一种估算不同食性土壤线虫生物量的方法与流程

本发明涉及土壤线虫科学研究领域，更具体涉及一种估算不同食性土壤线虫生物量的方法，适合于土壤线虫生物量的测算。

背景技术：

土壤线虫是多细胞生物中数量最多的种类，它们普遍分布于全球各种生态系统中。土壤线虫在生态系统生物地球化学循环过程中起着重要的作用，它们对环境变化响应敏感在作为生态指示生物方面发挥着巨大作用，且它们食性广泛占据食物网的关键链接，土壤线虫在生物地球化学循环、生态指示、食物网营养级关系等研究领域受到广泛关注(bongersandferris,1999；nneher,2010)。土壤线虫食性组成及其生物量的大小是决定其在生物地球化学循环过程中贡献量的最重要指标(ferris,2010)，传统的线虫生物量(w)的估算必须通过测量线虫体长(l)和最大体宽(d)来进行计算，计算公式为w＝(l×d²)/(1.6×10⁶)。然而，由于线虫身体细长，往往在对标本进行热杀死固定后呈现出多样化的体型，这极大的增加了线虫体长测量的工作量。相比于线虫体长的测量，其最大体宽的测量十分简单快速。因此，有必要对线虫生物量估算方法进行改进，以提高线虫生物量分析测算的工作效率。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种估算不同食性土壤线虫生物量的方法。方法易行，操作简便，该方法是根据线虫体长和最大体宽的极显著线性相关关系，利用最大体宽(测定简便)对体长(测定耗时)进行估算，进而使线虫生物量估算公式由两个变量简化为一个更加简单易测的变量，达到提高了线虫生物量估算效率，为土壤线虫生物量相关研究提供了更加便捷和有效的估算方法。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

实测获得不同生态系统的土壤线虫体长和最大体宽数据，将线虫按照四个食性类群(食细菌、食真菌、植食性和杂食捕食性)分类并分别对各食性的体长和最大体宽的相关关系进行统计分析，结果表明各食性的体长和最大体宽之间均存在极显著的相关关系，然后以此为依据提出了各食性线虫体长和体宽的拟合方程，进而将线虫的生物量估算公式中的体长用体宽进行代替，分别提出以最大体宽作为唯一测量指标的针对各食性线虫的生物量估算公式。

一种估算不同食性土壤线虫生物量的方法，其步骤是：

a、采集土壤样品、提取线虫、热杀死线虫、固定线虫、制片和进行形态学鉴定；

b、在显微镜下按照一定检索依据将线虫划分到四个食性类群，即食细菌(ba)、食真菌(fu)、植食性(he)和杂食捕食性(ompr)，对每条线虫拍照并用相关测量软件测量最大体宽(d，单位：μm)。有别于传统的线虫生物量测算技术中要求同时测量体长和最大体宽的技术要求，该步骤中不需要对线虫体长进行测量。由于线虫体长测量比线虫最大体宽测量消耗更多的时间，因此极大的提高了线虫体型测量所消耗的时间，按线虫样品平均数量和线虫体型平均复杂程度估算，单个样品的平均分析时间可节省60分钟以上，极大的提高了测量的时间效率；

c、根据不同食性类群的生物量计算公式分别计算线虫的生物量大小(w，单位：μg)。各食性线虫生物量计算公式如下：

食细菌线虫生物量wba＝(19.192×dba³)/(1.6×10⁶)

食真菌线虫生物量wfu＝(23.403×dfu³)/(1.6×10⁶)

植食性线虫生物量whe＝(24.260×dhe³)/(1.6×10⁶)

杂食捕食性线虫生物量wompr＝(22.352×dompr³)/(1.6×10⁶)

以上公式中只包含线虫最大体宽一个测量指标，与现有公式中包含线虫体长和最大体宽两个测量指标相比，简化了公式并提高了线虫生物量测量的时间效率。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

根据土壤线虫体长和最大体宽的线性相关关系，对传统估算方法进行的优化和改进，只需测量线虫最大体宽，简便易行，操作简单，具有极高的准确度，提高了线虫生物量估算的效率，将线虫生物量估算公式由两个测量指标简化为一个指标，且该测量指标更加简单易于测量。由于线虫食性类群与生物量间存在一定关系，针对不同食性类群分别提出了相应生物量估算公式，以确保线虫生物量测算的精度。

因此，该发明在保证测算精度情况下可以明显提高线虫生物量测算的效率。

附图说明

图1为一种不同食性类群线虫的体长和最大体宽拟合关系图。

图中a、b、c、d分别表示食细菌线虫、食真菌线虫、植食性线虫和杂食捕食性线虫的体长和最大体宽存在极显著线性相关关系，它们的体长(y)可以用最大体宽(x)进行拟合，其拟合方程分别为y＝19.192x、y＝23.403x、y＝24.260x、y＝22.352x。

