一种C反应蛋白的浓度检测方法与流程

本发明涉及生物化学技术领域，尤其是涉及生物传感器构建及其应用领域，具体涉及一种c反应蛋白的浓度检测方法。

背景技术：

暗场显微镜技术是利用斜射照明法阻挡透过标本细节的直射光，以反射光和衍射光来观察标本，普通显微镜下可以看到0.45um的细节，而暗场显微镜下能看到0.2～0.004um的极微小物体。金纳米颗粒易于制备，无毒性，具有良好的生物相容性，其包括金纳米球、金纳米棒、金纳米片等形式，可应用于生物检测方面，其强散射特性会随着尺寸形貌的不同发生极大变化，利用这种特性可以在暗场显微镜下特异性地识别特定尺寸特定形貌的金纳米颗粒。

核酸适配体是指利用指数富集进化技术(selex)从特定的寡核苷酸库中筛选出能与靶分子特异性结合的寡核苷酸单链。核酸适配体的首次体外筛选是由tuerk等在1990年建立的体外寡核苷酸筛选，从带有8个随机序列的rna文库中筛选出和噬菌体t4dna聚合酶特异性结合的核酸序列。此后，核酸适配体已成熟发展为新一代靶分子特异性识别结合体，可以是单链dna，也可以是rna，一般由几十个核苷酸(20～80nt)组成。与蛋白质靶标结合的核酸适配体通过自身折叠形成的二、三级结构，如茎、凸环、发夹、g-四联体、假结体和四角环等，能够与蛋白质靶标的空间结构相匹配，实现高亲和力、高特异性的结合。

人类c反应蛋白(c-reactiveprotein,crp)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。crp是炎症和心血管疾病的警示因子，故crp的检测在体外活检领域也受到了越来越多的重视。目前crp的检测方法主要有免疫比浊法、散射法、免疫分析法等，这些方法样品前处理比较复杂、操作过程繁琐费时，有的需要大型仪器且价格昂贵。另有一些文献提到基于核酸适配体的检测方法，可提升测试体系的灵敏性和特异性，同时可降低被检物的检测下限，但这些方法仍存在一定的缺陷：一方面，通常要让核酸适配体和抗体联用，但抗体具有需体内筛选、稳定性较差、易于失活等缺点，这便会大大增加检测成本以及测试过程和结果的不稳定性；另一方面，这些文献中提到的单独采用核酸适配体检测的方案，其所使用的为rna核酸适配体，rna易于失活降解，不易于实际检测。即便有的文献提到采用dna核酸适配体，但其检测所使用的仪器也较为昂贵，并且样品预处理较为复杂，操作过程繁琐。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提出一种c反应蛋白的浓度检测方法，通过采用核酸适配体搭建一个操作便捷、灵敏度高的生物传感器来检测c反应蛋白，提高了检测方法灵敏度和特异性的同时，降低了检测成本以及待检物的检测下限。

本发明为达上述目的提出以下技术方案：

一种c反应蛋白的浓度检测方法，包括以下步骤：s1、搭建具有三明治结构的金纳米颗粒-核酸适配体-磁球生物传感器；s2、将待测c反应蛋白投入到含有所述生物传感器的缓冲液中进行反应，以使c反应蛋白将所述生物传感器上的金纳米颗粒置换到缓冲液中；s3、反应结束后，提取缓冲液中的金纳米颗粒在暗场显微镜下观察并计数；s4、根据预先得到的c反应蛋白浓度与金纳米颗粒数量的对应关系，得到待测c反应蛋白的浓度；其中，所述对应关系通过如下方式得到：利用多组已知浓度的c反应蛋白样品分别与所述生物传感器形成多个实验组进行反应后，对每组分别执行步骤s3，并采用数值拟合方法对c反应蛋白样品的浓度与对应的置换下来的金纳米颗粒数量进行曲线拟合，得到所述对应关系。

本发明上述提供的技术方案，搭建的金纳米颗粒-核酸适配体-磁球生物传感器，具有稳定的生物化学三明治传感结构，并且能够很容易地从缓冲液中分离出来；基于c反应蛋白与核酸适配体的特异性相互作用，在c反应蛋白存在的情况下，该生物传感器中的核酸适配体发生适应性折叠形成茎环，发夹等三维结构，与靶标c反应蛋白紧密结合，同时破坏将核酸适配体和金纳米颗粒连接起来的配对碱基，使金纳米颗粒从生物传感器上置换下来并游离到缓冲液中，后续只需提取缓冲液中游离的金纳米颗粒进行计数，根据c反应蛋白浓度与金纳米颗粒数量的对应关系，即可获知待测c反应蛋白的浓度。该方法操作简单，不需要昂贵的仪器，区别于传统的抗原抗体特异性结合，利用核酸适配体的高特异性和高亲和性，以及广泛的靶标，对蛋白类的生物靶标进行检测。利用金纳米颗粒和暗场技术，达到单粒子的显微成像，使反应体系达到高灵敏的检测限，检测下限可达2nm。

