一种用于现场诊断的酶联免疫吸附检测装置及方法与流程

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种用于现场诊断(point-of-caretesting，poct)的酶联免疫吸附检测装置及方法，基于酶联免疫放大反应，可定量检测多种生物标志物浓度，其结果裸眼可视，无需任何设备辅助读数，可广泛用于各种样品中生物大分子或化学小分子等生化指标的浓度测定。

背景技术：

酶联免疫吸附试验(elisa)是一种常用于生物标志物检测的方法，传统elisa原理是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，然后基于抗原抗体的特异性识别效应将具有催化效应的酶引入，使其催化底物变色，而生物标志物的浓度大小则与最终产物的颜色深浅直接相关，一般采用光学仪器对颜色的深浅进行读数，得到定量检测结果。elisa的操作一般涉及到铺板(将捕获抗体铺在底板上，比如96孔板)、封闭(将底板上未被抗体覆盖的地方用其他蛋白，比如牛血清白蛋白封闭住，以防止非特异性吸附)、加样孵育(将含有待测抗原的样本加入到孔板中让其与抗体反应)、冲洗(样本中的抗原与抗体结合，但其他的分子，如杂蛋白等不会被结合，从而被冲洗缓冲液冲走，一般冲洗三次)、加入检测抗体(催化底物的酶一般与检测抗体共价连接)，再次冲洗(将未与底板上的待测抗原结合的检测抗体冲走，一般冲洗三次)，加入底物显色，终止反应，采用光学仪器读数。基于传统方法的elisa反应整个过程达十步之多，操作繁琐，耗时长，易于引起系统误差，且样本消耗较大。

point-of-caretesting(poct，现场诊断或称为即时诊断)装置，具有成本低、设备简单、操作方便、随时随地即可得到检测结果的优势，近几年来在医学检测领域大受青睐。目前的poct装置主要基于电化学反应、化学发光、荧光等将待测生物标志物的浓度转化成仪器设备可读的信号；虽然灵敏度高，但仍然需要外界设备的辅助进行读数和分析。试纸条(比如验孕试纸)是一类无需任何设备即可进行生物分子检测的poct工具，但是这类工具只能对生物标志物进行定性检测，不能给出定量的结果，适应场合非常有限。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于现场诊断的酶联免疫吸附检测装置及方法，可同时、快速地测定多个样品，克服了现有poct装置仍需基于外界仪器设备才可对生物标志物浓度进行定量测定的局限，检测结果即时可见。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种用于现场诊断的酶联免疫吸附检测装置，包括底板、与底板转动连接的盖板，所述底板沿其横向设有多个第一反应孔，第一反应孔表面结合有捕获抗体、过氧化氢酶或铂纳米粒子标记的检测抗体，沿底板的纵向设有刻度线；盖板上设有多个第二反应孔，盖板和底板贴合时第一反应孔与第二反应孔是重叠的，第二反应孔通过气体通道与指示剂孔连通，指示剂孔通过读数通道与出液口连通，所述的第二反应孔存储过氧化尿素和柠檬酸钠，指示剂孔含有指示剂粉末。

所述的底板或盖板的材质包括但不限于：聚二甲基硅氧烷、玻璃、有机玻璃、聚苯乙烯和聚碳酸酯。

所述的指示剂包括但不限于：带颜色的染料或色素，或者遇水可产生颜色的化学物质如硫酸铜等。

进一步地，底板和盖板间设有密封层，所述的密封层在与第二反应孔、气体通道、指示剂存储孔、读数通道相对应的位置处设有开口。

进一步地，第二反应孔与气体通道的连接处、指示剂孔与气体通道及读数通道的连接处分别进行疏水处理。

上述装置用于酶联免疫吸附检测的方法，包括以下步骤：

1)在底板的第一反应孔中加入待测样本和已知浓度的标准品，待测样本和标准样品与检测抗体、捕获抗体形成夹心式结构，用含bsa的缓冲液冲洗后再在第一反应孔中加入缓冲液；

