HMGB1基因或蛋白表达在评估芪归银治疗肺炎效果中的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地，涉及hmgb1基因表达水平或hmgb1蛋白水平或hmgb1蛋白受体基因表达水平，以及tnf-α和il-1β水平在评估芪归银治疗对象肺炎效果中的用途。

背景技术：

耐药菌的防治是目前国际医学界的难题。据中医理论《素问遗篇·刺法论》之“正气存内，邪不可干”分析，耐药菌所致肺炎核心病机是正气不足、邪毒内伏。耐药菌作为风热之邪，侵袭人体，首先犯肺，导致肺失宣发、肃降而成为风温肺热病。

芪归银以扶正透邪为治法，完全契合病机，临床疗效肯定；且据其治法分析，可能通过调节机体免疫网络，从而实现疗效。

然而，由于芪归银治疗肺炎的机制尚不明确，使得其治疗效果难以实时评估。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，发明人通过检测经芪归银治疗的对象肺组织中hmgb1的蛋白表达，血清中il-1β和tnf-α的水平，并进一步检测肺组织中hmgb1及其受体rage、tlr4的基因表达，出乎意料地发现，芪归银能够一定程度降低hmgb1及其受体蛋白和基因表达，并可降低血清中il-1β和tnf-α的水平，从而完成本发明。

发明的目的是为评估芪归银治疗肺炎效果提供一种可能。为此，本发明的提供hmgb1基因表达水平或hmgb1蛋白水平或hmgb1蛋白受体基因表达水平，以及tnf-α和il-1β水平在评估芪归银治疗对象肺炎效果中的用途。

高迁移率族蛋白b1(hmgb1)是一种高度保守的核蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞，是典型的炎性反应晚期调节因子。

tnf-α和il-1β是信号转导通路效应分子。il-1β是主要的早期促炎细胞因子，为体内调节免疫炎性反应的中心递质，在炎症反应前期发挥核心调节作用；tnf-α可调节机体各类免疫应答，参与多种疾病的发生发展过程。

在本发明的一些具体实施方案中，所述受体选自rage、tlr4中的至少一种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述hmgb1基因表达水平、rage基因表达水平和tlr4基因表达水平利用pcr方法获得的。具体地，利用特异性引物分别扩增hmgb1基因、rage基因或tlr4基因，从而获得其表达水平。

在本发明的一个具体实施方案中，扩增hmgb1基因的引物包括具有seqidno.1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.2所示核苷酸序列的下游引物；扩增rage基因的引物包括具有seqidno.3所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.4所示核苷酸序列的下游引物；tlr4基因的引物包括具有seqidno.5所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.6所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述hmgb1蛋白水平是利用抗体检测方法获得的。

在本发明的另一些具体实施方案中，所述tnf-α和il-1β水平是利用抗体检测方法获得的。

在本发明的一些实施方案中，所述基因的表达水平是相对于内参基因的表达水平的相对表达水平。

在本发明的一些具体实施方案中，所述内参基因为gapdh。

在本发明的一些具体实施方案中，所述内参基因的表达水平利用pcr方法获得的。

在本发明的一个具体实施方案中，用于扩增内参基因的引物包括具有seqidno.7所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.8所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的实施方案中，所述肺炎是由铜绿假单胞菌引起的。

在本发明的实施方案中，所述对象包括人。

本发明的有益效果

本发明的技术方案为芪归银治疗肺炎的效果提供一个全面的评估方案。利用本发明提供的用途可以随时监测治疗效果，以便及时调整治疗方案，为肺炎治疗提供更多可能。

附图说明

图1示出了各组大鼠干预5天时肺组织hmgb1表达结果，c：空白组；m：模型组；e：芪归银实验组；a：阿莫西林西药组。

图2示出了各组大鼠干预5天时血清il-1β浓度结果，c：空白组；m：模型组；e：芪归银实验组；a：阿莫西林西药组。

图3示出了各组大鼠干预5天时血清tnf-α浓度结果，c：空白组；m：模型组；e：芪归银实验组；a：阿莫西林西药组。

图4示出了各组大鼠干预5天时hmgb1及其受体rage和tlr4的表达，c：空白组；m：模型组；e：芪归银实验组；a：阿莫西林西药组。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例

1材料与方法

1.1实验药物、菌种、动物及试剂

1.1.1芪归银和阿莫西林

芪归银由北京中医药大学中药学院标准中试生产并提供；阿莫西林颗粒购自深圳致君制药有限公司。

1.1.2铜绿假单胞菌耐药株

编号pa-r003，储存于首都医科大学附属北京中医医院的中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室。此菌由北京中医药大学东直门医院、首都医科大学附属北京朝阳医院和首都医科大学附属北京中医医院三家医院互证鉴定。进行实验时，常规复苏培养获取新鲜菌液，备用。

