芸香柚皮苷作为佐剂在促进和维持口服耐受中的应用的制作方法

本发明涉及芸香柚皮苷的用途，特别涉及芸香柚皮苷加入食品中作为佐剂在促进和维持口服耐受中的应用。
背景技术：
：wo01/89541(compagniegervaisdanone)公开了在口服组合物中使用干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)可增加特异针对致病微生物的免疫性。尤其旨在用于影响呼吸系统的病原体，同时该组合物可以是食品或是食品增补剂。专利cn1662154a公开了益生菌如副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)菌株可促进口服耐受的诱导，且特别适用于促进对牛奶蛋白的口服耐受性。但添加到食品中的微生物的优选是活体，这意味着此类食品需低温运输和低温售卖，如若储存条件不当可造成益生菌死亡，食用后效果大为下降，虽有研究表明死细菌的外膜似乎至少部分与活细菌以相同的方式激活免疫系统，但效果差别仍然较大。食物过敏是一种由食物引发的变态反应性疾病，现已经成为一个全球性公共健康问题。临床表现为恶心、呕吐、腹泻、哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎等，严重时可导致过敏性休克，甚至危及生命。寻找预防和治疗食物过敏的有效措施已经成为食品安全领域的研究热点。研究表明，机体耐受水平的降低可能是导致食物过敏的主要原因，因此，帮助机体恢复原有的自身耐受状态，才是防治食物过敏的最佳方案。给机体口服某种蛋白质抗原，诱导机体对该抗原产生特异性的免疫无应答或低反应状态，而对其他抗原仍能保持正常的免疫应答能力，是诱导机体产生免疫耐受的重要方法，称为口服耐受(oraltolerance，ot)。口服耐受对自身免疫相关疾病的治疗己在多种疾病模型中得到证实。比如口服耐受与移植排异，口服耐受与过敏性疾病，口服耐受与关节炎，口服耐受与实验性变应性脑脊髓炎，口服耐受与糖尿病等。研究发现，口服耐受可预防食物过敏、乳糜泻和炎症性疾病。口服耐受是外周免疫耐受的一种特殊形式，它形成与肠粘膜免疫系统的特殊解剖学结构有关，该系统由大量聚积在肠相关淋巴组织(gutassociatedlymphoidtissues，galt)的淋巴细胞组成，包括有上皮内淋巴细胞(intraepitheliallymphocytes，iel)、固有层淋巴细胞(laminaproprialymphocytes，lpl)、派氏集合淋巴结(peyerspatch，pp)和肠系膜淋巴结(mesentericlymphnode，mln)。食物过敏是一种过敏人群因摄入某些食物蛋白质而产生不良免疫反应的病理现象，是免疫球蛋白e(ige)介导的i型超敏反应。食物过敏的发病率呈逐年上升趋势，给家庭和社会造成严重负担。全球约170种食物均能造成ige介导的食物过敏反应,而近90％的食物过敏由八大类致敏原引起,分别为牛乳、鸡蛋、大豆、小麦、花生、坚果、甲壳类和鱼类。因此通过口服途径诱导免疫耐受为治疗食物过敏疾病提供了一种新的思路和途径。鸡蛋因其含有丰富的优质蛋白成为婴幼儿早期主要的膳食蛋白来源。然而，鸡蛋含有多种过敏原，诱导婴幼儿食物过敏，严重影响过敏患儿的生活质量。研究表明，婴幼儿时期，鸡蛋过敏发生率为1.3％-10.1％，部分人群会在长期的食用过程中产生耐受，然而部分儿童和成年人仍旧会存在鸡蛋过敏症状，发生率可达到0.5％。鸡蛋过敏主要是由免疫球蛋白e(immunoglobulin，ige)介导的ⅰ型过敏反应，过敏原主要存在于蛋清中，目前发现蛋清中主要有5种蛋白成分能与人类血清ige结合而引起过敏反应，它们是卵类黏蛋白(ovomucoid，ovm或gald1)、卵白蛋白(ovalbumin，ova或gald2)、卵转铁蛋白(ovotransferrin，gald3)溶菌酶(lysozyme，gald4)以及卵黏蛋白(ovomucin)。ova占总蛋白含量的54％,在蛋清蛋白中含量最高，是引起鸡蛋过敏的关键物质。因此研究卵白蛋白ova的致敏性，对于低致敏鸡蛋制品的开发以及过敏患者的营养和健康尤为重要。本发明希望提供一种物质作为食物佐剂促进和维持机体对卵白蛋白ova的口服耐受。陈皮是芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有行气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等功效。