一种PD-L1外泌体的磁免疫化学发光检测方法与流程

本发明属于体外快速检测技术领域，具体涉及一种pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

外泌体是细胞分泌到胞外微环境中的纳米级小囊泡(直径50-150nm)，在1983首次被发现。但由于分析手段的缺乏，长期以来外泌体被认为是细胞排泄胞内垃圾的工具。随着分析方法的不断创新，外泌体分泌的机制逐渐被揭示。现在，科学界主流的观点认为，外泌体主要参与细胞间的信号传递以及作为疾病标记物。2013年诺贝尔生理医学奖授予了揭示这一领域重大发现的三位杰出科学家。然而，由此引发的外泌体功能研究与未来潜在应用给国际学术界带来无限遐想。2015年，借助活体成像技术，外泌体等胞外膜泡在体内广泛传递获得证实；而更激动人心的发现，外泌体正颠覆科学界对癌症发育的认知：传统观点认为，肿瘤转移是由于原发灶肿瘤细胞通过血液循环系统直接落户到其他组织。这导致了时下循环肿瘤细胞研究盛况空前；在正常情况下，t细胞鉴别到癌细胞后使癌细胞自动裂解，维持人体的平衡。但是癌细胞表面表达一种特殊的蛋白质(受体)，和t细胞结合，令t细胞产生“错觉”，认为癌细胞是“无害的”，同时使得t细胞的活性降低，癌细胞获得自救。这种特殊的蛋白质就是pd-l1(程序性死亡受体-1的配体)。但最新的外泌体分析发现，肿瘤是首先分泌外泌体作为先锋队，通过血液循环系统传送到其他组织，并改造微环境使其适应肿瘤细胞生长后，再排遣肿瘤细胞大军安营扎寨。这一发现再次刷新或颠覆了我们对癌症的认识，百年来关于癌症的“种子”和“土壤”假说终于获得印证。令人振奋的是，最近陈刚副教授在其研究中发现，肿瘤细胞可通过释放表面富含pd-l1的外泌体发挥对肿瘤杀伤性t细胞的功能抑制作用，且外周血中pd-l1阳性外泌体的浓度水平与肿瘤大小呈密切正相关(nature,2018,560(7718):382-386)。

目前对体液中外泌体的检测主要是借助超速离心法进行外泌体的分离纯化，耗时耗力，不利于临床快速检测。同时现有技术主要是集中分析外泌体表面的四跨膜超家族蛋白(cd63/cd9/cd81等)，正常细胞分泌的外泌体表面也携带四跨膜超家族蛋白，所以目前大多数外泌体检测目的是基于外泌体丰度检测，并不具有特异性。

目前磁免疫化学分析平台方法，整个反应体系集中于离心管中，存在孵育不充分，混合不充分以及磁分离效率低等缺点。

技术实现要素：

本发明解决了现有技术中外泌体检测特异性不高、操作不便和成本高的技术问题，以及磁免疫分离效率低的技术问题。

按照本发明的第一方面，提供了一种pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测试剂盒，所述试剂盒含有抗体a、抗体b、多孔泡沫金属填充的中空柱和磁铁，所述抗体a为化学发光分子或能使底物发光的酶标记的外泌体抗体，所述抗体b为磁珠标记的外泌体抗体；所述抗体a和抗体b中至少有一种为外泌体pd-l1抗体。

优选地，所述多孔泡沫金属为多孔泡沫铁、多孔泡沫钴或多孔泡沫镍；

优选地，所述多孔泡沫金属的孔洞的直径为10um-100um。

优选地，所述化学发光分子为吖啶脂；所述能使底物发光的酶为辣根过氧化物酶。

优选地，所述磁珠为顺磁磁珠，直径为10nm-1000nm。

按照本发明的另一方面，提供了化学发光分子或能使底物发光的酶标记的外泌体抗体以及磁珠标记的外泌体抗体用于制备检测pd-l1外泌体试剂中的应用，含有以下步骤：

(1)样品孵育：将待测样品与抗体a和抗体b充分混合后，进行孵育得到靶标复合物；所述抗体a为化学发光分子或能使底物发光的酶标记的外泌体抗体，所述抗体b为磁珠标记的外泌体抗体；所述抗体a和抗体b中至少有一种为外泌体pd-l1抗体；所述靶标复合物为抗体a、pd-l1外泌体和抗体b形成的双抗体夹心复合物；

(2)磁吸分离：将磁铁吸附到多孔泡沫金属填充的中空管外壁，使所述多孔泡沫金属置于磁场环境中；再将步骤(1)得到的孵育液通过多孔泡沫金属填充的中空管，使所述双抗体夹心复合物吸附于多孔泡沫金属上；