1.1.3实验动物及分组

sd雄性大鼠，6-8周龄，160±10g，16只(北京维通利华实验动物技术有限公司)；饲养条件是恒温20±4℃，光照及黑暗12小时交替，自由进食并饮水。随机分为对照组(control，c)、模型组(model，m)、实验芪归银组(experiment，e)和阿莫西林西药组(acxoicillin，a)，每组4只；实施干预前各组均适应饲喂3天，造模干预当天设为0天，各组分笼饲养，每笼4只。

1.1.4试剂

tnf-α和il-1β的elisa试剂盒购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；引物合成由invitrogen完成；定量pcr系列试剂均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2药物干预及样本检测

1.2.1药物干预

各组大鼠分别于干预第1天开始给药。e组给药量为2ml；a组根据临床成人标准(70kg)使用剂量转换至相同体积；c组和m组则以同等体积的双蒸水灌胃。各组均每天灌胃一次。

1.2.2样本获取

各组分别于干预10天时获取如下样本。

(1)腹主动脉取血

常规腹主动脉取血，5000rpm，离心10min，收获血清，备测。

(2)肺组织

无菌分离各组大鼠全肺组织，均取右前叶备测免疫组化，右后叶用于基因检测。

1.2.3免疫检测

(1)免疫组化检测：将各组右前叶肺组织，以hmgb1一抗和羊抗鼠的种属二抗进行常规免疫组化染色，每例样本随机统计6个视野，进行比较分析。

(2)elisa检测：严格按照elisa试剂盒说明书操作，检测血清中tnf-α和il-1β的od450吸光度值，根据各自标准品的浓度-吸光度值曲线折算出实际浓度。

(3)rt-pcr检测：设计并合成hmgb1及其受体rage、tlr4和内参基因gapdh的引物，目的片段依次长262bp，188bp，181bp和138bp。序列如下：

hmgb1上游：aagaagtgctcagagaggtggaag(seqidno.1)

hmgb1下游：ctagtttcttcgcaacatcacca(seqidno.2)

rage上游：cgggactcttcacgcttcg(seqidno.3)

rage下游：accttcaggctcaaccaacag(seqidno.4)

tlr4上游：aagactatcatcagtgtatcggtgg(seqidno.5)

tlr4下游：cgtttctcacccagtcctcatt(seqidno.6)

gapdh上游：tggagtctactggcgtctt(seqidno.7)

gapdh下游：tgtcatatttctcgtggttca(seqidno.8)

抽提各组右后叶肺组织总rna，分别进行常规qpcr检测，按如下公式，用2^-δδct法进行目的分子表达的相对定量分析。

1.3统计分析

以spss19.0进行统计处理，各组数据于分析前进行方差齐性检验，正态分布以均数±标准差(mean±sd)表示，非正态分布则以中位数表示。各组比较以单因素方差分析进行，p＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1肺组织中hmgb1表达结果

在药物或模拟干预5天(模型组死亡1只)时，观察结果为hmgb1表达增多；经芪归银或阿莫西林治疗，均有一定程度地恢复，有待以定量检测方法进一步证实。

2.2血清tnf-α和il-1β表达结果

如图2、3所示，模型组il-1β和tnf-α表达较对照组均明显升高，经芪归银或阿莫西林干预均明显下降。其中，对tnf-α的表达影响，芪归银较阿莫西林更显著。

2.3肺组织hmgb1和rage及tlr4基因表达结果

如图4示，模型组hmgb1及其受体rage和tlr4基因表达较对照组均明显升高，经芪归银或阿莫西林干预均明显下降，阿莫西林更为显著。

上述结果说明，经芪归银治疗后，小鼠肺组织内hmgb1及其受体rage和tlr4基因表达均明显下降，且血清中tnf-α和il-1β表达水平也明显下降。这也表明，通过测定经芪归银治疗的肺炎对象肺组织中的hmgb1及其受体rage和tlr4基因表达，和/或测定血清中tnf-α和il-1β的水平，可以有效评估芪归银或其他药物如阿莫西林治疗肺炎的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>首都医科大学附属北京中医医院

<120>hmgb1基因或蛋白表达在评估芪归银治疗肺炎效果中的用途

<130>xy-2019-1-w-005

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aagaagtgctcagagaggtggaag24

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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