制液、血小板抑制增强液加入支持液中，再加入生物防腐剂，然后加入支持液至全量，混合均匀，即为本发明所述完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂。

作为一种优选的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：

f1)取配制缓冲液的固体缓冲试剂三(羟甲基)氨基甲烷，加纯水溶解并经盐酸调节酸度后，配制成ph值为7.0～8.0且含三(羟甲基)氨基甲烷浓度为30～100mmol/l的缓冲液；

f2)取包括nacl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖的支持剂，加所述缓冲液配制成含nacl浓度为50～250mmol/l、甘氨酸浓度为1～6g/l、牛血清白蛋白浓度为10～30g/l、海藻糖浓度为12～40g/l的支持液；

f3)取兔脑凝脂加所述缓冲液研磨至乳状，再加入所述缓冲液配制成浓度为1g/l的兔脑凝脂液；

f4)取组织因子再加所述缓冲液，配制成浓度为1g/l的组织因子液；

f5)取作为血小板抑制剂中的一种或多种组合的替罗非班、依替巴肽或阿昔单抗，分别加入所述缓冲液，配制成浓度皆为1g/l的替罗非班液、依替巴肽液、阿昔单抗液；

f6)取作为血小板抑制增强剂的微管蛋白抑制剂，加有机溶剂，配制成作为血小板抑制增强液的浓度为1g/l的微管蛋白抑制剂液；

f7)按配制规格要求，分别吸取所述兔脑凝脂液、组织因子液、替罗非班液和依替巴肽液及阿昔单抗液中的一种或多种、微管蛋白抑制剂液加入所述支持液中，再加入生物防腐剂，然后加所述支持液至全量，混合均匀，使最终溶液的ph值为7.0～8.0，最终溶液中的兔脑凝脂浓度为2～10mg/l、组织因子浓度为0.2～1mg/l，作为血小板抑制液中的一种或多种的组合，最终溶液中的替罗非班浓度为50～100mg/l、依替巴肽浓度为20～60mg/l、阿昔单抗浓度为1～10mg/l，作为血小板抑制增强剂的微管蛋白抑制剂其在最终溶液中浓度为10～20mg/l、生物防腐剂的最终体积百分浓度为0.03～0.05％的本发明所述完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂。

一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原冻干检测试剂，其特征在于：

所述完全抑制血小板功能的纤维蛋白原冻干检测试剂为上述任意一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂的定量瓶装冻干品。

一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原冻干检测试剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：

取上述一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂的制备方法或一种优选的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂制备方法所得完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂，定量装瓶冻干，即为本发明所述完全抑制血小板功能的纤维蛋白原冻干检测试剂。

所述定量为20μl/瓶。

与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：

1)本发明通过缓冲液、支持剂、兔脑凝脂、组织因子、血小板抑制剂、血小板抑制增强剂、有机溶剂、生物防腐剂的配伍组合，提供了一种能完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂，此检测试剂/冻干检测试剂具有完全抑制血小板活性的功能，可利用血栓弹力图检测法，在无需额外添加纤维蛋白原激活剂的情况下，就能在保证不出现纤维蛋白原假阳性结果的基础上，进行纤维蛋白原功能强度的检测，保证实验结果的准确和稳定；

2)使用本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂进行纤维蛋白原功能强度检测时，流程简单、检测效率高、试剂使用量少且检测效果好；

3)本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂制备简单方便、成本降低，因此，极具推广应用价值。

附图说明

图1为分别使用本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂与现有技术中的纤维蛋白原检测试剂检测同一血液样本所得检测结果比较图。

图中：

m1-为使用现有技术中的纤维蛋白原检测试剂检测血液样本中的纤维蛋白原功能值所得ma(mm)曲线；

m2-为使用本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂检测血液样本中的纤维蛋白原功能值所得ma(mm)曲线。

具体实施方式

下面，结合附图以及附图说明和实施例对本发明提供的技术方案做进一步详细说明。

需要说明的是，以下实施例所涉及的支持剂、兔脑凝脂、组织因子、血小板抑制剂、血小板抑制增强剂、有机溶剂、生物防腐剂以及配制缓冲液的固体缓冲试剂等和实验仪器皆市售可得。

实施例

1、不同规格完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂的制备

1)缓冲液组成配比见表1：

表1-缓冲液组成配比

2)支持液各组分配比见表2：

表2-支持液各组分配比

3)不同规格完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂组分配比见表3：

表3-不同规格完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂组分配比

4)制备步骤：

s1)按表1缓冲液组成配比，取配制缓冲液的固体缓冲试剂三(羟甲基)氨基甲烷(英文简称：tris)，加纯水溶解并用盐酸将溶液ph值调至7.0～8.0，配制成250ml三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(简称：tris-hcl缓冲液)；

s2)按表2支持液各组分配比，取nacl、甘氨酸、牛血清白蛋白、海藻糖，加入tris-hcl缓冲液溶解，配制成100ml的支持液；

s3)取兔脑凝脂并加入tris-hcl缓冲液，研磨至乳状且肉眼观察无明显颗粒，再加入tris-hcl缓冲液制成浓度为1g/l的兔脑凝脂液；

s4)取tris-hcl缓冲液复溶组织因子冻干粉，制成浓度为1g/l的组织因子液；

s5)取tris-hcl缓冲液分别复溶血小板抑制剂阿昔单抗(英文名：abciximab)冻干粉、盐酸替罗非班(英文名：tirofiban)冻干粉、依替巴肽(英文名：eptifibatide)冻干粉，制成浓度分别为1g/l的阿昔单抗液、替罗非班液、依替巴肽液；