(3)洗脱双抗体夹心复合物：用缓冲液清洗多孔泡沫金属填充的中空管的内腔；再撤去多孔泡沫金属填充的中空管外壁的磁铁，并洗脱得到双抗体夹心复合物；

(4)检测发光强度：检测步骤(3)洗脱获得的双抗体夹心复合物的发光强度或双抗体夹心复合物使底物发光的强度，计算待测样品中外泌体pd-l1抗体的浓度。

优选地，所述多孔泡沫金属为多孔泡沫铁、多孔泡沫钴或多孔泡沫镍；

优选地，所述多孔泡沫金属中孔洞的直径为10um-100um。

优选地，所述化学发光分子为吖啶脂，所述能使底物发光的酶为辣根过氧化物酶。

优选地，所述磁珠为顺磁磁珠，直径为10nm-1000nm。

优选地，所述步骤(2)中利用吸液装置或移液枪，以上下来回吸取方式，将步骤(1)得到的孵育液通过多孔泡沫金属填充的中空管，使所述双抗体夹心复合物吸附于多孔泡沫金属上。

优选地，所述步骤(3)中利用吸液装置或移液枪，以上下来回吸取方式，清洗多孔泡沫金属填充的中空管的内腔。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明中的检测方法集成样品孵育，磁吸高效捕获分离以及快速检测，具有特异性强，操作方便，检测快捷，以及成本低等特点。本发明利用化学发光分子标记抗体上的抗体与磁珠标记抗体上的抗体中至少有一种为外泌体pd-l1抗体，化学发光分子标记抗体上的抗体与磁珠标记抗体上的抗体均可以选自外泌体cd63抗体、外泌体cd81抗体、外泌体cd9抗体和外泌体pd-l1抗体。形成磁珠抗体-外泌体pd-l1-化学发光分子标记的抗体的双抗体夹心的靶标复合物，特异性高，并将该靶标复合物高效捕获于多孔泡沫金属表面。多孔泡沫金属一方面能实现局部磁场放大，另外一方面也能增加孵育混合效果，增加分子的碰撞几率，磁分离效率高。

(2)本发明优选地使用吸液装置或移液枪将清洗液，以上下来回吸取方式，使孵育液多次通过多孔泡沫金属填充的中空管，使所述双抗体夹心复合物更充分地吸附于多孔泡沫金属上；本发明优选地使用吸液装置或移液枪将清洗液，以上下来回吸取方式，实现杂质的有效清洗。

(3)本发明优选地选用多个条型磁铁以对称方式排列在中空管外壁，也可以采用单个圆形磁铁将中空管置于其中，给多孔泡沫金属提供稳定的磁场便于吸附双抗体夹心的靶标复合物。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测方法的流程图。

图2是本发明实施例7提供的pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。

实施例1

一种pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测试剂盒，含有化学发光分子标记的外泌体抗体、顺磁磁珠标记的外泌体抗体、多孔泡沫金属填充的中空柱和磁铁；所述化学发光分子标记抗体上的抗体为外泌体pd-l1抗体，磁珠标记抗体上的抗体为外泌体pd-l1抗体。所述多孔泡沫金属为多孔泡沫铁。所述多孔泡沫铁中孔洞的直径为10um。所述化学发光分子为辣根过氧化物酶。所述顺磁磁珠的直径为10nm。

实施例2

一种pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测试剂盒，含有化学发光分子标记的外泌体抗体、顺磁磁珠标记的外泌体抗体、多孔泡沫金属填充的中空柱和磁铁；所述化学发光分子标记抗体上的抗体为外泌体pd-l1抗体，磁珠标记抗体上的抗体为外泌体cd63抗体。所述多孔泡沫金属为多孔泡沫镍。所述多孔泡沫镍中孔洞的直径为50um。所述化学发光分子为吖啶脂。所述顺磁磁珠的直径为50nm。

实施例3

一种pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测试剂盒，含有化学发光分子标记的外泌体抗体、顺磁磁珠标记的外泌体抗体、多孔泡沫金属填充的中空柱和磁铁；所述化学发光分子标记抗体上的抗体为外泌体cd63抗体，磁珠标记抗体上的抗体为外泌体pd-l1抗体。所述多孔泡沫金属为多孔泡沫钴。所述多孔泡沫钴中孔洞的直径为100um。所述化学发光分子为辣根过氧化物酶。所述顺磁磁珠的直径为1000nm。

实施例4

此实施例中的化学发光分子选用辣根过氧化物酶，发光体系采用鲁米诺化学发光体系；

(1)样品孵育：标有辣根过氧化物酶的抗体、标有顺磁性纳米磁珠抗体与样品孵育，孵育时间为30分钟。标有辣根过氧化物酶的抗体上的抗体为外泌体pd-l1抗体，标有顺磁性纳米磁珠的抗体上的抗体为外泌体pd-l1抗体。顺磁性纳米磁珠的直径为50nm。

(2)磁吸分离：在外加强磁场的情况下，借助多孔泡沫镍对局部磁场放大，实现高效捕获分离。多孔泡沫金属填充于枪头中或类似形状的管子中，利用吸液装置或移液枪将上述共孵育混合物，以上-下来回吸取方式，将靶标复合物(磁珠抗体-外泌体-辣根过氧化物酶的抗体)高效捕获于多孔泡沫镍表面。2个条型磁铁以对称方式排列在中空管外壁，给多孔泡沫金属提供稳定的磁场便于吸附双抗体夹心的靶标复合物。多孔泡沫镍的直径为10um。多孔泡沫镍一方面能实现局部磁场放大，另外一方面也能增加混合效果，增加碰撞几率。