2)在盖板的第二反应孔和指示剂孔中分别加入缓冲液，第二反应孔中的过氧化尿素和柠檬酸钠反应生成过氧化氢，将底板和盖板贴合后，过氧化氢与第一反应孔中检测抗体上标记的过氧化氢酶或铂纳米粒子反应生成氧气，在氧气的推动下指示剂溶液进入读数通道形成指示条带；

3)根据标准品的浓度及其产生的指示条带的长度制作标准曲线，再根据标准曲线计算待测样本的浓度值。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

1.抗体装载的方法。我们提出将捕获抗体和检测抗体同时预装载于第一反应孔中；捕获抗体共价连接于基底，而检测抗体仅是物理性地干燥于孔内，因此样本加入后，捕获抗体仍会稳定地结合在反应孔中，而检测抗体会溶解于溶液中，且捕获抗体、抗原和检测抗体会形成固定于基底的夹心式的三元复合物。这种抗体修饰的方法可以有效减少抗原抗体间的反应时间，减少操作步骤，因此可以有效缩短检测时间。

2.反应试剂预装载方法。本装置利用铂纳米粒子或过氧化氢酶催化过氧化氢释放出氧气，再通过氧气推动指示剂形成裸眼可视的颜色条带，从而在不需仪器的辅助下实现生物标志物定量检测。这个反应中利用到的过氧化氢，平时一般是溶液态，具较强的腐蚀性，且不稳定，见光遇热易分解；此处我们将过氧化尿素和柠檬酸钠的粉末预装载于第二反应孔，从而避免了直接使用过氧化氢溶液，提高了试剂的稳定性和装置的安全性，同时更方便存储和运输。

3.折叠式芯片设计及裸眼读数策略。本装置利用折叠式的操作方式，只需将盖板翻转180度即可让反应物开始反应，反应将生物标志物的浓度转化为肉眼可识别的指示剂的长度，因此不需任何仪器辅助即可得到定量读数，操作非常方便，整个检测过程只需10分钟。

该装置有望广泛用于医学、环境监测、食品安全等领域中各种生化指标的测定。

附图说明

图1：用于现场诊断的酶联免疫吸附检测装置的整体结构示意图。

图2：底板和盖板的结构示意图。

图3：实施例3所述的检测装置。盖板采用pdms(刻有读数标尺)，底板采用载玻片(黑点指示第一反应孔)，中间用胶带连接，翻转盖板可让盖板与底板重叠。

图4：cea检测。(a)实施例3所述装置用于检测cea，从左到右的反应孔中依次装载了待测cea样本和20、50、85和100ng/ml的cea标准品溶液。(b)本发明所述装置检测cea的标准曲线和待测样品对应的浓度。(c)试剂盒检测cea的标准曲线和待测样品对应的浓度。

1-盖板，2-底板，3-密封层，4-连接件，5-刻度线，6-第一反应孔，7-出液口，8-第二反应孔，9-指示剂孔，10-气体通道，11-读数通道。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

如图1及2所示，一种用于现场诊断的酶联免疫吸附检测装置，包括底板2、盖板1及密封层3，底板2通过连接件4与盖板连接，两者可相对合拢或打开。底板2沿其横向设有多个第一反应孔6，沿底板的纵向设有刻度线5；盖板1上设有多个第二反应孔8，盖板和底板贴合时第一反应孔6与第二反应孔8是重叠的，第二反应孔8通过气体通道10与指示剂孔9连通，指示剂孔9通过读数通道11与出液口7连通；气体通道10短于读数通道11；密封层3设于底板和盖板之间，密封层一面贴于盖板上，另一面有一层保护膜(使用前隔离盖板和底板)，但在与第一反应孔、气体通道、指示剂孔、读数通道相对应的位置处设有开口(不会遮挡盖板上的开孔和通道)，在盖板与底板重叠时起密封作用。所述的第一反应孔表面结合有捕获抗体、过氧化氢酶或铂纳米粒子标记的检测抗体，第二反应孔存储过氧化尿素和柠檬酸钠，指示剂孔含有指示剂粉末。