陈皮具有良好的抗菌作用，具有对肠平滑肌的双向调节作用，还具有强心、降高血压等心血管系统作用，同时具有抗癌、免疫调节等作用。现代研究发现陈皮中化学成分较多，以黄酮类化合物为主。目前，从柑橘属植物中分离和鉴定的黄酮类化合物多达六十多种，其中以黄烷酮居多，且多以糖苷的形式存在，主要包括橙皮苷、新橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素和桔皮素等。技术实现要素：芸香柚皮苷是一种天然的强抗氧化剂，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒活性以及抗过敏的作用等。本发明的目的是研究化合物芸香柚皮苷在促进和维持口服耐受中的应用，尤其是芸香柚皮苷作为佐剂加入食品中能够促进和维持机体对卵白蛋白ova的口服耐受。经实验表明，芸香柚皮苷加入食品中能够作为佐剂缓解卵白蛋白ova过敏引起的体重下降和体温下降，缓解过敏引起的腹泻症状，以及缓解多种免疫球蛋白介导的超敏反应，对口服耐受具有辅助作用，能够促进和维持口服耐受能力。本发明芸香柚皮苷加入食品中作为佐剂在促进和维持口服耐受中的应用，特别作为佐剂促进和维持机体对卵白蛋白ova的口服耐受，是对于低致敏鸡蛋制品或其他高蛋白制品的开发具有重要的指导性意义和借鉴意义，对于过敏人群的营养和健康的研究具有重要启发。附图说明图1为本发明小鼠口服耐受模型的建立示意图；图2为本发明小鼠体重变化折线图；图3为本发明激发后小鼠体温变化折线图；图4为本发明激发后小鼠体温变化条形分析图；图5为本发明激发后小鼠粪便评分折线图；图6为本发明激发后小鼠腹泻评分分析图；图7为本发明小鼠血清特异性ige浓度条形图；图8为本发明小鼠血清特异性iga浓度条形图；图9为本发明小鼠血清特异性igg1浓度条形图；图10为本发明小鼠血清mmcp-1浓度条形图；图11为本发明小鼠肠道内容物iga浓度条形图；图12为本发明westernblot法检测结果荧光条带对比示意图；图13为本发明小鼠结肠组织gata3相对β-actin蛋白表达水平条形图；图14为本发明小鼠结肠组织foxp3相对β-actin蛋白表达水平条形图；图15为本发明小鼠结肠组织stat5相对β-actin蛋白表达水平条形图；图16为本发明小鼠结肠组织mhcⅱ相对β-actin蛋白表达水平条形图；图17为本发明小鼠结肠组织cxcr1相对β-actin蛋白表达水平条形图；图18为本发明小鼠结肠组织ccr7相对β-actin蛋白表达水平条形图。其中图2-图18中实验组1-6分别表示：1.空白组；2.致敏模型组；3.口服耐受组；4.10mg/kg耐受组；5.30mg/kg耐受组；6.50mg/kg耐受组。具体实施方式请参阅图1-18所示，由以下实验方法证明芸香柚皮苷对口服耐受有促进和维持的辅助作用，具体小鼠实验步骤及分析如下：实验仪器：phsj-4a实验室ph计上海雷磁微量振荡器江苏新康医疗器械涡旋混合器北京鼎国昌盛生物技术酶标仪美国biotekinstruments高速冷冻离心机美国thermofisher-80℃超低温冰箱青岛海尔实验试剂：小鼠igeelisa试剂盒美国ebioscience小鼠igg1elisa试剂盒美国ebioscience小鼠mcp-1elisa试剂盒美国ebioscience小鼠igaelisa试剂盒美国ebioscience鸡卵白蛋白(ova)美国sigma铝佐剂美国thermo0.9％氯化钠溶液长春豪邦药业吐温-20宝泰克生物芸香柚皮苷标准品成都曼思特生物科技有限公司其余试剂均来自北京化工。主要溶液配制：(1)pbs缓冲液：nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o2.89g，kh2po40.2g，蒸馏水溶解，调节ph值7.2，定容至1l，高压灭菌，待冷却后于-20℃冻存备用。(2)10％中性甲醛：取一定量的甲醛溶液加入9倍的蒸馏水，4℃备用。(3)ova致敏液：分别量取2ml10％明矾溶液(溶于双蒸水)和5μg/mlova(溶于pbs)混合均匀后，用氢氧化钠调ph为6.5，室温孵育60min，750r/min，离心5min,弃去上清，重新溶于2mlpbs。(4)ova激发液：称取900mgova，置于15mlep管中，加6mlpbs，使其充分溶解，现用现配。