图2为一种本发明与现有技术对不同食性线虫生物量测算结果差异的对比图。

利用本发明与现有技术分别对四个食性线虫生物量进行了测算，结果表明本发明与现有技术的测算结果没有明显差异，说明本发明可以保证测算的精度。

图3为一种本发明与现有技术在分析不同土地利用方式下线虫生物量的时间消耗对比图。

图中包含4个土地利用方式，分别为人工牧草地、农田、次生林和自然灌草丛，表示本发明与现有技术在进行线虫生物量测算时的时间消耗存在显著差异，本发明与现有技术相比，可以分别为人工牧草地、农田、次生林和自然灌草丛每个样品的线虫生物量分析节约45、102、83和60分钟。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述：实现本发明的原理的示意图如图1所示。

实施例1：

一种估算不同食性土壤线虫生物量的方法，其步骤是：

1)利用土钻采用随机取样法采集土壤样品500g，使用贝尔曼漏斗法(barker,1985)提取线虫，将线虫样品放置于60℃左右水浴锅中3分钟左右杀死线虫，静置冷却至室温后加入8％福尔马林并摇匀，将线虫样品离心浓缩后取一滴浓缩液放置在载玻片上并加盖盖玻片进行制片。

2)在尼康dic微分干涉显微镜eclipse80i下对线虫进行鉴定，根据实际需要按照一定检索依据将线虫鉴定到食性或将线虫鉴定到科/属/种后再将其划分到不同食性类群，然后对每条线虫拍照并用相关测量软件测量和记录最大体宽(d，单位：μm)，拍照系统为尼康的ds-u3/l3-vi1/fi1/fi2。所述的测量软件为iworks。

3)根据测量的每条线虫的最大体宽(d)，选择其所在的食性类群对应的生物量计算公式，计算其生物量大小(w)。各食性线虫生物量计算公式如下：

食细菌线虫生物量wba＝(19.192×dba³)/(1.6×10⁶)

食真菌线虫生物量wfu＝(23.403×dfu³)/(1.6×10⁶)

植食性线虫生物量whe＝(24.260×dhe³)/(1.6×10⁶)

杂食捕食性线虫生物量wompr＝(22.352×dompr³)/(1.6×10⁶)

所述的dba³、dfu³、dhe³、dompr³分别为食细菌线虫、食真菌线虫、植食性线虫和杂食捕食性线虫的最大体宽的三次方，本发明方法只需测量线虫最大体宽即可进行生物量的估算，大大提高了线虫生物量估算的效率。

实施例2：

一种估算不同食性土壤线虫生物量的方法(以不同土地利用方式下线虫生物量测量的时间消耗对比为例)，其步骤是：

1)使用5cm内径土钻采用随机取样法，在四个土地利用方式(人工牧草地、农田、次生林和自然灌草丛)共计16个样方中分别采集1kg土壤样品；使用贝尔曼漏斗法(barker,1985)提取线虫；将提取后的线虫样品放置于60℃水浴锅中3分钟杀死线虫，静置冷却至室温后加入8％福尔马林摇匀；样品放置48小时以上，用离心机将线虫样品浓缩，取一滴浓缩液放置在载玻片上并加盖盖玻片进行制片。

2)在尼康微分干涉显微镜eclipse80i下对线虫进行形态鉴定，将线虫鉴定到属(genus)并划分到四个食性类群(食细菌、食真菌、植食性和杂食捕食性)；同时利用尼康ds-u3/l3-vi1/fi1/fi2拍照系统对鉴定时遇到的前150条线虫进行拍照(线虫数量不足150条的样品，对所有线虫进行拍照)，并用图像分析测量软件iworks测量和记录线虫最大体宽(d，单位：μm)和体长(l，单位：μm)；同时记录进行最大体宽和体长测量时消耗的时间(单位：s)。

3)采样现有技术方法(andrassy,1956；ferris,2010)，根据测量的每条线虫的最大体宽(d)和体长(l)，计算其生物量大小(w)，生物量计算公式为w＝(l×d²)/(1.6×10⁶)。

采样本发明方法，根据测量的每条线虫的最大体宽(d)，选择其所在的食性类群对应的生物量计算公式，计算其生物量大小(w)。各食性线虫生物量计算公式如下：

食细菌线虫生物量wba＝(19.192×dba³)/(1.6×10⁶)

食真菌线虫生物量wfu＝(23.403×dfu³)/(1.6×10⁶)

植食性线虫生物量whe＝(24.260×dhe³)/(1.6×10⁶)

杂食捕食性线虫生物量wompr＝(22.352×dompr³)/(1.6×10⁶)

其中dba、dfu、dhe和dompr分别为食细菌线虫、食真菌线虫、植食性线虫和杂食捕食性线虫的最大体宽。

本发明方法与现有技术对四个食性线虫的生物量测算结果没有明显差异(图2)，说明本发明可以保证测算准确度。

同时计算对各样品进行最大体宽和体长测量时消耗的时间，以最大体宽测量的时间作为本发明的时间消耗，以最大体宽和体长测量的时间之和作为现有技术的时间消耗，分别针对各土地利用方式采样t-test统计方法，对比本发明与现有技术的时间消耗。结果表明本发明比现有技术可以分别为人工牧草地、农田、次生林和自然灌草丛每个样品的线虫生物量分析节约45、102、83和60分钟，不同土地利用方式下土壤线虫生物量的测算时间整体节约近20小时(按每天工作8小时计算，该实验共计节约2.5个工作日)。