在检测过程中，为了避免加入的缓冲液可能会在没有气体推动的情况下进入到气体通道或读数通道内，在第二反应孔与显色通道的连接处、指示剂孔与气体通道及读数通道的连接处分别进行疏水处理。

实施例2

以针对癌胚抗原(cea)检测为例说明该装置的具体制作方法：

1.结构制作：先通过作图软件如autocad进行盖板和底板上的结构设计，其后通过激光切割机的控制软件读取所设计的文件，切割出两片大小相等的矩形pmma板(尺寸为76mm×25mm×1mm)，一片用作盖板，一片用作底板，然后将两基片上的结构通过激光进行刻蚀，即可形成图2所示的结构(第一、第二反应孔的直径为5mm，深度为0.5mm；气体通道的宽度和长度分别为1mm和10mm；读数通道的宽度和长度分别为1mm和50mm；出液口的直径为5mm)；其后通过激光将双面胶切割出与盖板同样大小的矩形以及与盖板上相同的结构，然后将双面胶一面的保护膜移除(保留另一面的保护膜)，将双面胶与盖板对准并贴于盖板上，确保不会遮挡盖板上的反应孔和通道。第二反应孔与显色通道的连接处、指示剂孔与读数通道的连接处分别疏水试剂处理(将少量aquapel涂抹于连接处，干燥后连接区域即变成疏水截面)，可以避免后期在孔内加入缓冲液时溶液进入到通道内。其后，再采用胶带、转动轴或活页等方式将盖板和底板连接起来，翻转180度即可让盖板和底板重叠，底板上的第一反应孔和盖板上的第二反应孔重叠，底板上的读数标尺位于盖板读数通道的两侧。

2.试剂预装载及装置连接：在底板的第一反应孔中先进行化学修饰，引入环氧基或醛基，然后加入cea的捕获抗体(鼠源的单克隆抗体)进行孵育，后加入5％bsa(w/v)进行空白位置的封闭，移除溶液后，加入连有探针的cea的检测抗体(连有铂纳米粒子的兔源多克隆抗体；铂纳米粒子可以直接购买商业化产品或用户自己合成，其大小在5-100nm间均可，可根据需要进行选择，一般来说纳米粒子尺寸越大催化效率越高；通过将过量的铂纳米粒子和抗体混合孵育2小时以上即可让二者形成共价连接，最后加入5％bsa对铂纳米粒子表面的空白位点进行封闭)，最后将底板置入冷冻干燥器中使捕获抗体、bsa以及检测抗体冻干于第一反应孔中，然后贴上一层保护膜用于密封第一反应孔。盖板上的第二反应孔中直接加入一定量的反应物粉末(含0.2mg过氧化尿素和2mg柠檬酸钠)，指示剂孔中加入一定量的色素粉末(1mg红色色素)，使其吸附于孔内，然后在第二反应孔和指示剂孔分别贴上保护膜用以密封试剂。

3.装置封装：试剂装载及装置连接完成后，将盖板和底板重叠(中间双面胶密封层还保留有一层保护膜，因此不会让盖板和底板粘起来)，即可将装置真空封装于包装袋中，使用时再打开包装。

用于检测癌胚抗原(cea)的方法具体如下：

1.加样至底板

将装置从密封的真空袋中取出，展开，平放，让底板和盖板的反应孔朝上，移除保护膜，用移液器往第一反应孔内加入5μl已知浓度的一系列cea标准样品和待测cea样本。

2.elisa反应

由于捕获抗体是共价连接在反应槽表面，而检测抗体只是物理性的干燥在反应槽中，加入标准品和待测样本后，连接有铂纳米粒子的检测抗体会溶解到溶液中，捕获抗体仍然连接在基底上，cea会与溶液中的检测抗体和固定于底板的捕获抗体反应，反应5分钟后，在第一反应孔表面形成捕获抗体-cea-检测抗体的夹心式结构，用移液器取出反应孔中的反应液，用含5％bsa的磷酸缓冲液(ph7.4)冲洗后再在反应槽中加入5μl磷酸缓冲液。