(3)洗脱：加入清洗液清洗，去除非特异性靶标，利用吸液装置或移液枪将清洗液，以上-下来回吸取方式，实现有效清洗目的。

(4)释放检测：撤掉外加磁场，洗脱靶标复合物，检测得到的靶标复合物。利用发光底物液(鲁米诺+过氧化氢系列)以上-下来回吸取方式，高效的释放靶标复合物。利用化学发光检测仪器检测发光亮度，计算出样品中外泌体pd-l1外泌体浓度。

实施例5

此实施例中的化学发光分子选用吖啶脂，发光体系采用过氧化氢+氢氧化钠化学发光体系；

(1)样品孵育：标有吖啶脂的抗体、标有顺磁性纳米磁珠抗体与样品孵育，孵育时间为40分钟。标有吖啶脂的抗体上的抗体为外泌体pd-l1，标有顺磁性纳米磁珠的抗体上的抗体为外泌体cd63抗体。顺磁性纳米磁珠的直径为1000nm。

(2)磁吸分离：在外加强磁场的情况下，借助多孔泡沫钴对局部磁场放大，实现高效捕获分离。多孔泡沫金属填充于类似枪头形状的管子中，利用吸液装置或移液枪将上述共孵育混合物，以上-下来回吸取方式，将靶标复合物(磁珠抗体-外泌体-吖啶脂的抗体)高效捕获于多孔泡沫镍表面。单个圆形磁铁将中空管置于其中，给多孔泡沫金属提供稳定的磁场便于吸附双抗体夹心的靶标复合物。多孔泡沫钴的直径为100um。多孔泡沫钴一方面能实现局部磁场放大，另外一方面也能增加混合效果，增加碰撞几率。

(3)洗脱：加入清洗液清洗，去除非特异性靶标，利用吸液装置或移液枪将清洗液，以上-下来回吸取方式，实现有效清洗目的。

(4)释放检测：撤掉外加磁场，洗脱靶标复合物，检测得到的靶标复合物。利用发光底物液(过氧化氢+氢氧化钠系列)以上-下来回吸取方式，高效的释放靶标复合物。利用化学发光检测仪器检测发光亮度，计算出样品中外泌体pd-l1外泌体浓度。

实施例6

此实施例中的化学发光分子选用辣根过氧化物酶，发光体系采用鲁米诺化学发光体系；

(1)样品孵育：标有辣根过氧化物酶的抗体、标有顺磁性纳米磁珠抗体与样品孵育，孵育时间为50分钟。标有辣根过氧化物酶的抗体上的抗体为外泌体cd63抗体，标有顺磁性纳米磁珠的抗体上的抗体为外泌体pd-l1抗体。顺磁性纳米磁珠的直径为10nm。

(2)磁吸分离：在外加强磁场的情况下，借助多孔泡沫铁对局部磁场放大，实现高效捕获分离，利用吸液装置或移液枪将上述共孵育混合物，以上-下来回吸取方式，将靶标复合物(磁珠抗体-外泌体-辣根过氧化物酶的抗体)高效捕获于多孔泡沫铁表面。多孔泡沫铁的直径为50um。多孔泡沫铁一方面能实现局部磁场放大，另外一方面也能增加混合效果，增加碰撞几率。

(3)洗脱：加入清洗液清洗，去除非特异性靶标，利用吸液装置或移液枪将清洗液，以上-下来回吸取方式，实现有效清洗目的。

(4)释放检测：撤掉外加磁场，洗脱靶标复合物，检测得到的靶标复合物。利用发光底物液(鲁米诺+过氧化氢系列)以上-下来回吸取方式，高效的释放靶标复合物。利用化学发光检测仪器检测发光亮度，计算出样品中外泌体pd-l1外泌体浓度。

实施例7

此实施例中的化学发光分子选用吖啶脂，预激发液为过氧化氢，激发液为氢氧化钠；

(1)样品孵育：标有吖啶脂的抗体、标有磁珠抗体与样品孵育，孵育时间为30分钟。

(2)磁吸分离：在外加强磁场的情况下，借助多孔泡沫镍对局部磁场放大，实现高效捕获分离，利用吸液装置或移液枪将上述共孵育混合物，以上-下来回吸取方式，将靶标复合物(磁珠抗体-外泌体-吖啶脂抗体)高效捕获于多孔泡沫镍表面。多孔泡沫镍一方面能实现局部磁场放大，另外一方面也能增加混合效果，增加碰撞几率。

(3)洗脱：加入清洗液清洗，去除非特异性靶标。利用吸液装置或移液枪将清洗液，以上-下来回吸取方式，实现有效清洗目的。

(4)释放检测：撤掉外加磁场，洗脱靶标复合物，检测得到的靶标复合物。利用预激发液过氧化氢，以上-下来回吸取方式，高效的释放靶标复合物。之后加入激发液氢氧化钠进行检测，此发光体系属于瞬态发光型，采用光电倍增管pmt进行信号检测。利用化学发光检测仪器检测发光亮度，计算出样品中外泌体pd-l1外泌体浓度。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。