(5)终止液1mol/mlh2so4溶液，常温保存备用。(6)washingingbuffer：0.05％tween-20的1×pbs缓冲液，4℃保存备用。(7)10％过硫酸铵：10g的过硫酸铵加100ml去离子水，溶解后，-20℃保存，放置保存时间不超过为1月，4℃溶解，放置不超过1周。(8)10×电泳缓冲液：称取30.3gtris(三羟甲基氨基甲烷)，187.7g甘氨酸，10gsds(十二烷基硫酸钠)用蒸馏水定容至1000ml，溶解后室温保存，用时取100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。(9)10×转移缓冲液：称取30.3gtris(三羟甲基氨基甲烷)，144g甘氨酸，用蒸馏水定容至1000ml，溶解后室温保存，用时取100ml蒸馏水加200ml甲醇稀释至1000ml。(10)10×tbs缓冲液：量取100ml1mol/ltris·hcl(ph7.5)，称取88gnacl蒸馏水溶解，定容至1000ml，室温保存。(11)tbst缓冲液：量取100ml10×tbs，1mltween20加蒸馏水定容至1000ml，室温保存。(12)5％封闭液：称取2.5gbsa加入50mltbst完全溶解后4℃保存备用。(13)1.0mol/ltris·hcl(ph7.5)：称取30.29gtri加入200ml蒸馏水，溶解后用浓盐酸调至ph至7.5，定容至50ml。实验方法：口服耐受模型的建立：选取生长周期在4-7周的雌性balb/c小鼠36只，随机分成空白组、致敏模型组、口服耐受组、10mg/kg芸香柚皮苷耐受组(以下简称10mg/kg耐受组)、30mg/kg芸香柚皮苷耐受组(以下简称30mg/kg耐受组)和50mg/kg芸香柚皮苷耐受组组(以下简称50mg/kg耐受组)，每组6只小鼠。将小鼠安置于温度22-24℃，湿度40％-60％的空调动物房适应一周后开始实验。(1)空白组：第0天至第4天通过灌胃的方式给予0.2ml/只的pbs；第11天和第18天分别通过腹腔注射0.1ml/只的pbs；第25天到第39天通过灌胃的方式每次给予0.2ml/只的pbs，每周4次，共8次。(2)致敏模型组：第0天至第4天通过灌胃的方式给予0.2ml/只的pbs；第11天和第18天分别通过腹腔注射0.1ml/只ova致敏液进行致敏；第25天到第39天通过灌胃的方式每次给予0.2ml/只ova激发液进行激发，每周4次，共8次。(3)口服耐受组：第0天至第4天通过灌胃的方式给予1mg/只的ova，致敏方式和激发方式均同致敏模型组。(4)10mg/kg耐受组：第0天至第4天通过灌胃的方式给予1mg/只的ova和10mg/kg的芸香柚皮苷，致敏方式和激发方式均同致敏模型组。(5)30mg/kg耐受组：第0天至第4天通过灌胃的方式给予1mg/只的ova和30mg/kg的芸香柚皮苷，致敏方式和激发方式均同致敏模型组。(6)50mg/kg耐受组：第0天至第4天通过灌胃的方式给予1mg/只的ova和50mg/kg的芸香柚皮苷，致敏方式和激发方式均同致敏模型组。每次激发后1h后对小鼠进行腹泻评分及体温测量。于第0、4、11、18、25、32和39天时记录各组小鼠体重。于第25、27、29、31、35、37和39天激发后1h后，记录各组小鼠体温。于第25、27、29、31、35、37和39天激发后1h后，对小鼠进行粪便评分和腹泻评分。0＝固体；1＝半固体；2＝浆状；3＝水状。小鼠血清制备：第39天对小鼠进行腹泻评分及体温测量后，进行眼球取血，收集于1.5mlep管中于室温条件下放置0.5h，离心(15min，4℃，4500r/min)，取上清；下层溶液离心(10min，4℃，10000r/min)，取上清，转移至1.5mlep管，获得血清。于-80℃冰箱保存备用。小鼠血清中特异性ige、iga、igg1和mmcp-1的测定：按照仪器说明书测定。小鼠肠道内容物收集：将眼球取血后的小鼠脱臼处死于无菌环境中解剖，取出十二指肠、回肠和结肠，取4ml生理盐水小心冲洗，收集于4mlep管中，避免对肠道内壁造成人为损伤。小鼠肠道内容物中特异性iga的测定：按照仪器说明书测定。小鼠结肠组织蛋白的提取：(1)取40mg结肠组织于研钵中，加入适量液氮，加入适量裂解液(pmsf:pira＝1:100),快速研磨，研磨完全后于冰上放置30min，充分裂解；(2)提前打开冷冻离心机预冷，10000r/min离心15min，取上清液。