一种青风藤渗漉过程终点判断方法与流程

本发明属于中药生产过程过程分析技术领域，具体涉及一种基于紫外光谱技术的青风藤渗漉过程终点判断的方法。

背景技术：

青风藤是防己科植物青藤sinomeniumacutum(thunb.)rehd.etwils.和毛青藤sinomeniumacutum(thunb.)rehd.etwils.var.cinereumrehd.etwils.的干燥藤茎，具有祛风湿，通经络，利小便等功效，主治风湿及类风湿性关节炎、关节肿大、肢体疼痛、麻木等症。中医药学应用青风藤及或其复方内服或外用治疗风湿性疾病已有一千多年的历史。

青风藤主要含生物碱类成分，包括青藤碱、双青藤碱、木兰碱、尖防己碱等。其中青藤碱是青风藤中的主要药效成分，具有镇静镇痛、抗炎和抗心律失常等药理作用，临床上可用于治疗类风湿性关节炎、骨质增生和心率失常。

工业生产中采用稀盐酸渗漉的方法提取青风藤中的青藤碱，且规定当渗漉液中盐酸青藤碱含量低于某一浓度时，渗漉到达终点。常用的终点判断方法有固定时间法和离线分析法。固定时间法即固定渗漉时间，但由于药材批次之间的质量差异以及操作过程的波动，会导致渗漉停止时渗漉液中盐酸青藤碱的浓度与规定值有较大差异，影响药品的质量或造成能源、物料的浪费。离线分析法要求再渗漉过程中进行大量采样，并进行液相分析，确定渗漉液中盐酸青藤碱的浓度，该方法需要消耗大量人力物力，且检测结果存在滞后性，无法实时进行终点判断。因此，选择一种合适的过程分析技术(pat)，对青风藤渗漉过程的终点判断是十分必要的。

紫外光谱法是一种常用的pat工具，具有谱图简单、检出限低，不受水和空气影响等优点，可用于中药质量分析。该方法无需或仅需简单的样本预处理，不消耗化学试剂，操作简单快速，结合化学计量学方法可以应用于青风藤渗漉过程的终点判断。目前尚未有利用紫外光谱技术对青风藤渗漉过程进行终点判断的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于紫外光谱技术的青风藤渗漉过程的终点判断方法，本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种青风藤渗漉过程终点判断方法，包括以下步骤：

(1)光谱信息的采集：渗漉罐中流出的样本经管道流入流通池，紫外光谱仪通过光纤实时在线采集流通池中样本的信息，并记录时间信息；

(2)样本的收集：收集不同批次的青风藤渗漉过程中不同时刻获取的渗漉液；

(3)样本中盐酸青藤碱含量的测定：采用高相液相色谱仪测定盐酸青藤碱的含量；

(4)样本的剔除和划分：剔除盐酸青藤碱浓度过高的样本，将剩下的样本划分为校正集和验证集；

(5)校正模型的建立：选择合适的数据预处理方法和建模波段，利用多变量数据分析方法建立样本紫外光谱与盐酸青藤碱浓度之间的定量校正模型。

(6)模型的应用：依据步骤(1)实时在线采集的紫外光谱，根据步骤(5)得到的校正模型，实时输出渗漉液中盐酸青藤碱的浓度。当浓度低于规定值后，可认为渗漉到达终点。

步骤(1)中，紫外光谱采集以水作为参比。波长范围为173nm-414nm，共2048个扫描波长点，扫描次数为20次。

步骤(2)中，在渗漉初期，盐酸青藤碱浓度较高，而且在较长时间内浓度可能变化不大，在线光谱可能保持较高的吸光度，因此在该时间段内，采样的频率可以适当较低，从而减少取样操作和色谱分析的时间、物料成本；当在线光谱吸光度变化较剧烈时，增大采样频率，从而获得更多变化中的样本，使得样本中盐酸青藤碱含量的分布更加均匀；当渗漉进行一段时间接近终点时，渗漉液中盐酸青藤碱含量趋于稳定，反映在光谱中为光谱强度变化较小，此时也可以适当降低采样频率。