3.试剂装载至盖板

移除第二反应孔和指示剂孔表面的保护膜，在第二反应孔内各加入5μl磷酸缓冲液，预装载的过氧化尿素和柠檬酸钠在加入缓冲液后即可产生过氧化氢；指示剂孔内预转载的红色色素粉末在加入缓冲液后可溶解成色素溶液。由于第二反应孔与气体通道的连接处、指示剂孔与气体通道及读数通道的连接处都修饰了疏水物质，孔内的溶液在没有气体推动的情况下不会进入到气体通道和读数通道内。

4.折叠并读数

移除中间密封层上剩下的一层保护膜，将盖板翻转，与底板重叠，盖板第二反应孔和底板的第一反应孔重叠，底板的读数标尺位于盖板上读数通道的两侧，中间密封层(双面胶带)将底板与盖板密封。盖板翻转时，由于表面张力的存在，孔中的液体不会立即流出。盖板上第二反应孔内的过氧化氢与底板上固定于第一反应孔的铂纳米粒子反应；纳米粒子催化过氧化氢生成氧气，氧气经气体通道推动指示剂进入读数通道即可形成人眼可识别的指示条带，反应5分钟后即可读数。具有不同浓度的标准品可得到不同长度的指示条带，因此可制得cea浓度与指示条带长度的标准曲线，根据标准曲线和待测样本的读数即可获得待测样品中cea的浓度。该检测过程不需任何检测仪器的辅助即可完成。

实例3

下面给出另一个针对癌胚抗原(cea)检测实例的加工和操作方法，装置基于光刻技术加工，具体为：

先通过作图软件如autocad进行盖板的结构设计，再利用su8经光刻步骤制得阳模，其后使用pdms复制出阳模上的结构，经切割和打孔即可得到图3中的盖板，包括第二反应孔、指示剂孔、气体通道、读数通道和读数标尺。底板使用的是玻璃，在其表面用疏水试剂aquapel形成了5个小区域(图3中用黑色圆点指示)以代替反应槽，将捕获抗体和检测抗体修饰在这5个小区域。由于pdms可以很好地贴附于玻璃片上，此处中间密封层可以省去。盖板和底板间用透明胶带连接，只需翻转盖板180度即可和底板重叠，盖板上的第二反应孔和底板上的第一反应孔重叠。经过抗体修饰和试剂装载，即可进行cea的测试。

如图4所示，将1个待测的cea样本和已知浓度的四个cea标准品(20、50、85和100ng/ml)从左至右依次加入到第一反应孔中。最后在装置中形成了5条长度不等的条带，根据标准品的浓度及装置上得到的指示剂条带的长度制作标准曲线(图4b)，我们得知待测样品中cea的浓度为42ng/ml。同时，我们也采用了商业化的cea酶联免疫试剂盒对待测样品进行了测试，得到其cea浓度为42.5ng/ml，与本发明装置所得检测结果非常接近。此实例证明我们的装置对生物标志物浓度的检测准确度非常高。

该装置基于酶联免疫吸附试验对生物标志物浓度进行测定，不仅适用于cea，也适用于其他各种疾病的生物标志物检测，如癌症(甲胎蛋白，afp；前列腺特性抗原；psa；鳞状细胞癌相关抗原，scc；细胞角质蛋白21-1片段，cyfra21-1等)、心脏病(心肌肌钙蛋白，ctn；肌酸激酶同工酶，ck-mb；b型钠尿，bnp等)，hiv(p24等)。