小鼠结肠组织蛋白定量：(1)以bca试剂a：b＝50：1的比例配制适量工作液；(2)按照碧云天bca蛋白定量试剂盒说明书取适量pbs完全溶解蛋白标准品得到母液，并将母液分装于-20℃冰箱保存备用；(3)取适量标准品母液用pbs稀释10倍，终浓度为0.50mg/ml。将标准品按0.00、1.00、2.00、4.00、8.00、12.00、16.00和20.00μl加到96孔板的标准品孔中，不足20.00μl的用pbs补足，标准品浓度分别为0.00、0.025、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50mg/ml。每个浓度做三个复孔；(4)样品孔每孔加入19μl的pbs和1μl的样品，每个样品做三个复孔；(5)标准品和样品孔分别加入200μlbca工作液，37℃孵育30min。(6)于570nm处测定od值。以标准品的浓度为横坐标，以其对应的od值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程，从而根据各样品的od值代入回归方程以得到各组样品浓度。westernblot法检测小鼠结肠组织中gata3、foxp3、stat5、mhcⅱ、cxcr1、ccr7的表达情况：(1)配置sds-page凝胶：将玻璃板洗净，用去离子水冲洗，将与凝胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。按sds-page凝胶快速配制试剂盒说明书，根据目的蛋白分子量的不同配制不同浓度的分离胶(gata3、foxp3、mhcⅱ、cxcr1和ccr7使用10％分离胶，stat5使用6％分离胶)，5％的浓缩胶；(2)准备样品：取15ml样品溶液(含40μg蛋白)，加入5ml4×sds-page缓冲液。混合均匀进行蛋白变性(100℃，10min)，冷却后上样；(3)电泳：抽取40μg蛋白样品，将蛋白样品缓慢全部加入sds-page凝胶孔隙中。正确连接电泳仪的正负级，浓缩胶使用80v电压，分离胶使用120v电压。待溴酚兰刚跑出玻璃板即可终止电泳，后准确切下目的蛋白；(4)转膜：采用半干法转膜。准备与(3)切的凝胶大小相同的2张5层厚滤纸和1张pvdf膜，其中将5层厚滤纸浸泡于转膜液(4℃预冷)中，将pvdf膜放入甲醇中浸泡约15s以上。在转膜仪内的放置顺序依次为5层厚滤纸，pvdf膜，凝胶，5层厚滤纸。转膜时间根据目的蛋白分子量的不同而不同(mhcⅱ转膜30min，cxcr1、ccr7、foxp3和gata3转膜40min，stat5转膜50min)，转膜电流以1cm2/2ma计算；(5)封闭：转膜时，可提前配置封闭液，为使封闭液完全溶解可适当超声。转膜完成后，将凝胶放入含有封闭液的平皿中，室温下摇床上摇动封闭2-4h；(6)孵育一抗：根据抗体说明书稀释抗体。gata3、foxp3、stat5、cxcr1、ccr7和β-actin使用的浓度为1:1000。将稀释好的一抗加入相应pvdf膜所在的抗体孵育盒中，4℃过夜；(7)洗脱一抗：使用tbst洗脱一抗，洗脱3次，10min/次；(8)同(6)的方法准备二抗稀释液，二抗使用浓度为1：5000。将配置好的二抗加入pvdf膜所在抗体孵育盒中，室温孵育1h；(9)同(7)的方法洗脱二抗；(10)以ecl发光液a:b＝1:1的比例配置适量体积的显影液，充分混匀，将pvdf膜与显影液充分接触自动曝光。使用imagelab4.1programs软件进行特异性条带定量分析。统计学方法：本实验、采用prism7与spss19.0软件进行数据处理，检验水准α＝0.05。p＜0.05时认为各组间差异有统计学意义，p＜0.01时认为各组间差异有显著统计学意义，p＜0.001时认为各组间差异有极显著统计学差异。各项指标的分析：如图2小鼠体重变化的折线图所示，除空白组小鼠的体重持续增加，并在第39天时体重达到最大值外，各组小鼠体重均在第25天(激发前)达到最大值，激发后，各组小鼠体重发生明显变化：与空白组相比，致敏模型组小鼠体重在激发后明显下降；而口服耐受组小鼠体重在激发后虽有下降，但与致敏模型组相比下降较缓，由此可见，口服耐受模型建立成功；10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组、50mg/kg耐受组小鼠体重在激发后虽有不同程度下降，但与口服耐受组相比，下降明显减缓，尤其50mg/kg耐受组小鼠体重下降最为缓慢。