步骤(3)中，采用高效液相色谱与紫外检测器联用法(hplc-uv法)，测定样本中盐酸青藤碱的含量。

步骤(4)中，由于紫外光谱仪分辨率高、检出限低，因此适用于低浓度样本的检测，尤其适用于渗漉过程的终点判断。但在渗漉初期，渗漉液的浓度往往较高，因此可能会出现紫外光谱信号饱和的情况，此时需要根据实际情况剔除高浓度样本，否则将影响后续的光谱校正模型性能。

剔除样本后，需将样本划分为校正集和验证集。常用的样本划分方法包括随机抽样法(randomsampling，rs)、kennard-stone法和spxy法等。除了上述方法外，也可将部分批次的样本作为校正集，剩下的批次的样本作为验证集。校正集用于建立光谱定量模型，验证集用于对光谱的预测性能进行评价。

步骤(5)中，所述的数据预处理方法包括无预处理、标准正则变换(snv)、多元散射校正(msc)、导数、平滑及其组合等。选择合适的预处理方法可以提高模型性能，使得模型更加准确和稳健。优选的，本发明采用一阶导数的方法作为数据预处理方法。

建模波段的选择也会影响模型的性能。优选的，本发明选择173-414nm全波段进行建模，即将所有的波长点都纳入模型中，可使光谱信息得到充分利用，避免了信息丢失。

步骤(5)中，优选的，所述多变量数据分析方法为偏最小二乘回归(pls)。通过交叉验证法确定最佳的因子数。

步骤(5)也包括对光谱校正模型的拟合能力和对未知样本的预测能力进行评价；评价指标包括选择的因子数、决定系数r²、校正集估计误差均方根(rmsee)、交叉验证误差均方根(rmsecv)和预测误差均方根(rmsep)。

步骤(6)中，通过步骤(5)得到的光谱模型，在新的渗漉过程中，将实时在线得到的样本光谱作为输入值，得到的输出值为对应时间的渗漉液中盐酸青藤碱的浓度。通过该方法可实时获取青风藤渗漉过程中的质控指标信息，实现实时终点判断，并可加深对渗漉过程的理解。

步骤(5)的模型在应用一段时间后，应对样本集加以补充，扩充模型的适用范围，对模型进行不断更新与完善，操作步骤同前。

本发明通过流通池和光纤实时在线采集青风藤渗漉过程中的紫外光谱信息，收集不同批次的渗漉过程中的样本组成样本集，经hplc-uv检测样本中盐酸青藤碱浓度后，采用多变量数据分析方法建立起光谱信息与盐酸青藤碱浓度的定量校正模型。利用该模型可以实时预测渗漉过程中的盐酸青藤碱浓度，当浓度低于规定值后，认为渗漉过程到达终点。

与传统方法相比，本发明具备以下益效果：无需取样分析即可实现青风藤渗漉过程中盐酸青藤碱浓度的实时测定，提供了及时判断渗漉终点的依据，为深入理解渗漉过程打下基础，有助于渗漉过程的过程监测和可视化，提高生产过程的质量控制水平，节省大量人力物力成本。

附图说明

图1为青风藤渗漉过程中的紫外光谱变化图

图2为276nm处吸光度在不同盐酸青藤碱浓度下的变化图

图3为光谱模型预测值与实际值的相关图

图4为某一批次渗漉过程中盐酸青藤碱实际浓度和预测浓度的变化图

本方法所采用的定量光谱模型可以准确预测渗漉液中盐酸青藤碱浓度，可用于判断渗过程是否达到终点，而且实现了渗漉过程的可视化，有助于监测青风藤的渗漉过程，为质量控制提供基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是示范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1.光谱信息的采集：称取100g青风藤药材，用0.3mol/ml的盐酸溶液浸泡12h后开始渗漉，通过蠕动泵控制渗漉出液速度为4ml/min，控制加液(渗漉溶剂为0.3mol/l盐酸溶液)速度为4ml/min，渗漉过程持续约8～12h，共进行5次渗漉实验。光谱扫描的参数为积分时间1500ms，每张光谱扫描20次后取平均值，光谱轮询时间为60s。