进一步地：

步骤s1具体包括：s11、用dna修饰金纳米颗粒：让修饰有巯基的c-dna与金纳米颗粒通过金巯键的相互作用连接；s12、用dna修饰磁球：让核酸适配体与磁球通过生物素与亲和素的非共价相互作用连接；其中，所述核酸适配体是修饰有生物素的c反应蛋白核酸适配体，所述磁球是修饰有链霉亲和素的磁球；s13、将经过步骤s11和s12修饰后的金纳米颗粒和磁球通过碱基互补配对作用连接，形成所述具有三明治结构的金纳米颗粒-核酸适配体-磁球生物传感器。金巯键可将生物分子与贵金属纳米颗粒稳定地连接起来，亲和素和生物素的相互作用是自然界已知的最强的非共价作用，碱基互补配对作用是dna特有的相对稳定的结合作用，本发明利用这些稳定的结合作用分别功能化修饰金纳米颗粒和磁球，并利用碱基互补配对作用搭建稳定的生物传感器，从而使生物传感器既可通过简易的磁分离液相技术与缓冲液分离，同时金纳米颗粒又可作为报道探针。

步骤s3具体包括：反应结束后，提取游离于所述缓冲液中的金纳米颗粒并置于载玻片上进行固定，在暗场显微镜下利用彩色ccd拍照获得暗场图像，从所述暗场图像上对金纳米颗粒进行计数，以统计被待测c反应蛋白置换出的金纳米颗粒数量。

附图说明

图1是本发明实施例搭建具有三明治结构的金纳米球-核酸适配体-磁球生物传感器的流程示意图；

图2是磁球与金纳米球连接前(a)后(b)sem表征对比图；

图3是本发明一具体实施例获取c反应蛋白浓度与金纳米球数量的对应关系的方法流程图；

图4是本发明一具体实施例中不同浓度的c反应蛋白置换下来的金纳米球在暗场显微镜下的暗场图像；

图5是本发明一具体实施例中获得的c反应蛋白浓度与金纳米球数量的对应关系曲线；

图6是本发明搭建的生物传感器对c反应蛋白的特异性实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步说明。

本发明提出了一种c反应蛋白的浓度检测方法，该方法的原理是：通过化学生物学方法搭建一个具有三明治结构的金纳米颗粒-核酸适配体-磁球的生物传感器，该生物传感器对c反应蛋白具有高特异性，当加入不同浓度的c反应蛋白时可从该生物传感器上置换下不同数目的金纳米颗粒，而金纳米颗粒的强散射信号在暗场显微镜下可清晰地被接收到，安装在暗场显微镜的彩色ccd可将其光学信号转变为电信号最终变为图像信号，使用matlab可对图像中的金纳米颗粒进行计数，不同浓度的c反应蛋白对应着不同数目的金纳米颗粒，对多组c反应蛋白浓度与金纳米颗粒个数的数值对进行软件拟合，可以得到金纳米颗粒个数与c反应蛋白浓度之间的对应关系。在实际应用过程中，仅需将待测c反应蛋白与前述生物传感器反应并对置换下来的金纳米颗粒进行计数，通过预先得到的所述对应关系，就可获知待测c反应蛋白的浓度。

金纳米颗粒包括金纳米球、金纳米棒、金纳米片等，不同尺寸、不同形貌的金纳米颗粒在暗场下展现的散射特性也是不同的，35～75nm左右的金纳米颗粒在暗场下是绿色的，而团聚后的金纳米颗粒在暗场下是红色的，有杂质的金纳米颗粒在暗场下可能为白色、黄色等其他颜色。本发明优选采用尺寸35～75nm的金纳米球，一方面金纳米球的合成技术较为成熟且易于合成，另一方面，根据35～75nm纳米的金纳米球在暗场下显示绿色的性质可较容易地对其进行特异性识别。本发明较优选的方案是采用60nm左右的金纳米球。