由此可知，口服耐受组能够减缓食物过敏导致的小鼠体重减轻症状，与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组能够更好的减缓食物过敏导致的小鼠体重减轻症状。如图3和图4激发后小鼠体温变化图所示，激发后，各组小鼠平均体温均有不同程度变化。与空白组相比，致敏模型组小鼠体温在激发后下降趋势最为明显，而口服耐受组小鼠体温在激发后虽有下降，但与致敏模型组相比，有所减缓，由此可见，口服耐受模型建立成功；10mg/kg耐受组小鼠体温虽有所下降，但相比口服耐受组下降较缓，无统计学差异；30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠体温在激发后虽有不同程度下降，但与口服耐受组相比，均有减缓，与空白组相比，体温基本趋于稳定。由此可见，口服耐受组能够减缓食物过敏导致的小鼠体温下降的趋势，与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组能够更好的减缓食物过敏导致的小鼠体温下降。如图5和图6激发后小鼠粪便评分和腹泻评分所示，激发后，与空白组相比，致敏模型组腹泻严重，评分显著升高；与致敏模型组相比，口服耐受组小鼠腹泻情况有所减轻，评分降低，但无统计学差异，10mg/kg耐受组小鼠腹泻减轻，评分显著降低，30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠基本无腹泻现象，评分极显著降低。与口服耐受组相比，不同浓度芸香柚皮苷作用的的耐受组腹泻评分均有不同程度的降低，均有所减轻，但只有50mg/kg耐受组有统计学差异。由以上结果可知，口服耐受组能够减轻食物过敏导致的小鼠腹泻症状，与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组能够较好的减轻食物过敏导致的小鼠腹泻症状。如图7小鼠血清中ige的浓度条形图所示，空白组、致敏模型组、口服耐受组、10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中的ige的含量分别为1294.17±386.69ng/ml、2901.25±369.87ng/ml、2390.42±147.08ng/ml、2085±121.59ng/ml、1422.5±355.9ng/ml和600±264.31ng/ml。与空白组相比，致敏模型组小鼠血清中ige的浓度升高，具有统计学差异；与致敏模型组相比，口服耐受组和10mg/kg耐受组小鼠血清中ige的浓度均有不同程度的下降，但没有统计学差异，30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中的ige的浓度均有显著性下降；与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中的ige的含量均有不同程度的下降。由此可见，成功建立口服耐受模型，且芸香柚皮苷对口服耐受有辅助作用。由此可知，经ova与芸香柚皮苷共同进行耐受诱导组比ova单独耐受诱导的组表现出更好的ova特异性ige低响应性。随着芸香柚皮苷使用的浓度越高，ova特异性ige响应性越低，呈现浓度依赖性。如图8小鼠血清中iga的浓度条形图所示，与空白组相比，致敏模型组血清iga浓度升高，具有统计学差异。与致敏模型组相比，口服耐受组血清iga浓度降低，但没有统计学差异；10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组血清iga浓度均有不同程度的下降，具有统计学差异。与口服耐受组相比，不同浓度的耐受组血清iga浓度均有不同程度的下降，但无统计学差异。由此可知，口服耐受组能够减缓食物过敏导致的小鼠血清iga浓度升高趋势，与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组能够更好的减缓食物过敏导致的小鼠血清iga浓度升高趋势。除ige外，igg1也参与速发型变态反应，血清中的igg1抗体通过与肥大细胞的fcεrⅲ受体结合，导致肠道中肥大细胞脱颗粒。