s6)取有机溶剂二甲基亚砜(英文简称：dmso)复溶血小板抑制增强剂微管蛋白抑制剂冻干粉，制成浓度为1g/l的微管蛋白抑制剂液；

s7)按表3不同规格完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂各组分配比，分别吸取兔脑凝脂液、组织因子液、血小板抑制液、血小板抑制增强液加入支持液中，再加入生物防腐剂，然后再加支持液至全量，混合均匀，使最终溶液的ph值为7.0～8.0，最终溶液中的兔脑凝脂浓度为2～10mg/l、组织因子浓度为0.2～1mg/l，作为血小板抑制液中的一种或多种的组合，最终溶液中的替罗非班浓度为50～100mg/l、依替巴肽浓度为20～60mg/l、阿昔单抗浓度为1～10mg/l，作为血小板抑制增强剂的微管蛋白抑制剂其在最终溶液中的浓度为10～20mg/l、生物防腐剂在最终溶液中的体积百分浓度为0.03～0.05％的本发明所述完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂。

2、不同规格完全抑制血小板功能的纤维蛋白原冻干检测试剂的制备

s8)将上述不同规格完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂的制备条目中1)～4)制得的不同试剂编号即不同规格的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂分别分装入瓶，每瓶20μl，进行冻干，即得各种不同规格的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原冻干检测试剂。

效果实施例

1、实施方法

检测试剂：采用上述制备步骤s1)～s8)所得不同规格的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂；

检测仪器：采用美国haemoscopeteg5000血栓弹力图仪。

2、检测步骤

x1)将上述通过步骤s1)～s8)所得不同试剂编号即不同规格的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂，从2～8℃贮存环境中取出，室温平衡15～30分钟；

x2)在血栓弹力图仪的操作软件中选择“cff”；

x3)在血栓弹力图仪上装载测试杯，吸取20μl浓度为0.2mol/l的cacl2溶液注入测试杯中；

x4)吸取0.5ml枸橼酸钠抗凝的全血样品进入试剂瓶中，温和翻转5次，混合均匀；

x5)吸取经步骤x4)处理过的全血样品340μl注入已加入cacl2溶液的测试杯中；

x6)将检测杆推到检测位置；

x7)单击血栓弹力图仪的操作软件中工具栏上的开始按钮，开始检测。

需要说明的是：

本发明提供的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂，不仅适用在haemoscopeteg5000血栓弹力图仪上进行纤维蛋白原功能的检测，同样也适用在其它品牌、型号的血栓弹力图仪，如西芬斯cfms血栓弹力图仪等上进行纤维蛋白原功能的检测，当然，使用其他它品牌、型号的血栓弹力图仪，具体操作步骤和操作参数应根据各种仪器的不同进行适当的调整。

3、有效性评估

检测试剂：使用上述表3中，试剂编号为7^#的本发明所述完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂。

对比试剂：在上述检测试剂/冻干检测试剂配方中除去血小板抑制剂增强剂，按上述检测试剂同样的制备方法制得现有技术中使用的纤维蛋白原检测试剂作为对比试剂。

对比方法：分别使用检测试剂和对比试剂对10件正常人血样本，采用上述包括x1)～x7)的检测步骤，检测样本中的纤维蛋白原功能指标，其结果如表4所示。

表4-检测试剂和对比试剂检测同一样本纤维蛋白原功能情况

从表4中可以看出，当纤维蛋白原接近临界值时，未加血小板抑制增强剂的对比试剂所得结果明显比本发明提供的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂检测所得结果要明显偏高，出现了假阳性现象。

从图1，分别使用本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂与现有技术中的纤维蛋白原检测试剂检测同一血液样本所得检测结果比较图中，可更明显地看出：

曲线m1所示的使用现有技术中的纤维蛋白原检测试剂检测血液样本中的纤维蛋白原功能值ma(mm)，远大于曲线m2所示的使用本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂检测血液样本中的纤维蛋白原功能值ma(mm)，原因在于：

使用现有技术中的纤维蛋白原检测试剂检测所得血液样本中纤维蛋白原功能值ma(mm)，包含了血液样本中纤维蛋白原本身的功能值ma(mm)，同时包括了血液样本中由于血小板激活出现的纤维蛋白原假阳性结果，从而干扰了检测结果；

而使用本发明提供的检测试剂/冻干检测试剂进行检测，则可完全屏蔽血小板对纤维蛋白原功能检测的影响，获得准确的检测结果。

4、重复性评估

以同一人血样本，使用表3中试剂编号为10^#的本发明所述完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂，采用上述x1)～x7)的检测步骤，重复检测样本中的纤维蛋白原功能指标10次，其检测结果及样本ma均值和sd值、变异系数(cv％)如表5所示。

表5-重复性试验结果

表5结果显示：

本发明提供的完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂检测纤维蛋白原功能时，其ma变异系数(cv)不大于10％，符合作为医疗器械检测试剂的有关规定要求。

综上所述：

本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂，经缓冲液、支持剂、兔脑凝脂、组织因子、血小板抑制剂、血小板抑制增强剂、有机溶剂、生物防腐剂的配伍组合，通过血栓弹力图检测法，无需额外添加纤维蛋白原激活剂，就能完全抑制血小板功能，使检测不会出现纤维蛋白原假阳性结果，保证检测结果的准确性和稳定性，既简化了检验流程、提高了检测效率，又节约试剂的使用量，降低了检测成本；

此外，本发明提供的一种完全抑制血小板功能的纤维蛋白原检测试剂/冻干检测试剂制备简单方便、生产成本低，因此，极具推广应用价值。

最后，有必要说明的是：

上述内容仅用于帮助说明和理解本发明的技术方案，不能理解为对其的限制；本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。