本发明具体实施例提供的c反应蛋白的浓度检测方法，包括：

首先，按照图1所示的流程来搭建本发明所需的生物传感器。对金纳米球和磁球分别进行dna修饰，以使两者后续可以通过dna特有的碱基互补配对作用连接。让修饰有巯基的c-dna与金纳米球通过金巯键的相互作用连接，完成金纳米球的修饰；让修饰有生物素的c反应蛋白核酸适配体与修饰有链霉亲和素的磁球在生物素和亲和素的非共价作用下连接，完成磁球的修饰。然后将上述利用dna修饰过的金纳米球和磁球在碱基互补配对作用下连接，形成具有三明治结构的金纳米球-核酸适配体-磁球生物传感器。如图2所示，左侧a为修饰了链霉亲和素的磁球的sem表征图，右侧b为与金纳米球连接后的磁球，左侧a图可看出磁球表面无明显明亮小球，右侧b图可看出磁球表面均匀分布着明亮小球，即金纳米球。可知，本发明上述过程成功地在磁球表面修饰了金纳米球，即成功搭建了用于crp检测的稳定的生物传感器。c反应蛋白核酸适配体为5'-cgaaggggattcgaggggtgattgcgtgctccatttggtg-3'，相匹配的c-dna为5'-ttttttttcaccaa-3'。

然后，利用上述搭建的生物传感器来特异性检测c反应蛋白。将待测c反应蛋白投入到含有前述生物传感器的缓冲液中进行反应，反应时间优选5min，以使c反应蛋白将所述生物传感器上的金纳米颗粒置换到缓冲液中。缓冲液包括10mmpbs、0.3mnacl以及0.01wt％sds。基于c反应蛋白与核酸适配体的特异性相互作用，在c反应蛋白存在的情况下，该生物传感器中的核酸适配体发生适应性折叠形成形成茎环，发夹等三维结构，与靶标c反应蛋白紧密结合，同时破坏将核酸适配体和金纳米球连接起来的配对碱基，使金纳米球从生物传感器上脱落并游离到缓冲液中，再利用磁分离液相技术分离上清液并提取金纳米球，将提取的金纳米球固定于载玻片上，在暗场显微镜下利用彩色ccd拍照获得暗场图像，从所述暗场图像上对金纳米球进行计数，以统计被待测c反应蛋白置换出的金纳米球的个数，最后根据预先已经得到的c反应蛋白浓度与金纳米球个数的对应关系，即可获知待测c反应蛋白的浓度。

c反应蛋白浓度与金纳米球个数的对应关系的获得方法如图3所示，采用多组浓度(x1、x2、……)已知的c反应蛋白与本发明的生物传感器分别进行反应，分别提取每组中被c反应蛋白置换下的金纳米球并进行暗场计数(y1、y2、……)，从而可以得到多组(c反应蛋白浓度，金纳米球个数)数值对，利用数值拟合方法，可以拟合出c反应蛋白浓度与金纳米球个数的关系曲线，得到所述对应关系。在本发明的一具体实施例中，得到了如图5所示的关系曲线，c反应蛋白浓度x与金纳米球个数y的对应关系y＝8.7106x+47.46。从该对应关系可知，只要按照前述的方法提取出被待测c反应蛋白置换下的金纳米球并计数后，即可得出待测c反应蛋白的浓度。图4示例性地给出了几种不同浓度的c反应蛋白所对应的金纳米球的暗场图像，从图中可以看出，c反应蛋白浓度越高，所置换下的金纳米球个数越多，与上述所得的对应关系吻合。在一些优选的实施例中，还可以采用若干组浓度已知的c反应蛋白作为验证组，来验证上述得到的所述对应关系的准确性；更优选地，所述验证组的c反应蛋白的浓度与所述多个实验组的c反应蛋白样品浓度不同。

在本发明的实施例中，还对本发明搭建的生物传感器对c反应蛋白的特异性进行了实验：取10μl含有该生物传感器的缓冲溶液分别置于6个离心管中，其中一管分别加入10μl0.35μm的crp，另一管加入10μl缓冲溶液作为对照组，其余4管分别加入10倍于crp浓度的bsa、thrombin、igg、lys作为非特异性实验组，反应15min后，取上清液进行检测，该实验重复3次，数据分析后得到图6，由图可以看出，在加入bsa、thrombin、igg、lys这些蛋白到生物传感器的实验组中，上清液中无金纳米球的信号；而加入crp的生物传感器溶液中，上清液中检测到大量金纳米球，说明本发明构建的生物传感器对crp的特异性要远远优于其他蛋白，因此可利用该生物传感器高特异性地检测crp蛋白。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。