如图9小鼠血清中igg1的浓度条形图所示，空白组、致敏模型组、口服耐受组、10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中的igg1的浓度分别为68.67±12.08μg/ml、201.67±41.18μg/ml、148.67±41.2μg/ml、130±22.69μg/ml、99.67±33.77μg/ml和79±20.84μg/ml。与空白组相比，致敏模型组小鼠血清中igg1的浓度显著性升高；与致敏模型组相比，口服耐受组和10mg/kg耐受组小鼠血清中igg1的浓度均有不同程度的下降，但没有统计学差异，30mg/kg耐受组组小鼠血清中的igg1的浓度降低，有统计学差异，50mg/kg耐受组小鼠血清中的igg1的浓度显著下降，与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中的igg1的含量均有不同程度的下降。由此可见，成功建立口服耐受模型，经ova与芸香柚皮苷共同进行耐受诱导组比ova单独耐受诱导的组表现出更好的ova特异性igg1低响应性。随着芸香柚皮苷使用的浓度越高，ova特异性igg1响应性越低。小鼠成熟肥大细胞激活过程中释放的一种趋化因子mmcp-1，对单核巨噬细胞趋化起作用，是肥大细胞分泌颗粒的主要蛋白成分之一，参与过敏反应的发生。如图10小鼠血清中mmcp-1的浓度条形图所示，空白组、致敏模型组、口服耐受组、10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中的mmcp-1的含量分别为169.33±9.15pg/ml、202.67±11.99pg/ml、154.33±6.85pg/ml、178.5±10.04pg/ml、169±14.12pg/ml和158.17±7.1pg/ml。与空白组相比，致敏模型组小鼠血清中mmcp-1的浓度升高，有统计学差异；与致敏模型组相比，口服耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中mmcp-1的浓度有显著性降低，10mg/kg耐受组小鼠血清中mmcp-1的浓度下降，但没有统计学差异，30mg/kg耐受组小鼠血清中mmcp-1的浓度下降，具有统计学差异；与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠血清中mmcp-1的浓度均有不同程度的升高。由此可见，口服耐受模型建立成功。口服耐受组能够减缓食物过敏导致的小鼠血清mmcp-1升高趋势，不同浓度的芸香柚皮苷组与口服耐受组之间无统计学差异。由以上抗体和趋化因子水平初步判断，芸香柚皮苷联合作用后小鼠肠道的炎性症状减轻。机体的食物过敏发病与胃肠道黏膜非特异性防御屏障的破坏存在密切的关系，肠道iga可抗病毒感染，减少食物过敏原吸收，如图11小鼠肠道内容物中iga的浓度条形图所示，空白组、致敏模型组、口服耐受组、10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠肠道内容物中的iga的含量分别为76.67±14.42μg/ml、127.33±36.4μg/ml、78.78±18.23μg/ml、75.22±9.95μg/ml、69.89±15.77μg/ml和45.89±3.24μg/ml。与空白组相比，致敏模型组小鼠肠道内容物中iga的浓度升高；与致敏模型组相比，口服耐受组、10mg/kg耐受组小鼠肠道内容物iga浓度均有不同程度的降低，但没有统计学差异；30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠肠道内容物中的iga的浓度均有不同程度的下降，具有统计学差异；与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠肠道内容物中的iga的浓度均有不同程度的下降，50mg/kg耐受组小鼠肠道内容物中的iga的浓度下降最为明显。由此可见，口服耐受组能够减缓食物过敏导致的小鼠内容物iga升高趋势，与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组能够更好的减缓食物过敏导致的小鼠内容物iga升高趋势。抗体ige和igg1血清中的水平是速发型变态反应评价直接标准，由实验结果可知，经联合作用口服耐受组随着芸香柚皮苷浓度升高，血清中特异性ige和igg1抗体响应性降低。文献表明，机体的食物过敏发病与胃肠道黏膜非特异性防御屏障的破坏存在密切的关系，肠道iga可减少食物过敏原吸收，联合作用组血清及肠道内容物中iga水平的降低。