2.样本的收集：在渗漉开始时，盐酸青藤碱浓度较高，此时紫外光谱的最大吸光度在1.0左右，且在3h内保持较高的水平，因此在渗漉开始1h后才进行采样，每隔20min采样一次；当渗漉进行到4h-6h左右时，渗漉液的光谱强度下降较快，表明此时渗漉液中成分含量变化较大，因此在此过程中提高采样频率为每隔10min采样一次；当渗漉进行至6h后，渗漉液中盐酸青藤碱浓度较低，反映在光谱上为光谱吸光度保持在较低的水平，因此在此阶段，每隔20min采样一次。渗漉过程中光谱的变化如图1所示。5个批次共获得156个样本。

3.样本中盐酸青藤碱含量的测定：采用hplc-uv法测定样本中盐酸青藤碱的浓度，具体测定方法如下：

(1)色谱分析条件：采用agilent1260高效液相分析色谱仪进行含量测定，应用diamonsilplusc18色谱柱(250mm×4.6mmi.d.，5μm，dikma公司)，流动相为甲醇-水-乙二胺(50:50:0.25％,v/v)；柱温25℃；检测波长262nm；流速1.0ml/min；进样量10μl。

(2)对照品溶液的制备与测定：精密称取盐酸青藤碱15.87mg于5ml容量瓶中，加入70％甲醇溶液使溶解，定容，得到浓度最高的对照品溶液；精密称取盐酸青藤碱13.22mg于10ml容量瓶中，分别加水稀释2倍、10倍、20倍、100倍，得一系列浓度梯度的对照品溶液。将上述对照品溶液按(1)中条件进行分析，得峰面积对浓度的标准曲线为y＝8300.7x-5.1577，r²＝1.000。

(3)分析样品的制备：渗漉液样本在10000rpm下离心10min后，取上清液按(1)中条件进行分析。

4.样本的剔除和划分：盐酸青藤碱在260nm-280nm之间有较强的紫外吸收，剔除样本中盐酸青藤碱浓度高于1.3mg/ml的样本，样本数由156减少至122。

剔除浓度过高的样本后，将样本划分为校正集和验证集。选取5批中的4批作为校正集(97个样本)，剩下的1批作为验证集(25个样本)。

5.校正模型的建立

采用pls方法建立光谱定量校正模型。

采用simca13.0软件(瑞典umetrics公司)对光谱数据进行预处理和偏最小二乘建模。

6.模型的应用：将光谱模型写入光谱仪中，根据实时在线测量的光谱信息，可得到渗漉过程中盐酸青藤碱的实时浓度，当其浓度低于0.1mg/ml时，可认为渗漉到达终点。

该实施例中，规定当渗漉液中盐酸青藤碱浓度低于0.1mg/ml，即认为渗漉达到终点。

本发明实施例中，若样本中盐酸青藤碱浓度过高，可能导致紫外光谱信号饱和，如果将这些浓度过高的样本纳入校正集中，可能会导致模型性能急剧下降，因此在建立光谱定量校正模型前，需剔除高浓度的样本。该实施例中，紫外光谱276nm处具有最大紫外吸收，故以276nm处的吸光度作为指标考察其与浓度的关系。结果如图2所示，随着盐酸青藤碱浓度的增大，吸光度增强的趋势越来越小，且当浓度高于1.5mg/ml时，吸光度几乎不再随着浓度增大而增强。因此经过考察，剔除了样本中盐酸青藤碱浓度高于1.3mg/ml的样本，样本数由156减少至122。剔除浓度过高的样本后，将样本划分为校正集和验证集。选取5批中的4批作为校正集(97个样本)，剩下的1批作为验证集(25个样本)。

实施例2

1.光谱信息的采集：称取100g青风藤药材，用0.3mol/ml的盐酸溶液浸泡12h后开始渗漉，通过蠕动泵控制渗漉出液速度为4ml/min，控制加液(渗漉溶剂为0.3mol/l盐酸溶液)速度为4ml/min，渗漉过程持续约8～12h，共进行5次渗漉实验。光谱扫描的参数为积分时间1500ms，每张光谱扫描20次后取平均值，光谱轮询时间为60s；

2.样本的收集：在渗漉开始时，在渗漉开始1h后进行采样，每隔20min采样一次；当渗漉进行到4h-6h时，提高采样频率为每隔10min采样一次；当渗漉进行至6h后，每隔20min采样一次；