如图12所示，小鼠结肠组织gata3、foxp3、stat5、mhcⅱ、cxcr1和ccr7的蛋白荧光条带有明显变化。以小鼠结肠组织β-actin蛋白作为空白对照，口服耐受和芸香柚皮苷浓度的变化对小鼠结肠组织β-actin蛋白的表达没有影响。与空白组相比，致敏模型组小鼠结肠组织gata3、mhcⅱ和cxcr1蛋白荧光条带加深，foxp3、stat5和ccr7蛋白荧光条带减弱；与致敏模型组相比，口服耐受组小鼠结肠组织gata3、mhcⅱ和cxcr1蛋白荧光条带呈不同程度的减弱趋势，foxp3、stat5和ccr7蛋白荧光条带加深；与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组小鼠结肠组织gata3、mhcⅱ和cxcr1蛋白荧光条带呈不同程度的减弱趋势，foxp3、stat5和ccr7蛋白荧光条带加深。为了进一步确定小鼠结肠组织gata结合蛋白3(gata3)、p叉头状转录因子(foxp3)、信号转录与转录因激活因子(stat5)、主要组织相容物(mhcⅱ)、cxcr细胞表面趋化因子受体1(cxcr1)和cc趋化因子受体7(ccr7)变化的显著性，对蛋白荧光条带进行灰度值测算。(1)小鼠结肠组织gata3表达水平分析：如图13小鼠结肠gata3/β-actin表达情况条形图所示，与空白组相比，致敏模型组小鼠结肠组织中gata3表达水平显著性上升；与致敏模型组相比，口服耐受组结肠组织gata3表达水平显著下降，说明th细胞向th2细胞方面的分化被抑制；与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组结肠组织gata3表达水平下降，但无统计学差异；30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠结肠组织中gata3表达水平显著下降。由于gata3主要表达于th2细胞，过敏原ova与芸香柚皮苷的联合作用，能够调节t细胞的免疫应答，减少向th2方向分化，抑制了过敏反应的发生。成熟t细胞根据其表面cd4和cd8的表达可分为两大类，cd4+t细胞为t辅助细胞(th)，cd8+t细胞为细胞毒性t细胞(tc)。th细胞可分化为th1和th2等多种类型亚群，th1/th2免疫失衡与食物过敏相关，转录因子gata3是th2细胞表面所表达的标志物。芸香柚皮苷耐受组组gata表达的降低，说明th2细胞减少，在联合作用下，抑制了th细胞向th2细胞的分化。(2)小鼠结肠组织foxp3表达水平分析：如图14小鼠结肠foxp3/β-actin表达情况条形图所示，与空白组相比，致敏模型组小鼠结肠组织中foxp3表达水平显著性下降,但无统计学差异；与致敏模型组相比，口服耐受组小鼠结肠组织中foxp3表达水升高，但没有统计学差异，与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组和30mg/kg耐受组结肠组织fxop3表达水平均有不同程度的升高，但无统计学差异；50mg/kg耐受组结肠组织fxop3表达水平显著升高。由于fxop3主要表达于tregs，由以上结果可知，由于芸香柚皮苷的联合作用，在口服耐受的建立过程中，芸香柚皮苷促进了tregs的分化，有助于口服耐受的建立。foxp3是叉状头转录因子家族中的一个成员，是调节性t细胞(treg)的标志性分子，在调节机体免疫自稳中起到了关键作用，结果中，芸香柚皮苷耐受组上调了结肠组织中foxp3蛋白的表达，说明tregs的增多。(3)小鼠结肠组织stat5表达水平分析：如图15小鼠结肠stat5/β-actin表达情况条形图所示，与空白组相比，致敏模型组小鼠结肠组织中stat5表达水平显著性降低；与致敏模型组相比，口服耐受组小鼠结肠组织中stat5表达水平显著上升，与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组和30mg/kg耐受组结肠组织stat5表达水平下降，无统计学差异；50mg/kg耐受组结肠组织stat5表达水平显著上升。stats是存在于胞浆中的一类蛋白，能够结合靶基因调控区的dna从而调控转录，是jaks的下游底物，其中stat5可直接调节foxp3表达促进treg形成和维持，本研究中，stat5的结果与foxp3一致。