3.样本中盐酸青藤碱含量的测定：采用hplc-uv法测定样本中盐酸青藤碱的浓度，具体测定方法如下：

(1)色谱分析条件：采用agilent1260高效液相分析色谱仪进行含量测定，应用diamonsilplusc18色谱柱，流动相为甲醇-水-乙二胺(50:50:0.25％,v/v)；柱温25℃；检测波长262nm；流速1.0ml/min；进样量10μl；

(2)对照品溶液的制备与测定：精密称取盐酸青藤碱15.87mg于5ml容量瓶中，加入70％甲醇溶液使溶解，定容，得到浓度最高的对照品溶液；精密称取盐酸青藤碱13.22mg于10ml容量瓶中，分别加水稀释2倍、10倍、20倍、100倍，得一系列浓度梯度的对照品溶液。将上述对照品溶液按(1)中条件进行分析，得峰面积对浓度的标准曲线为y＝8300.7x-5.1577，r²＝1.000；

(3)分析样品的制备：渗漉液样本在10000rpm下离心10min后，取上清液按(1)中条件进行分析；

4.样本的剔除和划分：盐酸青藤碱在260nm-280nm之间有较强的紫外吸收，剔除样本中盐酸青藤碱浓度高于1.3mg/ml的样本；

剔除浓度过高的样本后，将样本划分为校正集和验证集；；

5.校正模型的建立

采用pls方法建立光谱定量校正模型；采用simca13.0软件对光谱数据进行预处理和偏最小二乘建模；

6.模型的应用：将光谱模型写入光谱仪中，根据实时在线测量的光谱信息，得到渗漉过程中盐酸青藤碱的实时浓度；当渗漉液中盐酸青藤碱浓度低于0.1mg/ml，即认为渗漉达到终点。

本发明实施例中，为去除光谱的噪声，提高模型性能，预处理方法的选择是十分重要的。常用的预处理方法包括标准正则变换(snv)、多元散射校正(msc)、1阶导数、savitkzy-golay平滑等。snv可以消除测量光程的变化对光谱响应产生的影响，1阶导数可以解决光谱漂移的问题，平滑可以去除光谱中的随机噪声。值得注意的是，导数处理会增加噪声的干扰，可利用savitzky-golay导数(sg导数)法解决该问题。sg导数法的原理是在求导之前先对光谱进行平滑处理。上述中1阶导数也由sg导数方法得到。本发明实施例比较了无预处理、snv和1阶导数处理对模型性能的影响。光谱数据经预处理后，经光谱校正方法建立起与样本浓度之间的数学关系。常用的光谱定量模型校正方法有偏最小二乘法回归(pls)、主成分回归(pcr)、支持向量回归(svr)和人工神经网络(ann)等，其中pls和pcr属于线性建模方法，相比svr和ann等非线性建模方法更加简单易用，计算复杂度也更低；pcr只利用了光谱的信息(x)，没有利用有样本浓度的信息(y)，而pls则解决了这一问题，模型的因子数以rmsecv为指标进行决定，当rmsecv不再随因子数增加而减小时，就不再增加模型因子数。模型2，即经snv预处理得到的光谱模型具有最大的r2和最小的rmsee、rmsecv、rmsep，但是其选用了12个因子，且其rmsecv是rmsee的5倍左右，存在较大的过拟合可能性；模型1和模型3的指标，r2、msee、rmsecv和rmsep均较为接近，表明两者拟合能力和预测能力相当，然而考虑到模型3只选用了6个因子，较为稳健，因此模型3作为在线监测青风藤渗漉过程较合适。

图3展示了模型预测值与实际值的关系，其中黑色直线为45°线。图中的点均落在该直线附近，说明模型的拟合性能和预测性能均较好，在低浓度处，模型也有较好的性能，可以为渗漉过程的终点判断提供依据。图4是某一批次应用该模型，得到的渗漉过程实际浓度与预测浓度变化图。从图中可以看到，渗漉一开始时，盐酸青藤碱浓度非常高，远超模型所覆盖的浓度范围(0-1.3mg/ml)，因此模型在该区域内不能计算得到准确的浓度值；当渗漉液中浓度到达合适的浓度时，模型的预测值与实际浓度吻合得很好，即模型具有较高的准确性。图4中的水平虚线为浓度等于0.1mg/ml，当浓度值低于该水平线时，表示渗漉达到终点。

表1不同光谱预处理方法所得的盐酸青藤碱浓度模型结果比较