(4)小鼠结肠组织mhcⅱ表达水平分析如图16小鼠结肠mhcⅱ/β-actin表达情况条形图所示，与空白组相比，致敏模型组小鼠结肠组织中mhcⅱ表达水平升高,具有统计学差异；与致敏模型组相比，口服耐受组、10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠结肠组织中mhcⅱ表达水平均有显著下降；与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠结肠组织中mhcⅱ表达水平均有不同程度的下降。mhcⅱ类分子主要表达于树突状细胞等抗原递呈细胞，其功能主要是在免疫应答的始动阶段将经过处理的抗原片段递呈给cd4t细胞能够协调免疫细胞间的相互作用，调控体液免疫和细胞免疫应答。随着dc的成熟，细胞上所表达的mhc-类分子、共刺激分子，和促炎因子以及趋化因子受体ccr7的表达增多，使dc摄取抗原的能力降低，活化t细胞能力增强，本实验结果表明，芸香柚皮苷联合作用组的mhcⅱ类分子表达显著降低，说明在联合作用下，抑制了树突状细胞的成熟，增强其抗原摄取能力，降低活化t细胞能力，有助于口服耐受的形成。(5)小鼠结肠组织cxcr1表达水平分析如图17小鼠结肠cxcr1/β-actin表达情况条形图所示，与空白组相比，致敏模型组小鼠结肠组织中cxcr1表达水平显著升高；与致敏模型组相比，口服耐受组小鼠结肠组织中cxcr1表达水平显著下降；与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组、30mg/kg耐受组和50mg/kg耐受组小鼠结肠组织中cxcr1表达水平均有不同程度的下降。趋化因子受体1(chemokinereceptor1,cxcr1)是一种g蛋白偶联的跨膜受体，与其配体il-8结合，在调节局部炎症、细胞生长和发育、血管新生以及肿瘤细胞的趋化等方面发挥作用，cxcr1表达的下降，说明局部炎性降低。(6)小鼠结肠组织ccr7表达水平分析如图18小鼠结肠ccr7/β-actin表达情况条形图所示，与空白组相比，致敏模型组小鼠结肠组织中ccr7表达水平显著升高；与致敏模型组相比，口服耐受组小鼠结肠组织中ccr7表达水平下降；与口服耐受组相比，10mg/kg耐受组结肠组织ccr7表达水平上升，但无统计学差异；30mg/kg耐受组结肠组织ccr7表达水平下降，但无统计学差异；50mg/kg耐受组结肠组织ccr7表达水平显著下降。ccr7是一种趋化因子受体，表达与半成熟和成熟dc，调节各类免疫细胞向初级、刺激淋巴细胞分化，并向外周淋巴器官归巢。通过与配体结合，诱导细胞迁移并进入淋巴器官，有助于免疫耐受的发生，本研究结果表明，联合作用下，ccr7表达降低，与mhcⅱ类分子结果一致。由上述结果可知，口服耐受组能够减缓食物过敏导致的小鼠结肠组织gata3、mhcⅱ和cxcr1表达水平上升及foxp3、stat5和ccr7表达水平下降趋势；与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组能够更好的减缓食物过敏导致的小鼠结肠组织gata3、mhcⅱ、cxcr1和ccr7表达水平上升及foxp3和stat5表达水平下降趋势。通过口服给予ova的方式建立balb/c小鼠口服耐受模型，通过同时口服ova和不同剂量的芸香柚皮苷(10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg)来研究芸香柚皮苷对ova口服免疫耐受的影响。利用小鼠体重、体温、粪便评分、血清中抗体水平、肠道内容物中iga水平，以及结肠组织中的gata3、foxp3、stat5、mhcⅱ、cxcr1、ccr7的蛋白表达情况，考察芸香柚皮苷对ova口服耐受的影响。结果表明，与口服耐受组相比，芸香柚皮苷耐受组小鼠体温升高；腹泻减轻；血清ige、iga和igg1水平降低；肠道内容物iga水平降低；小鼠结肠组织gata3、mhcⅱ、cxcr1和ccr7表达水平降低及foxp3和stat5表达水平升高；但是血清mmcp-1水平升高。由上述可知，与口服耐受组相比，不同浓度的芸香柚皮苷耐受组可以更好的缓解食物过敏的症状。综上所述，芸香柚皮苷加入食品中能够作为佐剂缓解机体因蛋白质过敏引起的体重下降和体温下降以及腹泻等症状，缓解多种免疫球蛋白介导的超敏反应，对口服耐受有辅助作用，有效地促进和维持口服耐受能力。当前第1页12